含有硫氧还蛋白的皮肤外用剂组合物的制作方法

本发明涉及一种含有硫氧还蛋白(thioredoxin)的皮肤外用剂组合物。更具体地，涉及一种含有硫氧还蛋白，从而能够提供优异的皮肤保湿力改善效果、皮脂调节效果、毛孔收缩效果、通过血循环改善的脸色改善等的整体皮肤状态的改善效果的组合物。
背景技术：
皮肤作为人体的第一道防御屏障，具有使得体内器官免受温度及湿度变化和紫外线、公害物质等外部环境的刺激而保护体内器官的功能。随着年龄的增长，皮肤将由于内在、外在因素而发生变化。即，从内在方面来说，由于调节新陈代谢的各种激素分泌减少，并且免疫细胞的功能和细胞活性降低，因此人体所需的免疫蛋白及生物体组成蛋白的合成减少。从外在方面来说，由于臭氧层的破坏，从太阳光线中到达地表的紫外线含量增加，并随着环境污染的深化，自由基及活性氧增加，不仅使得皮肤的厚度减小、皱纹增加、弹力减小，而且使皮肤气色变暗，皮肤总发生问题(trouble)，还会增加痣和雀斑及老年斑，从而引起气色变差、肤色变暗等各种变化。为了防止这些由于皮肤内在及外在因素而发生的皮肤状态变化，并维持健康的皮肤状态，人们一直努力通过将从现有的各种动物、植物、微生物等中获得的生理活性物质添加到化妆品中并进行使用来改善皮肤状态。【现有技术文献】(专利文献1)韩国授权专利第0585269号技术实现要素：要解决的技术问题对此，本发明人发现由于作为生命活动中所必需的酶的硫氧还蛋白是在皮肤中能够实际表达的蛋白质，因此，对皮肤的安全性高，并且，将硫氧还蛋白用于皮肤时，能够提供优异的改善皮肤状态的效果，从而完成了本发明。因此，本发明的目的在于，提供一种皮肤外用剂组合物，所述组合物含有硫氧还蛋白，从而能够改善皮肤的整体状态。技术方案为了实现上述目的，本发明提供一种含有硫氧还蛋白作为有效成分的用于保湿的皮肤外用剂组合物。此外，本发明提供一种含有硫氧还蛋白作为有效成分的用于改善气色及肤色的皮肤外用剂组合物。此外，本发明提供一种含有硫氧还蛋白作为有效成分的用于收缩毛孔的皮肤外用剂组合物。此外，本发明提供一种含有硫氧还蛋白作为有效成分的用于调节皮脂的皮肤外用剂组合物。有益效果本发明的组合物含有硫氧还蛋白，从而能够提供优异的皮肤保湿力改善效果、皮脂调节效果、毛孔收缩效果、通过血循环改善的脸色改善等整体皮肤的状态改善效果。附图说明图1是示出从酵母属发酵物中获得硫氧还蛋白的过程。最佳实施方式根据本发明的皮肤外用剂组合物含有硫氧还蛋白作为有效成分。硫氧还蛋白是分子量为10,000～13,000的低分子蛋白，简称trx。作为核苷酸还原酶还原核苷酸时的质子供给体，存在于活性中心的一对半胱氨酸残基从原核生物一直保存至真核生物，并在还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nadph)和硫氧还蛋白还原酶的存在下，具有还原并打开目标蛋白的硫化键的活性。已知人的硫氧还蛋白(trx)/肌动蛋白解聚因子(adf)(成人t细胞白血病衍生因子)还参与细胞增殖或抑制转录因子。本发明中使用的硫氧还蛋白可以通过本领域中已知的方法来进行分离，优选可以通过发酵来培养包含硫氧还蛋白的物质，尤其，本发明中使用的硫氧还蛋白可以从酵母，优选从利用酵母属(saccharomyces)的酵母的发酵物滤液中分离得到。在图1中例示出了从酵母发酵物中获得本发明中使用的硫氧还蛋白的过程。以组合物总重量计，根据本发明的组合物，可以含有0.00001至50重量％，优选含有0.00001至30重量％，更优选含有0.00001至10重量％的所述硫氧还蛋白。这是由于当所述硫氧还蛋白的含量少于0.00001重量％，则由所述成分所产生的效能、效果微弱，当超过50重量％，则会存在皮肤安全性或剂型上的问题。本发明的组合物可以作为用于保湿的皮肤外用剂组合物来使用，其能够强化皮肤屏障功能，并能够诱导皮肤角质形成细胞的分化。因此，可以有效地用作预防或改善因表皮没有完全分化而产生的皮肤干燥症、接触性皮肤炎或牛皮癣等的皮肤外用剂组合物。本发明的组合物可以作为用于改善气色及肤色的皮肤外用剂组合物来使用，将其使用于皮肤时，通过扩张毛细血管，并促进血液循环来顺利将营养供应到皮肤，并抑制皮肤老化，因此，改善气色及肤色的效果卓越。本发明的组合物可以作为用于收缩毛孔、调节皮脂及改善皮肤问题的皮肤外用剂组合物来使用，将其使用于皮肤时，抑制过度分泌的皮脂，并且通过促进活性氧的消除和胶原蛋白的合成来收缩毛孔，并且由于炎症因子表达的减少，因此，抑制皮肤问题的效果卓越。并且，可以通过优异的抗氧化化能力来防御皮肤刺激的生成。所述本发明的皮肤外用剂组合物可以剂型化为化妆品组合物，也可以含有化妆品学或皮肤科学上可接受的载体或基材而被剂型化。其可以作为适合局部使用的全部剂型来提供，例如，可以提供为溶液、凝胶、固体、糊状无水生成物在水相中分散油相而获得的乳液、悬浮液、微乳液、微胶囊、微细颗粒球或离子型(脂质体)及非离子型的小囊分散剂的形态，或霜、化妆水、洗剂、粉、软膏、喷雾剂或遮瑕棒的形态。并且，可以以泡沫(foam)形态或进一步包含压缩的推进剂的气雾剂组合物的形态使用。这些组合物可以根据本领域常用的方法制备。并且，根据本发明的组合物可以包括脂肪物质、有机溶剂、溶解剂、浓缩剂、胶凝剂、软化剂、抗氧化剂、悬浮剂、稳定剂、发泡剂(foamingagent)、芳香剂、表面活性剂、水、离子型或非离子型乳化剂、填充剂、螯合剂、络合剂、保存剂、维生素、阻断剂、湿润剂、精油、染料、颜料、亲水性或亲油性活性剂、脂质小囊或常用于化妆品的任何其它成分等在化妆品学或皮肤科学领域中常用的辅助剂。所述辅助剂以在化妆品学或皮肤科学领域中通常使用的量导入。并且，本发明的组合物，为了增加皮肤改善效果，可以含有皮肤吸收促进物质。本发明组合物的剂型不受特别限定，可以根据目的来作出适当的选择。例如，可以剂型化为化妆水、洗剂、精华、霜、软膏、凝胶、剥撕式面膜、眼膜(patch)、面膜(mask)及喷雾剂等护肤品，隔离霜(makeupbase)、粉底、粉、睫毛膏、口红等彩妆产品，洁面油、清洁霜、洁面凝胶、眼唇卸妆露(point-make-upremover)等清洁产品等。具体实施方式以下，将通过试验例及剂型例更具体地说明本发明的结构及效果。然而，这些试验例及剂型例仅是为了帮助理解本发明而作为例示目的来提供的，本发明的范畴及范围并不限定于下述例。[参考例1]用于本发明组合物的效能试验而使用的硫氧还蛋白为医药食品国际(pharmafoodinternational)有限公司(东京西京区御陵大原1-49，615-8245日本)的硫氧还蛋白(trx)清酒提取物(酵母菌发酵物(saccharomycesferment))，其硫氧还蛋白含量为4mg/1g。[剂型例1及比较剂型例1]根据下述表1的组成，通过常规的方法来制备营养霜(单位：重量％)。表1[试验例1]皮肤保湿力增加效果测定为了测定硫氧还蛋白对皮肤保湿力增加产生的效果，利用了所述剂型例1及比较剂型例1，并作出了如下评价。对于20名40至50岁年龄段的分类为干燥皮肤的成年男女，以每组10名分为两组，将剂型例1及比较剂型例1两个组的营养霜以每天2次涂抹于脸部4周。涂抹开始前、涂抹1周后、2周后、4周后时，以及在停止涂抹经过2周(共经过6周)之后，在恒温、恒湿条件(24℃，相对湿度40％)下，使用皮肤水分测试仪(corneometercm825，c+k电子有限公司(c+kelectronicco.)，德国)测定皮肤水分量。其结果示于下述表2中。表2的结果是以试验开始之前测定的皮肤水分测试仪的值作为基准，将处理一段时间之后的测定值增加部分以百分率表示的结果。表2从所述表2的结果中可以确认，涂抹比较剂型例1时，直到经过涂抹的4周为止，显示出约30％的水分增加率，但停止涂抹后皮肤水分量减少，相反，涂抹含有硫氧还蛋白的剂型例1时，停止涂抹后大部分也显示出30％以上的皮肤水分增加率。由此可以知道含有硫氧还蛋白的本发明的组合物的皮肤保湿力效果优异。[试验例2]角质形成细胞分化促进效果测定如下所示，为了了解硫氧还蛋白的角质形成细胞分化促进效果，利用吸光度来测定角质形成细胞分化时生成的角化包膜(cornifiedenvelop，ce)量。首先，将从婴儿的表皮分离后并进行一次培养的人的角质形成细胞放入培养用的烧瓶中，使其附着于底部后，在培养液中以5ppm的浓度处理硫氧还蛋白之后，培养5日直到细胞长到底部面积的70～80％为止。此时，将低钙(0.03mm)处理组和高钙(1.2mm)处理组分别作为阴性对照组和阳性对照组。然后获取上述培养的细胞，用磷酸盐缓冲盐水(phosphatebufferedsaline)洗涤之后，加入1ml的含有2％十二烷基硫酸钠(sodiumdodecylsulfate，sds)和20mm浓度的二硫苏糖醇(dithiothreitol，dtt)的10mm浓度的三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲液(tris-hcl，ph7.4)，并进行超声处理(sonication)、煮沸(boiling)、离心分离，再将沉淀物放入1mlpbs中，进行悬浮，并测定在340nm下的吸光度。另外，取出一部分所述超声处理后的溶液，测定蛋白质含量，将其作为评价细胞分化程度的基准。并将其结果示于下述表3中。表3试验物质在角质形成细胞中的分化能(％)低钙(0.03mm)溶液(阴性对照组)100高钙(1.2mm)溶液(阳性对照组)210硫氧还蛋白295如上述表3所示，可以确认处理硫氧还蛋白时，角质形成细胞的分化促进效果优异。[试验例4]皮肤屏障功能恢复效果测定为了测定硫氧还蛋白对由于皮肤损伤而受损的皮肤屏障功能恢复产生的效果，实施了下述实验。对于10名成人男女的上臂，用胶带剥离(tapestripping)方法，损伤皮肤屏障，分别涂抹按照下述表4的组成制备的剂型例2及比较剂型例2两个组，用vapometer(海豚(delfin)，芬兰)，每天测定1次经皮水分损失量(twel)的恢复程度，测定七天，并进行了比较。这里的比较剂型例2为阴性对照组赋形剂(vehicle)。将其实验结果示于下述表5中。表5的结果是将屏障损伤前和屏障损伤后的处理前的差异作为100％基准进行的比较结果。表4配料成分剂型例2比较剂型例2精制水6970丙二醇3030硫氧还蛋白1-表5从上述表5中可知，可以确认当使用不含有硫氧还蛋白的比较剂型例2处理时，随着时间的推移，经皮水分损失量逐渐增加，相反，当使用含有硫氧还蛋白的剂型例2处理时，经皮水分损失量以很快的速度恢复正常，且屏障损伤得到恢复。[试验例5]气色改善效果为了评价根据本发明的化妆品组合物的促进皮肤血循环的效果，利用激光多普勒血流成像仪(laserdopplerperfusionimager)，测定皮肤中血液循环程度。已知ldpi是测定皮肤中的血液循环的仪器，并且其为目前广泛使用的仪器，是一种不仅可以测定皮肤毛细血管中的血液的速度及量，而且可以测出小动脉和小静脉中的流动的非常灵敏的仪器。在恒温恒湿室里，用香皂洗脸之后，适应30分钟，并利用ldpi测定了初期值。首先，用ldpi对平时手脚冰凉的30名女性的额头下方的初期血流量进行了测定。然后，使试验对象使用1周所述剂型例1及比较剂型例1之后测定血流量，然后将测定的血流量和所述初期测定值进行比较，并将其结果(皮肤血流量变化)示于下述表6中。表6化妆品使用前后ldpi结果-皮肤血流量试验物质使用一周后的皮肤血流量变化率(％)剂型例112比较剂型例15从上述表6的结果中可以确认，根据本发明的化妆品组合物与不含有硫氧还蛋白的比较剂型例1相比，使得皮肤血流量显著增加，并通过这种血液循环促进而使气色得到改善。这最终表明根据本发明的含有硫氧还蛋白的化妆品组合物能够对有效传达皮肤营养成分，抑制并延缓皮肤老化做出贡献。[试验例6]肤色改善效果为了了解所述剂型例1及比较剂型例1的肤色改善效果，使30名测试对象分别使用(晚1次/日，共涂抹1周)之后，利用facialstagedm-3(茉莉特(moritex)，日本)仪器，评价肤色改善程度。采用皮肤的明度及色彩变化值，以及皮肤的明度及色彩测定值对肤色改善率进行了判断，并将其结果示于下述表7中。明度及色彩变化值越高表示肤色得到改善。表7从表7的结果中可以确认，不含有本发明的硫氧还蛋白的比较剂型例1，未显示出显著的肤色改善功效，相反，使用含有硫氧还蛋白作为有效成分的剂型例1时，与使用前相比，使用后的肤色得到很大改善。[试验例7]毛孔收缩效果1.通过促进胶原蛋白合成的收缩毛孔的效果将本发明的硫氧还蛋白与tgf-β的胶原蛋白的合成促进效果进行比较并进行了测定。首先，将成纤维细胞(fibroblast)，按每孔105个细胞接种于24孔(well)中，并进行培养直至长到90％左右为止。将其用无血清细胞培养基(dmem)培养24小时之后，分别使用10ng/ml的溶于无血清培养基中的本发明的硫氧还蛋白和tgf-β进行处理，并在co2培养基中培养24小时。取出它们的上清液，并利用原骨胶原型(i)酶联免疫吸附测定(elisa)试剂盒(原骨胶原型(i)(procollagentype(i))，观察原骨胶原(procollagen)的增减与否，并将其结果示于下述表8中。对于胶原蛋白的合成能力，将非处理组设为100而进行了对比。表8试验物质胶原蛋白合成能力(％)非处理组100tgf-β183.5硫氧还蛋白196.2从上述表8的结果中可以确认，本发明的硫氧还蛋白与阳性对照组tgf-β相比，显示出更高水平的优异的胶原蛋白合成能力。因此，可以确认本发明的硫氧还蛋白通过增加毛孔周边的胶原蛋白生成量来收缩变宽的毛孔。2.毛孔收缩效果为了了解剂型例1及比较剂型例1的毛孔收缩效果，进行如下评价。选出20名毛孔大小宽的男女测试对象，按每组10名分成两组，并按照组别在脸上每天涂抹剂型例1及比较剂型例1的营养霜，共涂抹4周。毛孔收缩效果的判定按照以下方式实施。拍摄实验前和4周后的照片，并让专家通过肉眼进行评价。其结果示于下述表9中(评价等级：0-完全没有收缩；5-收缩很多)。表9试验物质评价等级剂型例14比较剂型例10从上述表9的结果中可知，比较剂型例1没有收缩毛孔的效果，然而剂型例1示出能够用肉眼确认的毛孔收缩效果，从而可知本发明的硫氧还蛋白对收缩毛孔大小的效果优异。[试验例8]皮脂分泌抑制效果1.通过抑制5α-还原酶活性的抑制皮肤分泌过多的效果为了确认5α-还原酶活性抑制效果，在hek293-5αr2细胞中测定了[14c]睾酮转化成[14c]二氢睾酮(dht：dihydrotestosterone)的比率。在hek293细胞上转染p3xflag-cmv-5αr2之后，并按每孔2.5×105个细胞的量接种于24孔板中，并进行培养(parketal.，2003，jds.vol.31，pp.191-98)。第二天换成添加有酶底物和抑制剂的新培养基。将0.05μci[14c]睾酮(试剂盒(amershampharmaciabiotech)，英国)用作培养基底物。为了确认5α-还原酶活性抑制程度，加入硫氧还蛋白，并在37℃，5％co2培养基中培养2小时。此时，将没有加入硫氧还蛋白的用作阴性对照组，将加入非那雄胺(finasteride)的用作阳性对照组。之后回收培养基，并用800μl乙酸乙酯提取类固醇之后，分离上部的有机溶剂层，并晾干之后，对剩余的残留物，再用50μl乙酸乙酯溶解，并在硅塑料薄膜硅胶60f254(silicaplasticsheetkieselgel60f254)上，使用乙酸乙酯-己烷(1:1)作为溶剂来展开。将塑料样本在空气中干燥之后，为了测定同位素的量而使用了淋浴系统将干燥的塑料薄板和x射线薄膜一同加入到浴盒中，1周后测定留在薄膜上的睾酮和二氢睾酮的同位素量，然后根据下述方程式1及2，分别算出转化率及抑制率，并将其结果示于下述表10中。方程式1转化率(％)＝dht区域中的放射能/总放射能×100方程式2抑制率(％)＝[对照组的转化率-试验物质的转化率]/对照组的转化率×100表10试验物质转化率(％)阻碍率(％)阴性对照组48.0-阳性对照组27.642.5硫氧还蛋白15.960.8从上述表10的结果中可以确认，硫氧还蛋白可以有效地抑制5α-还原酶的活性，从而阻断睾酮转化为二氢睾酮，并且显示出了与已知的抑制5α-还原酶活性的非那雄胺相比更加优异的抑制效果。所述5α-还原酶使睾酮转化为二氢睾酮，从而与细胞质内的受体蛋白结合而进入核内，从而活性化皮脂腺细胞并促进分化，从而使皮脂腺内的皮脂过度分泌。因此，确认了硫氧还蛋白通过有效抑制5α-还原酶的活性来抑制皮脂的过多分泌。2.皮脂分泌抑制效果为了了解所述剂型例1及比较剂型例1的皮脂分泌抑制效果，进行了如下评价。选出30名觉得皮脂分泌多的男女测试对象，在指定部位每天涂抹剂型例1及比较剂型例1的营养霜，共涂抹4周。对于皮脂减少效果的判定，通过使用皮脂量测试仪(sebumetersm810，c+k电子有限公司(c+kelectronicco.)，德国)分别测定经过2周及4周后的平均皮脂减少率(％)，并将其结果示于下述表11中。表11从上述表11的结果中可知，本发明的含有硫氧还蛋白作为有效成分的剂型例1与不含其的比较剂型例1相比，能有效地抑制分泌过多的皮脂。当前第1页12