一种盐肤木有效部位的富集纯化工艺的制作方法

本发明属于中药有效部位纯化领域，尤其涉及一种盐肤木酚酸类有效部位的富集纯化工艺。

背景技术

盐肤木(rhuschinensismill.)为漆树科盐肤木属落叶小乔木。《开宝本草》记载盐肤木有祛风化湿、消肿软坚、生津润肺、降火化痰、收敛解毒等功效，民间常用盐肤木作治疗肺虚咳嗽、胸痛等症状。传统中医认为盐肤木具有利水消肿、活血化瘀、散气止痛的作用。根据现代药理学的研究，盐肤木具有改善冠状动脉循环和血液流变性的作用。

经过研究发现，盐肤木中总酚酸具有缓解心衰等作用，目前还没有以总酚酸为指标，优化盐肤木有效部位纯化工艺的研究。如李加林，吴素珍，卑占宇.盐肤木总黄酮提取工艺研究[j].时珍国医国药，2009,20(05):1116-1117.，探讨了盐肤木中总黄酮的提取工艺，但未涉及盐肤木中酚酸类化合物。

需要提供一种盐肤木总酚酸的制备工艺。

技术实现要素：

为解决上述问题，本发明提供了一种盐肤木总酚酸部位的制备方法。

本发明盐肤木总酚酸部位的制备方法，它包括如下步骤：

(1)提取：取盐肤木粉末，加入50～70％乙醇提取，过滤，取滤液，减压浓缩滤液至无醇味，得盐肤木总酚酸溶液；

(2)大孔树脂纯化：取盐肤木总酚酸溶液，采用大孔树脂动态吸附，水洗除杂，采用50～90％的乙醇溶液洗脱，得盐肤木总酚酸。

步骤(1)中，所述动态吸附是指盐肤木总酚酸溶液以一定速度通过大孔树脂，目标成分被吸附在树脂上。

步骤(1)中，所述盐肤木粉末是过45目筛的粉末。

步骤(1)中，盐肤木根茎粉末与乙醇的料液比为1:(20～25)，优选1：20。

步骤(1)中，所述提取为回流提取；和/或，提取的时间为60～90min。

步骤(1)中，提取的次数为2次。

步骤(2)中，所述大孔树脂型号为hpd-600、hp2mgl、sp825l，优选sp825l。

步骤(2)中，所述大孔树脂柱的径高比为1:5，1:10，1:15，优选1:5。

步骤(2)中，所述盐肤木总酚酸溶液的量以盐肤木总酚酸溶液与树脂的干粉的质量比为0.8：1；和/或，所述动态吸附速度为1bv·h^-1。

步骤(2)中，所述水洗除杂的流速为1～3bv·h^-1，优选2bv·h^-1；和/或，水的用量为4bv。

步骤(2)中，所述乙醇的流速为2～6bv·h^-1，优选2bv·h^-1。

本发明的一种盐肤木有效部位的富集纯化工艺，得到的提取物具有更高的盐肤木总酚酸得率，为盐肤木总酚酸的工业化生产提供了合理、经济、简便的纯化生产工艺。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1没食子酸标准曲线

图2总酚酸提取率的影响因素之溶剂浓度

图3总酚酸提取率的影响因素之料液比

图4总酚酸提取率的影响因素之提取时间

图5总酚酸提取率的影响因素之提取次数

图612种大孔树脂静态吸附量和解吸量比较

图73种大孔树脂动态吸附量和解吸量比较

图8sp825l树脂泄漏曲线考察结果

图9上样流速的考察结果

图10洗脱曲线考察结果

具体实施方式

实施例1总酚酸富集纯化工艺

(1)盐肤木总酚酸的提取：

称取粉碎过筛(45目)后的盐肤木粗粉300g，加20倍量体积分数70％乙醇溶液，提取前浸渍30min，然后回流提取90min，提取2次，合并两次滤液，减压浓缩到无醇味，即得盐肤木总酚酸溶液。

(2)盐肤木总酚酸的分离纯化：

a、大孔树脂预处理：

用95％乙醇充分浸泡9g的sp825l大孔树脂，24h后进行湿法装柱，装柱后大孔树脂柱的径高比为1:5。首先用95％乙醇洗脱柱床，直至流出液与5倍量蒸馏水混合不出现白色混浊，再用大量蒸馏水洗至流出液无醇味即可，放置备用。

b、分离纯化总酚酸：

取步骤(1)制备的盐肤木总酚酸提取液，通过步骤a处理好的大孔树脂。盐肤木总酚酸的量以盐肤木总酚酸溶液与树脂的干粉的质量比0.8：1上样，以1bv·h^-1的速度进行动态吸附；完全吸附后，分别用4bv除杂溶剂水、以2bv·h^-1洗脱，再用4bv富集溶剂50％乙醇，以2bv·h^-1洗脱。收集洗脱液。

以下通过实验例具体说明本发明的有益效果。

实验例1盐肤木总酚酸的提取

仪器与试药

1仪器

岛津uv-1800型可见分光光度计(日本岛津)，cpa225d型十万分之一天平(赛多利斯科学仪器有限公司产品)，shb-iii型循环水多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司)，lx-07a型多功能粉碎机(上海江信科技有限公司)，hh-z型数显恒温水浴锅(常州国华电器公司)。

2试药

盐肤木(批号15122201，安徽协和成药业饮片有限公司)，经过福建中医药大学药学院范世明高级实验师鉴定为盐肤木rhuschinensismill.的干燥根茎，样品存放于福建中医药大学生物医药研发中心；没食子酸对照品(中国食品药品检定研究院)；无水碳酸钠(ar)，磷钼钨酸试剂(ar)，乙醇(ar)均购自国药集团化学试剂有限公司。

3提取方法

3.1溶液的配制

3.1.1对照品溶液：精密称取没食子酸对照品12.5mg于25ml棕色容量瓶中，加水充分溶解，稀释至25ml，摇匀，精密量取续滤液5ml至25ml容量瓶并加水定容,摇匀，即得。(此时浓度为0.05mg/ml)。

3.1.2供试品溶液：将盐肤木的根茎粉碎，过45目筛，加入70％乙醇浓度，80℃回流提取90min，过滤，精密量取续滤液10ml置于100ml棕色容量瓶中，加超纯水稀释至100ml，摇匀，即得。

3.1.3标准曲线的建立吸取0.05mg/ml没食子酸标准液0.5，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0ml，分别置于25ml棕色容量瓶中，各加入磷钼钨酸试液1ml，再分别精密加入水11.5、11.0、10.0、9.0、8.0、7.0ml，用29％碳酸钠溶液稀释至刻度，摇匀，放置35min，以相应试剂为空白，按照紫外一可见分光光度法(《中国药典》2015年版一部附录va)在760nm波长处测定吸光度。以吸光度(y)为纵坐标，检测浓度(x)为横坐标，绘制标准曲线，结果见图1。经线性回归，得回归方程y＝89.874x+0.0223,r＝0.999。结果表明，没食子酸在1.0μg/ml～10.0μg/ml范围内，线性关系良好。

3.2福林酚法测定酚酸的含量精密吸取供试品溶液0.5ml，置25ml棕色量瓶中，按照“3.1.3”项下方法测定吸光度，代入标准曲线，计算出酚酸浓度，从而算出总酚量。

3.2单因素考察

3.2.1提取乙醇浓度对总酚酸提取率的影响

分别精确称取盐肤木粉末各5g置于5个锥形瓶中，各加入15倍量浓度为40％、50％、60％、70％、80％的乙醇浸渍30min，回流提取60min后，按照方法“3.1.3”项下测定盐肤木中总酚酸的含量，考察乙醇浓度对盐肤木中总酚酸提取率的影响。结果由图2可知，在40％-70％乙醇浓度之间，总酚酸提取率与乙醇浓度成正相关，但当乙醇浓度在60％-70％乙醇浓度之间，总酚酸的提取率变化不大，在70％乙醇浓度之后，随着乙醇浓度的增大，总酚酸的提取率反而下降。为考虑节约乙醇。因此选择多因素设计选择的提取溶剂浓度为50％～70％。

3.2.2提取料液比对总酚酸提取率的影响

分别精确称取盐肤木粉末各5g置于5个锥形瓶中，各加入5、10、15、20、25倍量的70％乙醇浸渍30min，回流提取60min后，按照方法“3.1.3”项下测定盐肤木中总酚酸的含量，考察料液比对盐肤木中总酚酸提取率的影响。结果如图3，随着料液比的增大总酚酸的提取率逐渐增大，在料液比为1:20后，总酚酸的提取率基本稳定。因此多因素设计选择的料液比为1:15～1:25。

3.2.3提取时间对总酚酸提取率的影响

分别精确称取盐肤木粉末各5g置于锥形瓶中，加入20倍量的70％乙醇浸渍30min，分别回流提取30min、60min、90min、120min、150min，后，按照方法“3.1.3”项下测定盐肤木中总酚酸的含量，考察提取时间对盐肤木中总酚酸提取率的影响。结果如图4，随着提取时间的增长，总酚酸提取率逐渐上升，但是在提取时间为90min之后总酚酸的提取率基本不变。为了减少提取时间。因此多因素设计选择的提取时间为60～120min。

3.2.4提取次数对总酚酸提取率的影响

精确称取盐肤木粉末5g置于锥形瓶中，加入20倍量的70％乙醇浸渍30min，回流提取90min后，过滤得一次提取液，将滤渣再加入20倍量的70％乙醇同一次提取液步骤提取，得二次提取液，三次提取液同二次提取液法操作，按照方法“3.1.3”项下分别测定前后三次提取液中盐肤木中总酚酸的含量，考察提取次数对盐肤木中总酚酸提取率的影响。结果如图5，第一次的提取率最高，第二次次之，第三次开始总酚酸的提取率几乎为0，因此多因素考察的提取次数为2次。

3.2.5多因素试验

多因素试验法对盐肤木中总酚酸提取条件优化，综合单因素实验结果，以料液比、提取时间、提取次数以及乙醇浓度为考察因素，以总酚酸的提取率为响应值设计试验，见表1和表2。

表1多因素试验各因素水平表

多因素实验安排以及结果如表2所示：

表2多因素试验安排及结果

如表2可以看出，当提取溶剂为50～70％的乙醇，料液比为1:(20～25)，提取次数为2次，提取时间为60～90min时(试验号为2、9、10号)，提取率较高，优选提取溶剂为50～70％的乙醇，料液比1:20，提取次数为2次，提取时间为90min时(试验号为2、10号),提取率超过3.5％；最佳回流提取工艺为a3b2c2d2，即70％乙醇，料液比1:20，提取2次，提取时间90min。按照多因素实验结果，最佳的提取方式为：取盐肤木药材5g加入20倍量70％乙醇，提取前浸渍30min，然后回流提取90min，前后提取2次。

实验例2盐肤木总酚酸的纯化

仪器与材料

1仪器

uv9100型紫外可见分光光度计(北京瑞利分析仪器公司)；cpa225d型十万分之一分析天平(德国sartorius公司)；万分之一天平(赛多利斯科学仪器有限公司)；kq-500e型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；fy135型中草药粉碎机(天津市泰斯特仪器有限公司)；hc-2068高速离心机(安徽中佳科学仪器有限公司)；zhwy-200d型恒温培养振荡器(上海智城分析仪器制造有限公司)；re-2000a旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂)；shb-iii循环水式多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司)；kw-1000dc型恒温水浴锅hh-1(国华电器有限公司)；烘箱。

2试药

盐肤木提取液：用盐肤木(批号15122201，安徽协和成药业饮片有限公司)，经过福建中医药大学药学院范世明高级实验师鉴定为盐肤木rhuschinensismill.的干燥根茎，经20倍量70％乙醇，回流提取时间90min，前后提取2次浓缩得到总酚酸4.73mg·ml^-1的提取液。

没食子酸对照品(中国食品药品检定研究院，批号110831-201204)；大孔树脂hpd-100、hpd-300、hpd-450、hpd-600、hpd-700、ab-8、dm-130、d101、xad-2(沧州宝恩吸附材料科技有限公司)，大孔树脂hp-20、hp2mgl、sp825l(绿百草科技)；无水碳酸钠(ar)，磷钼钨酸试剂(ar)，乙醇(ar)均购自国药集团化学试剂有限公司。

3纯化方法

3.1大孔树脂筛选

3.1.1大孔树脂预处理

用95％乙醇充分浸泡的大孔树脂，24h后进行湿法装柱，首先用95％乙醇洗脱柱床，直至流出液与5倍量蒸馏水混合不出现白色混浊，再用大量蒸馏水洗至流出液无醇味即可，放置备用。

3.1.2静态吸附-解吸实验

称取12种处理好的大孔树脂(hpd-100、hpd-300、hpd-450、hpd-600、hpd-700、ab-8、dm-130、hp-20、hp2mgl、sp825l、d101、xad-2)各2g，分别加入10ml盐肤木提取液，置50ml离心管中，于恒温摇床中以转速150r·min^-1，37℃，振荡24h，取出分别离心，测定吸附余液体积后，测定a值，计算吸附液的浓度。将静态吸附后的12种大孔树脂用移液枪吸干后，分别加入95％乙醇20ml置50ml离心管中，其余操作同上，测定解吸液体积后，测定解吸液a值，计算解吸液的总酚酸浓度。按1-1、1-2式计算静态吸附量、解吸量、吸附率及解析率。

吸附量＝(c0-c1)v1/m，解吸量＝c2×v2/m(1-1)

吸附率＝(c0-c1)/c0，解析率＝(c2×v2)/((c0-c1)×v))(1-2)

其中：c0-吸附前样液中总酚酸浓度(mg·ml^-1)，c1-吸附余液中总酚酸浓度(mg·ml^-1)，c2-解吸液中总酚酸浓度(mg·ml^-1)，v1-吸附余液体积(ml)，v2-解吸液体积(ml)，m-干树脂的质量(g)。

结果见表3及图6。可知，hpd-600、hp2mgl、sp825l这三种树脂对盐肤木总酚酸的吸附率都超过了58％，而且解析率均超过了45％。三种树脂吸附和解吸效果相差不大，故选用这三种树脂进一步做动态吸附考察，选择最佳树脂。

表312种大孔树脂静态吸附性和解吸性的比较

3.1.3动态吸附实验

移取3份盐肤木提取液，各30ml，分别通过3种不同型号(hpd-600、hp2mgl、sp825l)已处理好的大孔树脂柱(干树脂量9g)，进行动态吸附；完全吸附后，先用足量水洗至流出液近无色，再用90ml的95％乙醇进行洗脱。依次收集残留液及乙醇洗脱液，分别测定各溶液中总酚酸的量，以其吸附量、吸附率、解析量和解析率为评价指标，筛选最佳树脂。结果见表4及图7，可知，sp825l大孔树脂对盐肤木中总酚酸的吸附量、吸附率、解吸量及解析率均相对较好，故最终选择sp825l树脂作为盐肤木提取液的纯化树脂。

表43种大孔树脂动态吸附考察

3.2sp825l树脂分离纯化总酚酸的工艺

3.2.1盐肤木总酚酸上样量的考察

量取浓度为0.3g·ml^-1的盐肤木总酚酸30ml，以0.45bv·h^-1(1bv＝20ml)流速通过已处理好的sp825l型大孔树脂柱(干树脂量9g)，进行动态吸附；分段收集流出液，每3ml收集一份，测定总酚酸的含量，并绘制相应的泄漏曲线。结果见图8，由此可见，刚开始流出液的a值特别小，吸附效率则很好，当上样量增加到24ml，开始明显地泄漏，并逐渐接近饱和吸附。为了减少有效成分的损失，因此确定最大盐肤木总酚酸上样量为24ml，按盐肤木总酚酸换算0.8g·g^-1(盐肤木总酚酸/树脂)。

3.2.2盐肤木总酚酸上样流速的考察

量取三份盐肤木提取液进行上样，上样液各25ml，分别以1bv·h^-1、2bv·h^-1、3bv·h^-1(1bv＝20ml)流速通过已处理好的sp825l型大孔树脂柱(干树脂量9g)进行吸附，分别取出吸附余液，测定余液体积，再用30ml95％乙醇洗脱解吸，测定解吸液体积，分别测定吸附余液和解吸液的总酚酸含量。结果见表5及图9，结果表明，吸附率随着吸附流速的加快而降低，当流速小的话，样液与树脂接触的时间比较长，可以被树脂充分的吸附，从而使吸附率提高，最终确定最佳吸附流速为1bv·h^-1。

表5上样流速的考察结果

3.3.3洗脱曲线考察

量取盐肤木提取液120ml，通过已处理好的sp825l大孔树脂柱(干树脂量54g)，进行动态吸附；完全吸附后，分别用水、不同浓度(30％、50％、95％)的乙醇以2bv·h^-1流速进行洗脱。每1bv(1bv＝80ml)收集洗脱液，测定每份的干膏重及含量，以锥形瓶编号为横坐标，含量为纵坐标，绘制洗脱曲线。结果见表6及图10，由此可知，用水洗脱时，几乎没有总酚酸伴随洗脱下来，30％乙醇洗脱时，少量总酚酸开始被洗脱下来，50％乙醇洗脱时，能将吸附在树脂内的总酚酸基本洗脱干净。故最佳的纯化实验方法为：水为除杂溶剂，50％乙醇为富集溶剂，用量均为4个bv。

表6洗脱曲线总酚酸含量测定结果

3.3.4多因素法选择流速和径高比

量取9份盐肤木提取液，上样液各20ml，分别通过已处理好的不同径高比的sp825l大孔树脂柱(干树脂量9g)，采用多因素对分离纯化过程中的主要因素除杂溶剂流速、富集溶剂流速及径高比进行考察(见表7)确定较优树脂纯化工艺条件。

表7多因素设计因素水平表

表8多因素设计实验结果

从表8可以看出，最佳优选组合为径高比为1:5，除杂流速为2bv·h^-1，富集流速为2bv·h^-1。

前述实验，得到最佳分离方法为：选用sp825l大孔树脂，盐肤木总酚酸的量：盐肤木总酚酸0.8g·g^-1干树脂，吸附流速：1bv·h^-1，除杂溶剂为水，用量为4个bv，富集总酚酸的溶剂为50％乙醇、用量为4bv，径高比：1:5，除杂流速：2bv·h^-1，富集流速：2bv·h^-1。

本发明方法可以提高盐肤木总酚酸得率，为盐肤木总酚酸的工业化生产提供了合理、经济、简便的纯化生产工艺。