本发明涉及有效成分缓释技术领域，特别涉及一种芹菜素缓释制剂的制备方法。
背景技术：
芹菜素（apigenin）又称为芹黄素，以植物黄色素的形式广泛分布于纤维植物的叶、茎中，如芹菜、柑菊、苹果、女贞子等中，以芹菜中的含量最高。芹菜素是一种天然植物黄酮类化合物，结构上有多个酚类基团，具有良好的抗氧化、抗炎等功效。但是，由于芹菜素不溶于水，其亲水性和亲脂性均很差，而且易被氧化，大大限制了其在化妆品中的应用。
为了增加芹菜素的应用，中国发明专利“一种芹菜素聚乳酸缓释微球及其制备方法”，专利号“201310593357.0”，公开了“一种芹菜素聚乳酸缓释微球及其制备方法”，包括以下步骤：（1）将0.2~1g分子量20000~100000的医用级端羟基外消旋聚乳酸（oh-pdlla-oh）和0.3~1.5g大豆卵磷脂溶解于10ml的有机溶剂中，配成浓度为0.02~0.1g/mlpdlla和0.03~0.15g/ml大豆卵磷脂的混合溶液；（2）将一定质量的芹菜素超声分散于上述聚乳酸混合溶液中，混合后在常温下超声分散2~5min，芹菜素与聚乳酸的质量比为1：2~8；（3）在高剪切搅拌速度为600~2000rpm下，将步骤（2）超声乳化所得的混合溶液缓慢滴加入一定体积的乳化剂中，混合后制成o/w型乳液；混合溶液与乳化剂水溶液的油水体积比为1：2~5；其中所述乳化剂为浓度0.25~0.35g/ml的普朗尼克f-68水溶液；（4）在搅拌速度为400rpm下搅拌10min后，将乳液转至旋转蒸发仪上减压蒸除溶剂，乳液浓缩至体积为10~20ml；（5）将步骤（4）所得分散有微球的乳液离心20~40min，离心速度为12000rpm，离心后混合物上层为液体，下层为固体微球，收集下层固体微球并用蒸馏水洗涤、干燥后，即得平均粒径为1~5μm，载药率＞25％，包封率＞79％，缓释时间＞550h的聚乳酸包载芹菜素的芹菜素缓释微球。
该方法制备的芹菜素缓释微球，虽然载药率＞25％，包封率＞79％，但是缓释时间＞550h，在最初的21h内药物释放度为38.2％，在以后的550h芹菜素从微球中缓慢持续释放，550h累计释放度达到73.5％。化妆品涂抹在皮肤上的停留时间一般在4-12个小时，显然用聚乳酸作为载体，其缓释时间对于化妆品来说过长，不适合在化妆品中应用。
聚乳酸-羟基乙酸共聚物（plga）是一种可降解的功能高分子材料，一般由两种单体-乳酸和羟基乙酸聚合而成，具有良好的生物相容性、成囊和成膜的性能，被广泛应用于制药、医用工程材料和现代化工业领域。在美国，plga通过fda认证，被正式作为药用辅料收录进美国药典。
技术实现要素：
本发明要解决的技术问题是，提供一种芹菜素缓释制剂的制备方法，该芹菜素缓释制剂稳定性好，缓释时间在4-12小时，适合用于化妆品中。
为解决上述技术问题，本发明提供一种芹菜素缓释制剂的制备方法，其特征在于采用以下步骤：
a、按质量比1：1-5：50称取芹菜素、大豆卵磷脂和无水乙醇，30-50℃恒温磁力搅拌1-3h，混合均匀，得芹菜素磷脂复合物溶液；
b、按质量比1：10-50称取聚乳酸-羟基乙酸共聚物（plga）复配物和步骤a所得芹菜素磷脂复合物溶液，40-60℃恒温磁力搅拌1-3h，然后常压蒸馏去除无水乙醇，得plga负载的芹菜素磷脂复合物；所述聚乳酸-羟基乙酸共聚物（plga）复配物由分子量为30000端基为烷基酯的聚乳酸-羟基乙酸共聚物与分子量为28000端基为自由羧酸的聚乳酸-羟基乙酸共聚物按照质量比1：1-5复配而成，所述聚乳酸-羟基乙酸共聚物中乳酸和羟基乙酸的单体质量比均为50：50；
c、按质量比1：5-20称取步骤b所得plga负载的芹菜素磷脂复合物和去离子水，混合后利用高速分散机在8000rpm转速下分散5-10min，得芹菜素磷脂复合物预混液；
d、按质量比1：2称取甘露醇和去离子水，搅拌溶解完全，得冻干保护剂水溶液；
e、按质量比1：3-7称取步骤c所得芹菜素磷脂复合物预混液和步骤d所得冻干保护剂水溶液，混合后采用高压均质机在压力110-150mpa下均质5-15次，然后在-45℃、常压下预冻干36h，最后在-55℃、0.1mpa的条件下冷冻干燥24h，得芹菜素缓释制剂。
所述常压蒸馏设备为re-501型旋转蒸发仪，购自郑州华特仪器公司；所述高速分散机为德国artmiccrad-15功能型分散机，购自广州语特仪器科技有限公司；所述高压均质机为m-110型高压均质机，购自安拓思纳米科技（苏州）有限公司；所述冷冻干燥机为bk-fd10p台式真空冷冻干燥机，购自济南来宝医疗器械有限公司。
所述芹菜素cas：520-36-5，纯度≥98%，购自上海阿拉丁生化科技有限公司；所述大豆卵磷脂cas：8002-43-5，磷脂酰胆碱含量≥80%，购自上海阿拉丁生化科技有限公司；所述无水乙醇cas：64-17-5，纯度≥99.5%，购自上海阿拉丁生化科技有限公司；所述分子量为30000端基为烷基酯的聚乳酸-羟基乙酸共聚物和分子量为28000端基为自由羧酸的聚乳酸-羟基乙酸共聚物均是市售产品，分子量为30000端基为烷基酯的聚乳酸-羟基乙酸共聚物市售产品有赢创工业股份有限公司的resomer®rg503，分子量为30000端基为烷基酯的聚乳酸-羟基乙酸共聚物市售产品有赢创工业股份有限公司的resomer®rg503h。
本发明先将芹菜素与磷脂制成磷脂复合物，磷脂复合物可改善芹菜素的溶解性和亲和性，进而利于聚乳酸-羟基乙酸共聚物对芹菜素磷脂复合物的负载，可提高芹菜素的包封率和载药量；本发明采用特定聚乳酸-羟基乙酸共聚物复配物负载芹菜素磷脂复合物，然后制备成冻干粉，即得芹菜素缓释制剂，其缓释时间在4-12小时，与化妆品通常在皮肤上的停留时间相契合，同时芹菜素缓释制剂中芹菜素溶解性好、稳定性高。
以下为本发明所制备的芹菜素缓释制剂载药量、包封率及稳定性测试试验。
包封率和载药量测定：称取实施例1制备的芹菜素缓释制剂的混悬液，加入到离心管中，1000r/min离心10min，取下层滤液用高效液相色谱法（hplc）测定。另外称取同等量的芹菜素缓释制剂混悬液，加入甲醇后通过超声破坏，取上清液过滤膜，用hplc法测定。其中
稳定性测试：将本发明实施例1制备的芹菜素缓释制剂在安瓿中密封0d、7d、14d、21d、28d，置于4℃的冰箱中保存，分别考察不同放置时间样品的包封率变化情况，具体见表1。
表1包封率随时间的变化情况
芹菜素缓释制剂在4℃的冰箱中保存一个月后，没有出现分层的现象。同时由表1数据可知，芹菜素缓释制剂中芹菜素的包封率并没有随着时间的延长发生明显的改变，贮存28天包封率仅降低1.33%，由此可说明本发明制备的芹菜素缓释制剂稳定性好。
以下为本发明所制备的芹菜素缓释制剂的体外释放测试说明：
体外释放测试方法：（1）量取50ml去离子水加入到缓释容器锥形瓶中，水浴锅温度设置为37℃（模拟人的体温）；（2）当缓释介质去离子水的温度达到37℃时，将制得的芹菜素缓释制剂加入到缓释介质中进行缓释，并开始计时；（3）每隔一段时间用移液枪取样1ml，并稀释10倍后用紫外分光光度计测定波长伟337nm处的吸光度值。每次取完样后补充等量的去离子水，计算芹菜素缓释制剂的缓释率。芹菜素缓释制剂的缓释结果如见表2。
表2芹菜素缓释制剂不同时间的体外释放率
由表2可知，芹菜素缓释制剂的缓释率随时间的增加不断提高，4h内芹菜素可缓释50%以上，12h内的累积释放量达到98.45%，基本缓释完全。说明本发明可将芹菜素的缓释时间控制在化妆品普遍在皮肤上的停留时间内，即4-12小时。
本发明先采用卵磷脂与芹菜素复合，再用特定聚乳酸-羟基乙酸共聚物复配物对其进行负载，制备的芹菜素缓释制剂具有以下优点：能提高芹菜素的溶解性，改善芹菜素的稳定性，包封率不低于70%，载药量不低于4%，能将缓释时间控制在4-12小时内，同时还具有使用方便、安全性高、皮肤亲和性好、生物利用度高，适合应用于护肤品中等优点。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明并不局限于以下实施例。
实施例1：一种芹菜素缓释制剂的制备方法，其特征在于：采用以下步骤：
a、按质量比1：2：50称取芹菜素、大豆卵磷脂和无水乙醇，35℃恒温磁力搅拌2h，混合均匀，得芹菜素磷脂复合物溶液；
b、按质量比1：50称取聚乳酸-羟基乙酸共聚物（plga）复配物和步骤a所得芹菜素磷脂复合物溶液，50℃恒温磁力搅拌2h，再常压蒸馏去除无水乙醇，得plga负载的芹菜素磷脂复合物；所述聚乳酸-羟基乙酸共聚物（plga）复配物由分子量为30000端基为烷基酯的聚乳酸-羟基乙酸共聚物（resomer®rg503）与分子量为28000端基为自由羧酸的聚乳酸-羟基乙酸共聚物（resomer®rh503h）按照质量比1：1-5复配而成；resomer®rg503和resomer®rh503h均采购自赢创工业股份有限公司；
c、按质量比1：15称取步骤b所得plga负载的芹菜素磷脂复合物和去离子水进行混合，利用高速分散机8000rpm分散10min，得plga负载的芹菜素磷脂复合物的预混液；
d、按质量比1：2称取甘露醇和去离子水，搅拌溶解完全，得冻干保护剂水溶液；
e、按质量比1：5称取步骤c所得芹菜素磷脂复合物的预混液和步骤d所得冻干保护剂水溶液，采用高压均质机在压力120mpa下均质15次，然后在-45℃、常压下预冻干36h，最后在-55℃、0.1mpa的条件下冷冻干燥24h，得plga负载的芹菜素磷脂复合物冻干粉，即芹菜素缓释制剂。
上述方法制备的芹菜素缓释制剂包封率达到82.58%，载药量为5.06%，12h体外释放量98.45%。
实施例2：一种芹菜素缓释制剂的制备方法，其特征在于：采用以下步骤：
a、按质量比1：3：50称取芹菜素、大豆卵磷脂和无水乙醇，30℃恒温磁力搅拌1h，混合均匀，得芹菜素磷脂复合物溶液；
b、按质量比1：40称取聚乳酸-羟基乙酸共聚物（plga）复配物和步骤a所得芹菜素磷脂复合物溶液，45℃恒温磁力搅拌1h，再常压蒸馏去除无水乙醇，得plga负载的芹菜素磷脂复合物；所述聚乳酸-羟基乙酸共聚物（plga）复配物由分子量为30000端基为烷基酯的聚乳酸-羟基乙酸共聚物（resomer®rg503）与分子量为28000端基为自由羧酸的聚乳酸-羟基乙酸共聚物（resomer®rh503h）按照质量比1：1-5复配而成；resomer®rg503和resomer®rh503h均采购自赢创工业股份有限公司；
c、按质量比1：20称取步骤b所得plga负载的芹菜素磷脂复合物和去离子水进行混合，利用高速分散机8000rpm分散5min，得plga负载的芹菜素磷脂复合物的预混液；
d、按质量比1：2称取甘露醇和去离子水，搅拌溶解完全，得冻干保护剂水溶液；
e、按质量比1：7称取步骤c所得芹菜素磷脂复合物的预混液和步骤d所得冻干保护剂水溶液，采用高压均质机在压力120mpa下均质8次，然后在-45℃、常压下预冻干36h，最后在-55℃、0.1mpa的条件下冷冻干燥24h，得plga负载的芹菜素磷脂复合物冻干粉，即芹菜素缓释制剂。
上述方法制备的芹菜素缓释制剂包封率达到76.58%，载药量为4.53%，12h体外释放量90.27%。
实施例3：一种芹菜素缓释制剂的制备方法，其特征在于：采用以下步骤：
a、按质量比1：1：50称取芹菜素、大豆卵磷脂和无水乙醇，50℃恒温磁力搅拌3h，混合均匀，得芹菜素磷脂复合物溶液；
b、按质量比1：30称取聚乳酸-羟基乙酸共聚物（plga）复配物和步骤a所得芹菜素磷脂复合物溶液，50℃恒温磁力搅拌3h，再常压蒸馏去除无水乙醇，得plga负载的芹菜素磷脂复合物；所述聚乳酸-羟基乙酸共聚物（plga）复配物由分子量为30000端基为烷基酯的聚乳酸-羟基乙酸共聚物（resomer®rg503）与分子量为28000端基为自由羧酸的聚乳酸-羟基乙酸共聚物（resomer®rh503h）按照质量比1：1-5复配而成；resomer®rg503和resomer®rh503h均采购自赢创工业股份有限公司；
c、按质量比1：10称取步骤b所得plga负载的芹菜素磷脂复合物和去离子水进行混合，利用高速分散机8000rpm分散5min，得plga负载的芹菜素磷脂复合物的预混液；
d、按质量比1：2称取甘露醇和去离子水，搅拌溶解完全，得冻干保护剂水溶液；
e、按质量比1：5称取步骤c所得芹菜素磷脂复合物的预混液和步骤d所得冻干保护剂水溶液，采用高压均质机在压力130mpa下均质15次，然后在-45℃、常压下预冻干36h，最后在-55℃、0.1mpa的条件下冷冻干燥24h，得plga负载的芹菜素磷脂复合物冻干粉，即芹菜素缓释制剂。
上述方法制备的芹菜素缓释制剂包封率达到79.78%，载药量为4.71%，12h体外释放量94.65%。
实施例4：一种芹菜素缓释制剂的制备方法，其特征在于：采用以下步骤：
a、按质量比1：2：50称取芹菜素、大豆卵磷脂和无水乙醇，35℃恒温磁力搅拌1.5h，混合均匀，得芹菜素磷脂复合物溶液；
b、按质量比1：45称取聚乳酸-羟基乙酸共聚物（plga）复配物和步骤a所得芹菜素磷脂复合物溶液，50℃恒温磁力搅拌1.5h，再常压蒸馏去除无水乙醇，得plga负载的芹菜素磷脂复合物；所述聚乳酸-羟基乙酸共聚物（plga）复配物由分子量为30000端基为烷基酯的聚乳酸-羟基乙酸共聚物（resomer®rg503）与分子量为28000端基为自由羧酸的聚乳酸-羟基乙酸共聚物（resomer®rh503h）按照质量比1：1-5复配而成；resomer®rg503和resomer®rh503h均采购自赢创工业股份有限公司；
c、按质量比1：15称取步骤b所得plga负载的芹菜素磷脂复合物和去离子水进行混合，利用高速分散机8000rpm分散5min，得plga负载的芹菜素磷脂复合物的预混液；
d、按质量比1：2称取甘露醇和去离子水，搅拌溶解完全，得冻干保护剂水溶液；
e、按质量比1：6称取步骤c所得芹菜素磷脂复合物的预混液和步骤d所得冻干保护剂水溶液，采用高压均质机在压力140mpa下均质12次，然后在-45℃、常压下预冻干36h，最后在-55℃、0.1mpa的条件下冷冻干燥24h，得plga负载的芹菜素磷脂复合物冻干粉，即芹菜素缓释制剂。
上述方法制备的芹菜素缓释制剂包封率达到77.49%，载药量为4.62%，12h体外释放量91.66%。
实施例5：一种芹菜素缓释制剂的制备方法，其特征在于：采用以下步骤：
a、按质量比1：1：50称取芹菜素、大豆卵磷脂和无水乙醇，30℃恒温磁力搅拌2h，混合均匀，得芹菜素磷脂复合物溶液；
b、按质量比1：35称取聚乳酸-羟基乙酸共聚物（plga）复配物和步骤a所得芹菜素磷脂复合物溶液，48℃恒温磁力搅拌2h，再常压蒸馏去除无水乙醇，得plga负载的芹菜素磷脂复合物；所述聚乳酸-羟基乙酸共聚物（plga）复配物由分子量为30000端基为烷基酯的聚乳酸-羟基乙酸共聚物（resomer®rg503）与分子量为28000端基为自由羧酸的聚乳酸-羟基乙酸共聚物（resomer®rh503h）按照质量比1：1-5复配而成；resomer®rg503和resomer®rh503h均采购自赢创工业股份有限公司；
c、按质量比1：15称取步骤b所得plga负载的芹菜素磷脂复合物和去离子水进行混合，利用高速分散机8000rpm分散8min，得plga负载的芹菜素磷脂复合物的预混液；
d、按质量比1：2称取甘露醇和去离子水，搅拌溶解完全，得冻干保护剂水溶液；
e、按质量比1：5称取步骤c所得芹菜素磷脂复合物的预混液和步骤d所得冻干保护剂水溶液，采用高压均质机在压力110mpa下均质10次，然后在-45℃、常压下预冻干36h，最后在-55℃、0.1mpa的条件下冷冻干燥24h，得plga负载的芹菜素磷脂复合物冻干粉，即芹菜素缓释制剂。
上述方法制备的芹菜素缓释制剂包封率达到80.04%，载药量为4.82%，12h体外释放量94.86%。