本发明涉及成纤维细胞生长因子-21改造工艺，及经过改造后的新型成纤维细胞生长因子-21类似物的一种新用途，即新型成纤维细胞生长因子-21类似物在治疗弥漫性间质性肺脏疾病中的应用。
背景技术：
弥漫性间质性肺脏疾病是众多肺部疾病发展到晚期的共同结局，其主要病理特征是慢性肺间质性炎症、成纤维细胞的活化增殖、细胞外基质（extracellularmatrixc，ecm）的过度沉积，最终导致肺的组织结构破坏、功能受损、呼吸衰竭，甚至死亡。
研究表明，弥漫性间质性肺脏疾病的发病因素众多，目前约有200种，包括自身免疫性疾病、药物、环境、感染、遗传等。还有部分弥漫性间质性肺脏疾病因诱因不明，被称为特发性肺纤维化（ipf），严重程度与肺癌相当，5年的生存率只有30%～50%。据保守估计，我国现有弥漫性间质性肺脏疾病患者320万人，平均每天增加10位患者，死亡2位，且发病率也在呈现急剧上升趋势，已经成为严重危害人体健康的重要疾病之一。
目前，用于治疗弥漫性间质性肺脏疾病的药物种类主要包括抗炎药物、抗氧化剂、中药、抗纤维化药物以及基因工程抗体等。特异性抗纤维化的药物仅有吡非尼酮和尼达尼布，临床疗效较好。于2014年10月被美国fda批准，可有效减缓轻至中度ipf患者的肺功能衰退，延缓疾病进展。但是，两者均会导致明显的副作用，如吡非尼酮导致胃肠道和皮肤过敏反应，尼达尼布引起腹泻等。所以，目前临床上仍然缺乏安全而有效的特异性治疗弥漫性间质性肺脏疾病的药物。此外，随着弥漫性间质性肺脏疾病的致病机制研究的逐渐深入，研究者又开发了用于弥漫性间质性肺脏疾病治疗的新药物和新途径，但大部分研究仍处于临床前或临床研究阶段。因此，研究治疗弥漫性间质性肺脏疾病更加安全和有效的药物成为全世界科研工作者的竞争的焦点之一。
弥漫性间质性肺脏疾病的主要分子机制包括炎症反应、肺成纤维细胞到肌成纤维细胞的转化、上皮细胞-间充质细胞转化（epithelial-mesenchymaltransition，emt）、基质金属蛋白酶（matrixmetalloproteinase，mmps）/金属蛋白酶组织抑制剂（tissueinhibitorofmetalloproteinase，timp）失衡、氧化应激和相关的信号传导通路活化等。近年来，研究发现emt是弥漫性间质性肺脏疾病发生的重要机制之一。在弥漫性间质性肺脏疾病发生的过程中，肺泡上皮细胞失去其上皮的结构和功能，转变成间充质细胞-肌成纤维细胞，进而分泌大量的ecm聚集在肺部，导致肺脏瘢痕和僵硬，从而形成弥漫性间质性肺脏疾病。肺泡上皮细胞发生emt时，其上皮细胞标志物如e-钙黏蛋白（e-cadherin）、角蛋白（keratin）等消失，进而出现α-平滑肌肌动蛋白（α-smoothmuscleactin，α-sma）、波形蛋白（vimentin）等间质细胞标志物。现阶段国内外大量研究均证实，tgf-β1在emt的发生和发展中起到了重要作用。大量研究发现，氧化应激产生的ros可以促进tgf-β1的表达和活化。因此，提高机体的抗氧化能力，可抑制tgf-β1的表达和活化，进而抑制emt，有效缓解弥漫性间质性肺脏疾病。
成纤维细胞生长因子-21因具有调节糖脂代谢等功能成为研究的焦点。但其作用效果缺乏稳定性，确切的作用还有待进一步验证。药物基因本身的结构和活性是决定其作用的效果及稳定性的重要因素之一。因此，对人源成纤维细胞生长因子-21进行分子改造及优化表达，已成为该领域近年来研究的热点。
技术实现要素：
本发明的目的是提供成纤维细胞生长因子-21改造工艺，及改造后成纤维细胞生长因子-21类似物在治疗弥漫性间质性肺脏疾病中的应用。
本发明还保护一种治疗和/或预防弥漫性间质性肺脏疾病的药物，其活性成分为成纤维细胞生长因子-21类似物。所述药物还包括其它药学上可接受的载体或辅料。所述药物中，除了所述活性成分外，可以添加药学上允许的赋形剂、填充剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、增效剂和添加剂等。所述药物的给药形态可为针剂（如粉剂、水剂、油剂）。所述制剂都可采用本领域技术人员熟知常用的制备方法而获得。所述药物的给药途径可为皮下注射、静脉注射或肌肉注射。
以上任一所述成纤维细胞生长因子-21类似物为如下（a）或（b）：
（a）由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
（b）将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有治疗和/或预防弥漫性间质性肺脏疾病的功能的由序列1衍生的蛋白质。
所述成纤维细胞生长因子-21类似物对弥漫性间质性肺脏疾病的治疗作用体现为（c1）至（c7）中的至少一种：
（c1）抑制弥漫性间质性肺脏疾病发生；
（c2）抑制弥漫性间质性肺脏疾病程度；
（c3）降低肺脏中胶原纤维和/或肌纤维的水平；
（c4）降低肺脏中羟脯氨酸的水平；
（c5）降低肺脏中i型胶原蛋白和/或α-平滑肌肌动蛋白的水平；
（c6）降低肺脏中tgf-β1水平；
（c7）提高肺脏中nrf2水平，提高机体抗氧化能力，抑制tgf-β1水平。
以上任一所述成纤维细胞生长因子-21类似物具体可采用包括如下步骤的方法制备：
（1）表达所述成纤维细胞生长因子-21类似物与分子伴侣的融合蛋白；
（2）收集所述融合蛋白，切除所述分子伴侣后得到所述成纤维细胞生长因子-21类似物。
所述分子伴侣具体可为分子泛素样修饰蛋白（即分子伴侣sumo）。
所述“表达所述成纤维细胞生长因子-21类似物与分子伴侣的融合蛋白”的实现方法如下：将所述成纤维细胞生长因子-21类似物的编码基因插入原核表达载体psumo，得到重组质粒；将所述重组质粒导入大肠杆菌rosetta(de3)，得到重组菌；发酵所述重组菌并采用iptg进行诱导，得到所述融合蛋白。
所述“切除所述分子伴侣”的实现方式如下：取所述融合蛋白，用sumo蛋白酶i（sumo蛋白酶i与融合蛋白的摩尔比具体可为1:50）和dtt（所述dtt的初始浓度可为2mmol/l）切割（切割条件具体可为4℃切割过夜）。
所述成纤维细胞生长因子-21类似物的编码基因具体可为如下1）或2）或3）的dna分子：
1）序列表中序列2所示的dna分子；
2）在严格条件下与1）限定的dna序列杂交且编码具有相同功能的蛋白的dna分子；
3）与1）限定的dna序列具有90%以上同源性且编码具有相同功能的蛋白的dna分子。
所述严格条件为在0.1×sspe（或0.1×ssc）、0.1％sds的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。
本发明发现改造后的成纤维细胞生长因子-21类似物能够有效抑制弥漫性间质性肺脏疾病的发生，且作用效果显著优于人源成纤维细胞生长因子-21，可作为药物治疗和/或预防弥漫性间质性肺脏疾病，对于弥漫性间质性肺脏疾病的治疗和预防具有重大价值。
附图说明
图1为成纤维细胞生长因子-21类似物的聚丙烯凝胶电泳图。
图2为he染色结果。
图3为masson染色结果和表面密度。
图4为羟脯氨酸含量检测结果。
图5为tgf-β1、i型胶原蛋白、α-平滑肌肌动蛋白和e-钙黏蛋白基因相对β-actin基因转录水平的表达变化。
图6为tgf-β1、i型胶原蛋白、α-平滑肌肌动蛋白和e-钙黏蛋白基因相对β-actin基因蛋白水平的表达变化。
图7为nrf2基因相对β-actin基因的转录水平的表达变化。
图8为nrf2基因相对β-actin基因的蛋白水平的表达变化。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
成纤维细胞生长因子-21类似物，简称fgf-21类似物，如序列表的序列1所示。fgf-21类似物的编码基因如序列表的序列2所示。
原核表达载体psumo（在文献中被称为“phissumo”）：参考文献：姜媛媛，尹成凯，李晋南，任桂萍，张薇，李德山。利用sumo融合系统高效表达可溶性重组蛋白的研究。东北农业大学学报，2008，39(10):57-62；李璐，尹成凯，李德山。高效表达可溶性重组蛋白表达载体——phissumo。生物技术，2009，19(3):11-14。
大肠杆菌rosetta(de3)：北京全式金生物技术有限公司，目录号cd801。
雄性c57bl/6小鼠：上海斯莱克实验动物有限责任公司，动物质量合格证号scxk(沪)2017-0005。
pbs缓冲液（ph7.2）：溶剂为水，溶质及其浓度如下：nacl137mmol/l，kcl2.7mmol/l，na2hpo410mmol/l，kh2po42mmol/l。
苏木精-伊红染色法(hematoxylin-eosinstaining)，简称he染色法：苏木精染液为碱性，主要使细胞核内的染色质与胞质内的核糖体着紫蓝色；伊红为酸性染料，主要使细胞质和细胞外基质中的成分着红色。
masson染色（主要用于胶原纤维和肌纤维的鉴别染色）：胶原纤维呈蓝色(被苯胺蓝所染)或绿色（被亮绿所染），肌纤维呈红色(被酸性品红和丽春红所染)。
实施例1、fgf-21类似物的制备
一、重组质粒的构建
1、为了提高人源fgf-21基因（如序列3基因所示）表达出蛋白的稳定性，对其基因做了如下改造：5'末端加入一个丙氨酸（ala），延长重组蛋白的半衰期，并将组氨酸（his）替换成酪氨酸（tyr），3'末端倒数第2个丙氨酸（ala）替换成苏氨酸（thr），以及对基因的密码子偏好性进行优化后，送至上海生工生物工程技术服务有限公司合成全基因。
2、将合成后的基因载体转入dh5α感受态中进行扩增，然后提取质粒dna，用限制性内切酶bsai和bamhi双酶切，回收酶切产物。
3、用限制性内切酶bsai和bamhi双酶切原核表达载体psumo，回收约5700bp的载体骨架。
4、将步骤2的酶切产物和步骤3的载体骨架连接，得到重组质粒psumo-fgf-21类似物。重组质粒psumo-fgf-21类似物中，fgf-21类似物的编码基因和载体骨架上的分子伴侣sumo的编码序列、以及载体骨架上的his标签的编码序列（位于sumo的编码序列的上游，由6个组氨酸残基组成）融合，形成融合基因，表达融合蛋白（融合蛋白自n端至c端依次为his标签、分子伴侣sumo和fgf-21类似物）。
fgf-21类似物的预期分子量为21kda（推算分子量为21kda，sds-page电泳显示分子量为25kda左右），分子伴侣sumo的预期分子量为12kda（推算分子量为12kda，sds-page电泳显示分子量为18kda左右）。
二、fgf-21类似物的制备和纯化
1、将重组质粒psumo-fgf-21类似物导入大肠杆菌rossetta(de3)，得到重组菌。
2、将步骤1得到的重组菌的单菌落接种至5mllb培养基中，37℃、120rpm振荡培养10h，然后取菌液，以1:100的体积比接种于500ml含50mg/ml青霉素的lb培养基中，37℃、120rpm振荡培养2h，此时od600nm为0.5左右。
3、向步骤2得到的菌液中加入iptg并使其浓度为0.25mmol/l以进行诱导（25℃、60rpm振荡培养10h），然后4℃、4000rpm离心30min，收集菌体。
4、取步骤3得到的菌体，进行超声破碎（amp35%，8-12min，工作1s停1s），4℃、12000rpm离心，分别收集上清液和沉淀。
分别将上清液和沉淀进行12%sds-page电泳分析。结果表明，可溶性表达的目的蛋白占菌体总目的蛋白的70％以上。
5、取步骤4得到的上清液，进行histraptmffcrudecolum亲和层析。
柱子型号为：柱长0.7cm，柱高2.5cm。
上样量为10ml。
洗脱过程：先用5倍柱体积的杂蛋白洗脱液（溶剂为水，含有如下浓度的各个溶质：40mmol/l咪唑、500mmol/lnacl和50mmol/lna3po4；ph7.4）洗脱以去除杂蛋白，流速为1ml/min；然后用3倍柱体积的目的蛋白洗脱液（溶剂为水，含有如下浓度的各个溶质：500mmol/l咪唑、500mmol/lnacl和50mmol/lna3po4；ph7.4）洗脱，流速为1ml/min，280nm波长监测，收集目标峰（即峰值高于80mau的峰），即为融合蛋白溶液。
6、采用hipreptm26/10desalting将步骤5得到的融合蛋白溶液进行脱盐。
7、取步骤6得到的溶液，用sumo蛋白酶i（sumo蛋白酶i与融合蛋白的摩尔比为1:50）和终浓度为2mmol/l的dtt4℃切割过夜。
8、取步骤7得到的溶液，进行histraptmffcrudecolum亲和层析。
柱子型号为：柱长0.7cm，柱高2.5cm。
上样量为15ml，280nm波长监测，收集目标峰（即峰值高于30mau的峰），即为fgf-21类似物溶液。
fgf-21类似物溶液的聚丙烯凝胶电泳图见图1（泳道1为分子量标记，泳道6为fgf-21类似物溶液）。回收目的带并进行n端测序，结果表明，n端前15个氨基酸残基如序列表的序列1自n末端第1至15位氨基酸残基所示。
实施例2、fgf-21类似物对弥漫性间质性肺脏疾病的治疗作用。
实验动物为六周龄清洁剂雄性c57bl/6小鼠。
采用实施例1制备的fgf-21类似物溶液进行试验。
92只14周龄雄性spf级c57bl/6小鼠，体重约25-30g，在温度为22±2℃，相对湿度为55±2%，每天予以12h光照，给予啮齿动物的标准饮食的条件下，适应性喂养5d后，被随机分为5组：正常对照（normalcontrol组，n）组12只；模型对照（blm）组：20只；人源fgf-21治疗（hfgf-21）组：20只；fgf-21类似物治疗（fh）组：20只；吡非尼酮治疗（pfd）组：20只。blm使用0.9%的生理盐水稀释，将小鼠在无菌条件下进行手术，blm组、hfgf-21组、fh组和pfd组分别气管内滴注2mg/mlblm。n组小鼠气管内滴注等体积生理盐水。小鼠在滴注blm7d后，blm组、hfgf-21组、fh组和pfd组分别取造模成功的小鼠12只，进行后续实验，hfgf-21组和fh组小鼠分别开始皮下注射fgf-21类似物蛋白，剂量分别为5mg/kg，每天注射1次，连续注射3周。根据文献报道，pfd组小鼠在滴注blm7d后采用灌胃给药500mg/kgpfd，n组小鼠和blm组小鼠每天皮下注射相同体积pbs。第4周结束，处死各组小鼠，取小鼠肺脏组织。
在气管内注射博来霉素（blm）诱发小鼠肺脏纤维化模型一周后，腹腔注射fgf-21类似物进行治疗三周，然后处死小鼠，取肺脏，进行he染色。肺脏切片he染色结果显示，模型组（m）小鼠肺脏损伤严重，小鼠部分肺脏的肺泡腔消失，在肺泡间隙有大量的炎性细胞浸润（箭头a所示）、成纤维细胞（箭头b所示），肺脏失去其原有结构。与模型组相比，pfd干预组小鼠肺脏中仅有少量炎症细胞和成纤维细胞，可观察看完整的排列比较整齐的肺泡结构。fgf-21类似物治疗组结果与pfd治疗结果相似，hfgf-21组治疗后略有缓解，但fgf-21类似物治疗效果显著优于hfgf-21，如图2所示。
实验结束后，取各组小鼠的肺脏进行masson染色。结果显示，模型组（m）小鼠肺脏胶原纤维的含量（蓝色区域）相比于正常对照组显著升高；pfd干预组小鼠肺脏内胶原纤维的含量（蓝色区域）相比于模型组（m）显著下降，fgf-21类似物干预组结果与pfd干预组结果相似，hfgf-21组治疗后略有缓解，但fgf-21类似物治疗效果显著优于hfgf-21，如图3所示。
采用羟脯氨酸试剂盒检测肺脏内的羟脯氨酸含量，结果显示，模型组（m）肺脏羟脯氨酸水平相比于正常对照组（n）显著升高，而pfd干预组小鼠肺脏羟脯氨酸水平相比于模型组（m）显著下降，与正常对照组水平接近，fgf-21类似物治疗组与pfd干预组结果相近，hfgf-21组治疗后略有缓解，但fgf-21类似物治疗效果显著优于hfgf-21，如图4所示。
提取各组小鼠肺脏部分组织提取rna，反转录成cdna，采用real-timepcr检测纤维化相关基因tgf-β1、i型胶原蛋白、α-平滑肌肌动蛋白和e-钙黏蛋白转录表达水平，采用β-actin基因为内参基因。用于检测tgf-β1基因的引物对为：5'-atgctaaagaggtcacccgc-3'，5'-tgcttcccgaatgtctgacg-3'。i型胶原蛋白基因的引物对为：5'-cgccatcaaggtctactgc-3'，5'-gaatccatcggtcatgctct-3'。α-平滑肌肌动蛋白基因的引物对为：5'-ccgagatctcaccgac-3'，5'-tccagagctacatgacacag-3'。e-钙黏蛋白基因引物对为5'-gcagttctgccagagaaacc-3'，5'-tggatccaagatggtgatga-3′。结果显示，模型组（m）肺脏中tgf-β1、coli及α-smamrna水平表达相比于正常对照组（n）显著升高，e-cadherinmrna水平表达相比于正常对照组（n）显著降低，而pfd干预组小鼠肺脏中tgf-β1、coli及α-smamrna表达水平相比于模型组（m）显著降低（p<0.05），e-cadherinmrna水平表达显著升高，与正常组相近。fgf-21类似物治疗组小鼠肺脏中上述基因的mrna表达水平与pfd干预组相相似，hfgf-21组治疗后略有缓解，但fgf-21类似物治疗效果显著优于hfgf-21，如图5所示。
取各组小鼠肺脏，提取总蛋白，通过westernblot检测tgf-β1、i型胶原蛋白、α-平滑肌肌动蛋白、e-钙黏蛋白和内参基因β-actin的蛋白水平表达（用于检测tgf-β1、i型胶原蛋白、α-平滑肌肌动蛋白、e-钙黏蛋白和β-actin基因的一抗购自abcam公司。westernblot的照片及通过灰度分析得到的tgf-β1、i型胶原蛋白、α-平滑肌肌动蛋白、e-钙黏蛋白相对β-actin的蛋白水平，结果见图6：模型组（m）肺脏tgf-β1、coli、α-sma蛋白水平表达相比于正常对照组（n）显著升高，e-cadherin表达水平相比于正常对照组（n）显著降低。而pfd干预组小鼠肺脏中tgf-β1、coli、α-sma蛋白水平表达相比于模型组（m）显著降低，e-cadherin表达水平显著升高。fgf-21类似物干预组的结果与pfd干预组结果相近，hfgf-21组治疗后略有缓解，但fgf-21类似物治疗效果显著优于hfgf-21。结果表明，fgf-21类似物可以显著抑制弥漫性间质性肺脏疾病的发生，且改造后的治疗效果显著增加。
在气管内注射blm诱发小鼠肺脏纤维化模型一周后，腹腔注射fgf-21类似物进行治疗三周。提取肺脏rna，real-timepcr检测各组小鼠肺脏中nrf-2表达水平，结果（如图7）显示，fgf-21类似物治疗组与pfd干预组（pfd）肺脏中nrf-2mrna表达水平相比于模型对照组（m）和正常对照组（n）均显著升高，hfgf-21组治疗后略有升高，但fgf-21类似物作用效果显著优于hfgf-21。
在气管内注射blm诱发小鼠肺脏纤维化模型一周后，腹腔注射fgf-21类似物进行治疗三周。提取肺脏蛋白，westernblotting检测各组小鼠肺脏中nrf-2蛋白水平表达，结果显示，fgf-21类似物干预组与pfd干预组（pfd）肺脏中nrf-2表达水平相比于模型对照组（m）和正常对照组（n）均显著升高，hfgf-21组治疗后略有升高，但fgf-21类似物作用效果显著优于hfgf-21。如图8所示。
序列表
<110>哈尔滨博翱生物医药技术开发有限公司
<120>新型成纤维细胞生长因子-21类似物在治疗弥漫性间质性肺脏疾病中的应用
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