锌原卟啉在制备增强人结直肠癌细胞对5-氟尿嘧啶化疗敏感性药物中的应用的制作方法

本发明涉及锌原卟啉在制备增强人结直肠癌细胞对5-氟尿嘧啶化疗敏感性药物中的应用，属于化疗药物技术领域。

背景技术：

结直肠癌是常见的消化道肿瘤之一，据世界卫生组织国际癌症研究中心(internationalagencyforresearchoncancer，iarc)资料显示，2012年全世界约有136万结直肠癌新发病例，居恶性肿瘤第3位，位于肺癌、乳腺癌之后；死亡约69万例，位于肺癌、肝癌和胃癌之后，居恶性肿瘤第4位。我国是结直肠癌的低发区，近年来，随着我国经济的发展、饮食结构和生活方式的改变，结直肠癌的发病率呈上升趋势。据统计截至2016年，我国结直肠癌新发病例数已达33.1万，其中死亡病例为15.9万。

目前治疗主要是手术切除原发部位的肿瘤，术后辅以化疗、放疗、免疫治疗等多种手段对其进行辅助治疗，有效的化疗不仅可杀死残留癌细胞，也可预防癌细胞的进一步扩散和转移。通常的化疗方案是以5-氟尿嘧啶(5-fu)为基础的联合化疗。

技术实现要素：

本发明提供了锌原卟啉在制备增强人结直肠癌细胞对5-氟尿嘧啶化疗敏感性药物中的应用，为新药研发和创新疗法提供基础。采用的技术方案如下：

本发明提供了一种锌原卟啉(zincprotoporphyrin，znpp)在制备增强人结直肠癌细胞对5-氟尿嘧啶化疗敏感性药物中的应用。

本发明以人结直肠癌rko、ht29、hct8细胞系为材料研究了血红素氧合酶-1(hemeoxygenase-1，ho-1)对5-氟尿嘧啶(5-fu)化疗敏感性的影响及其可能的机制，发明人应用了不同浓度锌原卟啉(znpp)、钴原卟啉(copp)单独或联合5-fu作用于人结直肠癌细胞，alaramblue法观察药物对细胞生长抑制作用；定量pcr分析ho-1基因表达变化；流式细胞术检测细胞凋亡率；通过检测caspase-3和活性氧(ros)分析其可能的分子机制。结果显示：各类细胞均有ho-1表达，单用5-fu或5-fu联用copp后均能使其表达增强，但copp对其有诱导作用，5-fu联用znpp可降低ho-1的表达，且可明显抑制人结直肠癌细胞生长，呈剂量依赖性；5-fu联用znpp与单用5-fu相比，明显提高了细胞生长抑制率和凋亡率(p＜0.05)，5-fu联用copp则微弱的降低细胞生长抑制率和凋亡率(p>0.05)；单用5-fu与空白对照组比较，细胞内ros活性明显增高，5-fu联用znpp后可进一步提高细胞内ros活性(p＜0.05)，而联用copp能降低细胞内ros活性水平(p＜0.05)。

综上所述：发明人首次发现znpp能够增强人结直肠癌细胞对5-fu化疗敏感性，这一作用可能与增加细胞内ros活性和细胞内caspase-3活性有关。

本发明为新药研发和创新疗法提供基础，本发明适用于对人结直肠癌病人进行化疗，提高5-氟尿嘧啶的化疗作用。

附图说明

图1为rko细胞各处理组中rt-pcr分析ho-1基因表达情况；

(a，ho-1；b，β-actin；a和b中：m为markerdl2000；1为空白对照组；2为添加dmso组；3为添加5-fu组；4为添加0.5μmolcopp+5-fu组；5为添加1μmolcopp+5-fu组；6为添加5μmolcopp+5-fu组；7为添加10μmolcopp+5-fu组；8为添加0.5μmolznpp+5-fu组；9为添加1μmolznpp+5-fu组；10为添加5μmolznpp+5-fu组；11为添加10μmolznpp+5-fu组)。

图2为hct8细胞各处理组中rt-pcr分析ho-1基因表达情况；

(a，ho-1；b，β-actin；a和b中：m为markerdl2000；1为空白对照组；2为添加dmso组；3为添加5-fu组；4为添加0.5μmolcopp+5-fu组；5为添加1μmolcopp+5-fu组；6为添加5μmolcopp+5-fu组；7为添加10μmolcopp+5-fu组；8为添加0.5μmolznpp+5-fu组；9为添加1μmolznpp+5-fu组；10为添加5μmolznpp+5-fu组；11为添加10μmolznpp+5-fu组)。

图3为ht29细胞各处理组中rt-pcr分析ho-1基因表达情况；

(a，ho-1；b，β-actin；a和b中：m为markerdl2000；1为空白对照组；2为添加dmso组；3为添加5-fu组；4为添加0.5μmolcopp+5-fu组；5为添加1μmolcopp+5-fu组；6为添加5μmolcopp+5-fu组；7为添加0.5μmolznpp+5-fu组；8为添加1μmolznpp+5-fu组；9为添加5μmolznpp+5-fu组；)。

图4为定量pcr法分析rko细胞各处理组ho-1基因相对表达量。

图5为定量pcr法分析hct8细胞各处理组ho-1基因相对表达量。

图6为定量pcr法分析ht29细胞各处理组ho-1基因相对表达量。

图7为alaramblue法检测细胞抑制率。

图8为hct8细胞各处理组流式细胞仪检测细胞凋亡；

(a,1μmolznpp联合200μmol5-fu组；b,5μmolznpp联合200μmol5-fu组；c,10μmolznpp联合200μmol5-fu组；d,1μmolcopp联合200μmol5-fu组；e,5μmolcopp联合200μmol5-fu组；f,10μmolcopp联合200μmol5-fu组；g,空白对照组；h,dmso组；i,200μmol5-fu组。

图9流式检测各处理组细胞凋亡比例。

图10为各处理组对细胞ros活性的影响。

图11为各处理组对hct8细胞caspase-3活性的影响。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明不受实施例的限制。

实施例1：

1材料与方法

1.1材料

1.1.1试剂

rko细胞；ht29细胞；hct8细胞等细胞由实验室保存；rpmi-1640培养基、dmem培养基、双抗、胎牛血清、alaramblue试剂盒购自lifetechnology公司；活性氧、caspase3、细胞凋亡检测试剂盒、bradford蛋白浓度检测试剂盒购自碧云天生物技术有限公司；ho-1和内参照β-actin引物交由上海英骏生物技术有限公司合成；rt-pcr试剂盒购自thermoscientific公司。

1.1.2仪器

高压灭菌器(hve-50，日本hariyama公司)；双人单面净化工作台(sw-cj-2fd，苏州净化设备有限公司)；全功能微孔板检测仪(synergy/h1，美国biotek公司)；co2培养箱(bb150，美国thermo公司)；倒置显微镜(dmi8，德国leica公司)；离心机(5810r，德国eppendorf公司)。

1.2方法

1.2.1细胞复苏、培养

将装有hct8、rko、ht29细胞的冻存管从-80℃冰箱取出，套上薄膜手套，在37℃水浴锅内快速解冻，将解冻好的悬液转移至离心管，1000rpm离心5min，弃上清，将细胞制悬液后转移至含完全培养液的培养皿内，放进co2培养箱内培养。每天观察细胞，若细胞贴壁汇合度至80％，可用胰酶消化传代。

1.2.2药物最适浓度的确定

取一50ml离心管于分析天平上，调零，用药匙取药物(znpp、znpp、5-fu)于离心管内，取出用dmso充分溶解，使浓度均为0.01mol/l，分装到1.5ml离心管，做好标记。用封口膜封好后放置-20℃冰箱保存。根据alaramblue的实验结果，确定5-fu药物浓度为200μmol，copp药物的作用浓度为0.5μmol至10μmol、znpp药物的作用浓度为0.5μmol至10μmol。分别设置dmso组，单独使用200μmol5-fu药物组，200μmol5-fu加入24h后分别加入0.5μmolcopp、1μmolcopp、5μmolcopp、10μmolcopp，znpp组采用200μmol5-fu加入24h后分别加入0.5μmolznpp、1μmolznpp、5μmolznpp、10μmolznpp，处理24h后收集检测各项指标。

1.2.3细胞准备

取生长良好的对数生长期的细胞，用胰酶消化，培养液稀释成浓度为5×10⁴/ml的细胞悬液，按每孔2ml接种到6孔板中，铺完后移至co2培养箱培养。将过夜培养后的贴壁细胞的原培养液洗弃，并加入1ml新完全培养液，除dmso组外加入相对应5-fu体积的dmso外，其余各孔加入终浓度为200μmol的5-fu，使得培养液体积为2ml。培养24h后，弃去培养液，pbs洗涤3次，将1.2.2中各组设置的dmso组、单独使用5-fu药物组、各浓度copp组，各浓度znpp组2ml含药物培养液再次加到孔板中，每个浓度3个平行，培养24h后检测各项指标。

1.2.4定量pcr检测人结直肠癌细胞ho-1mrna表达

参考thermoscientific的反转录说明书，在20μl体系中以1μg总rna为模板，进行cdna的合成。ho-1上游引物5′-cttcaagctggtgatggc-3′(seqidno.1)，下游引物5′-tggagccgcttcacatag-3′(seqidno.2)，产物219bp；β-actin上游引物5′-tccctggagaagagctacga-3′(seqidno.3)，下游引物5′-agcactgtgttggcgtacag-3′(seqidno.4)，产物194bp。用takara的荧光定量试剂检测基因表达量。荧光定量pcr的反应程序为95℃，30s；95℃，5s；60℃，30s；72℃，34s；40cycles。

1.2.5细胞内氧化应激水平ros、caspase3及细胞凋亡的检测

将在96孔板中联合用药处理好的细胞，参照碧云天活性氧检测试剂盒(s0033)的方法，检测细胞内氧化应激水平。在6孔板中联合用药处理好的细胞，参照碧云天caspase3活性检测试剂盒(c1115)的方法，检测细胞caspase3活性的表达。在6孔板中联合用药处理好的细胞，参照碧云天annexinv-fitc细胞凋亡检测试剂盒(c1063)的方法，使用流式细胞仪检测细胞的凋亡情况。

2结果

2.1不同药物处理组中ho-1基因的表达情况

分别以rt-pcr及定量pcr对各药物处理组hct8、rko、ht29细胞的ho-1基因表达量进行分析，结果如图1至图6所示。结果显示，各处理组中对照组中可见ho-1少量表达，应用5-fu药物可诱导ho-1mrna的表达明显升高，5-fu药物联用copp后ho-1mrna表达进一步升高，且随着联用copp浓度的升高，ho-1的基因表达也随之升高。而5-fu药物联用znpp可降低ho-1mrna的表达，且随着联用znpp浓度的升高，ho-1mrna的表达也逐渐降低。表明外源性znpp能够降低ho-1基因的表达，而copp能增加ho-1基因的表达。但ht29细胞中由于0.5μmolcopp联合5-fu组和0.5μmolznpp联合5-fu组细胞脱落较多，未检测到基因的表达。

2.2各药物浓度对细胞增殖的影响

alaramblue检测显示，不同浓度5-fu和znpp均能明显抑制人结直肠癌细胞增殖活性，具有浓度依赖性，随着浓度增加抑制率得到增强(图7)。copp对人结直肠癌细胞增殖影响较小，与对照组比较差异无统计学意义。取5-fu联合不同浓度znpp，各组细胞增值率均明显低于单用5-fu组(p＜0.05)，且呈浓度梯度依赖性；而5-fu联合不同浓度copp，各组细胞增值率略高于单用5-fu组。

2.3各处理组细胞凋亡率比较

流式细胞术(fcm)分析细胞凋亡比例结果显示(图8和图9)：单用5-fu对结直肠癌细胞影响较小，与未加药物组相比，晚期凋亡细胞数量明显增多；与znpp联用后，结直肠癌细胞的凋亡率增加，呈浓度依赖性，与单用5-fu组相比差异极显著(p<0.01)；而与copp联用后，细胞的凋亡率有所降低，与对照组比差异不显著(p>0.05)。

由图10所示，单用5-fu细胞ros活性显著高于空白对照组(p＜0.05)，在rko细胞和ht29细胞中尤为明显，5-fu联用不同浓度znpp后细胞ros活性再次升高在hct8细胞中升高的更明显，且呈浓度梯度，与单用药组比较差异有统计学意义(p＜0.05)；而5-fu联用不同浓度copp后ros活性明显降低，在rko细胞和ht29细胞中尤为明显，且呈浓度梯度(p＜0.05)。2.5各组中caspase-3相对活性分析

由图11所示，单用5-fu细胞caspase-3活性显著高于正常对照组(p＜0.05)，联用不同浓度znpp后细胞caspase-3活性升高更加明显，在znpp低浓度时表现不显著，但呈浓度梯度，与单用药组比较差异有统计学意义(p＜0.05)；而5-fu联用不同浓度copp后caspase-3活性明显降低，在hct8细胞中copp低浓度时不明显，且呈浓度梯度(p＜0.05)，在ht29细胞中caspase-3活性降低不明显。

3讨论

ho-1具有细胞保护功能，即抗氧化作用、抗炎作用以及抗凋亡作用，并且在肿瘤的发生发展中作用越来越重要。近些年研究发现，许多实体肿瘤可见ho-1的高表达，在缺氧和放化疗时表达更为明显。在肿瘤细胞中，ho-1的表达与肿瘤的扩散转移、抗凋亡作用有密切联系。fang等指出ho-1可以抑制肿瘤细胞凋亡，从而促进肿瘤生长。ho-1可以通过减少细胞内促氧化物质，增加胆红素的水平抑制细胞凋亡。张隽开等报道在耐药肝癌bel/fu细胞株中抑制ho-1可以减少化疗药物的浓度和mrna的表达，并且抑制ho-1影响mcr-1表达。

本实验对不同用药处理后的细胞进行ho-1基因水平检测，结果显示，5-fu联合使用znpp后，细胞中ho-1基因的表达下调(图1至图6)，细胞活性降低，表明降低ho-1能抑制结直肠癌细胞的活性，而应用copp作用结直肠癌细胞后，细胞中ho-1基因的表达上调，直肠癌细胞活性改变不明显(图7)。应用化疗药物5-fu后，细胞内ho-1表达增高；联合应用copp后能进一步诱导ho-1表达，同时细胞抑制率和凋亡率较单用5-fu明显下降，而联用znpp抑制细胞ho-1表达后，细胞抑制率和凋亡率显著增加。这表示copp诱导ho-1表达对结直肠癌细胞5-fu化疗损伤存敏感性下降的作用，而应用znpp通过阻断ho-1表达能够增强结直肠癌细胞对5-fu化疗敏感性。说明ho-1诱导剂copp在细胞上确实能够诱导ho-1的表达并对细胞起保护作用，而ho-1抑制剂znpp则会抑制ho-1的表达，促进其凋亡。

另外，应用5-fu作用于结直肠癌细胞后对其生长有抑制作用。在与znpp联用后，细胞发生变圆甚至凋亡现象更为明显，说明znpp与化疗药物5-fu联用有增敏效果。而与copp联用后，细胞生长状态与单用5-fu组比相对要好，说明copp可以减弱5-fu对细胞生长状态的影响。

使用流式细胞仪对细胞凋亡进行检测后发现，5-fu联用znpp后，凋亡细胞有所增加；而使用copp后，凋亡细胞减少(图9)。此实验结果说明znpp由于抑制了ho-1而增加细胞凋亡，copp由于诱导了ho-1的表达保护细胞而抑制细胞凋亡。

活性氧对促进细胞有丝分裂，诱导细胞增殖是至关重要的，在一定浓度范围内，这种促细胞增殖的能力与活性氧的水平呈正相关，细胞内过低的则抑制细胞的有丝分裂，影响细胞的增殖。在柏桦关于nac对胚胎肝细胞增殖活性的影响中证实了细胞内ros水平与细胞增殖存在正相关性。现在普遍认为细胞凋亡是一系列高度调控的半胱氨酸蛋白酶caspase级联反应(cascade)事件的结果，caspase-3(又称cpp32，apopain)被证实处于该级联反应的下游，它通过降解细胞内相应底物使细胞死亡。说明znpp可以增加5-fu药物对细胞生长情况的抑制作用，且znpp是通过抑制ho-1基因的表达而对细胞生长情况进行影响。

因ho-1与细胞保护，抗氧化应激等密切相关。我们对不同用药处理后的rko细胞、hct8细胞、ht29细胞均进行细胞内活性氧水平检测、caspase3活性检测及细胞凋亡检测。结果显示：与单用5-fu组比，经过znpp与5-fu联合用药后，细胞内活性氧水平升高、caspase3活性增强、相对应于细胞凋亡率的明显增加；而copp与5-fu联合用药的与单用5-fu组相比，细胞内活性氧水平有所下降、caspase3活性和细胞凋亡率均降低。

综上所述，本实验探究血红素氧合酶-1对人结直肠癌细胞5-氟尿嘧啶化疗敏感性的影响，在实验中的0.5至10μmol浓度范围内，ho-1抑制剂znpp能够增加人结直肠癌细胞对5-fu药物的敏感性，而ho-1激动剂copp则可以减缓5-fu药物的化疗作用效果。其作用机制可能是通过改变ho-1基因的表达量来影响细胞内产生活性氧水平、间接抑制caspase3活性，从而降低细胞凋亡率。5-fu作为肿瘤治疗的经典化疗药物，体外可以通过znpp等抑制ho-1基因表达的药物降低ho-1基因的表达量而增加5-fu等化疗药物的敏感性，该发现可以为后续结直肠肿瘤或其他类癌症治疗的用药或临床实践提供一个新思路。

虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明精神和范围内，都可以做各种的改动与修饰，因此，本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。