本发明涉及落叶松阿拉伯半乳聚糖组合物的配伍和提取制备方法,属于生物技术领域。
背景技术：
阿拉伯半乳聚糖的主要来源是落叶松树（larixsp.），虽然落叶松阿拉伯半乳聚糖从两种来源中提取-西部落叶松（larixoccidentalis）或蒙古落叶松（larixdahurica）,但大多数落叶松都可以生产阿拉伯半乳聚糖。落叶松阿拉伯半乳聚糖是一种干燥，自由流动的粉末，具有非常轻微的松香气味和甜味。它是100％水溶性的并且是低粘度的溶液。由于其优异的溶解性和温和的味道，粉末容易混合在水和果汁中方便服用。
落叶松阿拉伯半乳聚糖（arabinogalactans）是一类长且多分枝的多糖。在自然界中，阿拉伯半乳聚糖存在于几种微生物体系中，特别是耐酸的分枝杆菌中，它在肽聚糖和霉菌酸之间作为细胞壁的一种复合组分，并且影响单核细胞巨噬细胞结核抗原的免疫反应性。许多植物都含有丰富的阿拉伯半乳聚糖，大多数以糖蛋白形式结合苏氨酸，脯氨酸或丝氨酸（“阿拉伯半乳聚糖蛋白”）的蛋白质骨架。这些植物包括韭菜籽，胡萝卜，萝卜，黑豆，梨，玉米，小麦，红酒，意大利黑麦草，西红柿，豚草，高粱，竹子草，椰子肉和牛奶中。许多草药具有良好的免疫增强性能，如紫锥菊，西崖柏，当归和姜黄,其中都含有大量的阿拉伯半乳聚糖。所有从落叶松分离的阿拉伯半乳聚糖是3,6-β-d-半乳聚糖型的水溶性无氮多糖。实验分析确定落叶松阿拉伯半乳聚糖是具有3,6-半乳聚糖主链的高度分支化分子。半乳糖和阿拉伯糖单位（由β-吡喃半乳糖，β-阿拉伯呋喃糖和β-阿拉伯吡喃糖）的摩尔比为约6:1，并且包含总糖基含量大于99％。微量葡萄糖醛酸一般也是很常见的。高级落叶松阿拉伯半乳聚糖（通常用于临床应用的等级）由大于98％的阿拉伯半乳聚糖组成。
落叶松阿拉伯半乳聚糖的药代动力学：在口服剂量下落叶松阿拉伯半乳聚糖的药代动力学尚未在人体中得到很好的阐述。在口服一定剂量后吸收落叶松阿拉伯半乳聚糖的绝对浓度尚不清楚，然而，未吸收的落叶松阿拉伯半乳聚糖由胃肠微生物菌群剧烈发酵。
在动物模型中，注射后，从血液中清除落叶松阿拉伯半乳聚糖，半衰期为3.8分钟。注射后90分钟，肝脏（52.5％）和尿液（30％）中的浓度最高，一级动力学后的肝脏清除率和半衰期为3.42天。已知源自西部落叶松的纯化阿拉伯半乳聚糖是已知的体外与肝脏无唾液酸糖蛋白受体结合。体内实验证据也证明了这种与肝脏无唾液酸糖蛋白受体结合的性质。通过门脉循环到达肝脏的阿拉伯半乳聚糖通过受体介导的胞吞作用在肝细胞内迅速并特异性内化。由于落叶松阿拉伯半乳聚糖到达肝脏的比例很高，并且其对肝细胞的主动摄取，groman等人认为阿拉伯半乳聚糖可能是向肝脏递送药物的理想载体。
证据还表明，人类食用落叶松阿拉伯半乳聚糖对增强肠道微生物群落，特别是增加厌氧菌如双歧杆菌和乳酸杆菌，同时降低梭状芽孢杆菌具有显著作用。通过肠道微生物区系将碳水化合物发酵成短链脂肪酸（scfas），现在被认为对大肠功能至关重要，并且可能是肝脏和外周组织代谢的促成因素。丁酸在结肠健康中起着重要作用，它是结肠上皮细胞产生能量的首选底物，据信它可以保护粘膜抵抗多种肠道疾病，并且已经显示它们可以保护这些细胞免受癌症促进剂的影响。阿拉伯半乳聚糖增加丁酸盐浓度的能力表明，口服给药后，一些显著的健康益处是阿拉伯半乳聚糖通过肠道微生物菌群剧烈发酵，导致产生scfas。scfa的高产量表明几乎完全通过没有任何吸收的肠道微生物菌群发酵阿拉伯半乳聚糖，通过大肠转运。在vince等人的一项研究中，使用了体外粪便培养系统研究肠道细菌对复合碳水化合物的代谢。人粪便匀浆与厌氧培养基中加入乳果糖，果胶，阿拉伯半乳聚糖和纤维素，在受试者均已经预先喂食每种碳水化合物之前和之后。添加的底物的发酵通过产生短链脂肪酸并在孵育数小时内抑制净氨产生来评估，该作者报道阿拉伯半乳聚糖在任何时候都会提高所有样品中scfas和乙酸的产量，所有样品中丁酸的浓度均超过丙酸。与对照组比较，同纤维素一起培养的粪便匀浆没有显示出更多的scfa产量。englyst等人研究了人类粪便细菌对落叶松阿拉伯半乳聚糖和其他三种多糖的分解，观察不同多糖底物中scfas的产生。他们发现了骨架和侧链糖阿拉伯半乳聚糖共同用作发酵底物，然而，这些糖比淀粉或果胶分解得更慢。他们的实验表明阿拉伯半乳聚糖在增加丙酸盐浓度方面特别有益。虽然淀粉是产生高丁酸浓度的最有效的多糖，但阿拉伯半乳聚糖比较果胶或木聚糖，具有明显更高的丁酸生成。预先给予阿拉伯半乳聚糖的受试者降低氨产生，然而，对于所有膳食纤维而言，这种作用并不常见，因为纤维素已被证明对氨的生成没有影响。vince等人提出阿拉伯半乳聚糖因为这种能力降低了氨的产生以及随后的吸收，因此具有医疗价值。阿拉伯半乳聚糖可以促进双歧杆菌的增加，特别是长双歧杆菌，这似乎对发酵阿拉伯半乳聚糖具有最大的特异性。在人类志愿者中进行对落叶松阿拉伯半乳聚糖补充剂的对照研究之后，未发表的证据同样表明能够促进双歧杆菌以及其他厌氧菌如乳酸杆菌的增加。也许这是最大的潜力多糖，是一种生物反应以支持传统的癌症治疗。其免疫增强的组合属性以及它的抗转移活性满足两种治疗上需要的目标。虽然改性柑橘果胶在传统和替代品中都受到关注，替代医学期刊上发表的抗转移活性，落叶松阿拉伯半乳聚糖的作用基本上是相同的方式，即通过抑制转移细胞附着于肝脏通过与肝脏竞争结合肝脏组织的半乳糖受体；然而，落叶松阿拉伯半乳聚糖还提供额外的增强免疫功能的优势。
虽然这种新型多糖的临床应用研究，迄今尚未进行过，其生理活性表明其具有广泛的潜在的治疗作用。作为饮食纤维补充剂，落叶松阿拉伯半乳聚糖具有几个有益的作用，包括促进友善菌生长的能力，增加scfa的产量，并且减少氨的产生。由于大多数饮食缺乏膳食纤维，既能调节免疫力，同时又提高纤维摄入量，表明具有双重作用，这种独特的多糖不愧为是一种优势膳食纤维。
落叶松阿拉伯半乳聚糖用于医学，落叶松阿拉伯半乳聚糖用于感染，包括感冒，流感，h1n1（猪）流感，儿童耳部感染和艾滋病毒/艾滋病。它也用于治疗肝癌，以及由肝损伤（肝性脑病）引起的大脑疾病。也有人用作膳食纤维，降低胆固醇，并增强免疫系统。落叶松阿拉伯半乳聚糖作为友好肠道细菌的食物，就是我们所说的“益生元”，因此，当它消耗时，它对肠道中的微生物群产生积极影响。它通过提供微生物菌群发酵的物质来实现这一点，从而导致产生短链脂肪酸（scfa），例如丁酸盐和丙酸盐。这些scfa对结肠的健康至关重要，足量的短链脂肪酸可能有助于防止炎症性肠病和结肠癌的发展。
一种从落叶松及其加工剩余物中提取二氢槲皮素和阿拉伯半乳聚糖的方法（cn200710144650.3）指出，从落叶松及其加工剩余物中提取二氢槲皮素的方法:粉碎、热水浸泡，浸泡液加入低碳醇，使之沉淀，所得沉淀物就是阿拉伯半乳聚糖，低碳醇溶液中既是要提取的二氢槲皮素。我们发现该方法之不足,会把溶于热水的很多种杂质带入阿拉伯半乳聚糖中，从而增加阿拉伯半乳聚糖的纯化程序及难度。如果先行用低碳醇溶液处理落叶松粉末既能减少阿拉伯半乳聚糖提取过程中杂质的引入，同时又能增加二氢槲皮素的收率。一种落叶松阿拉伯半乳聚糖的提取方法（cn104961841a），该方法揭示：落叶松木片粉碎，用石油醚浸泡脱脂，脱脂落叶松木粉用氯化1-丁基-3-甲基咪唑离子液体溶液提取阿拉伯半乳聚糖，得提取液，将提取液加入乙醇溶液中得到沉淀物，将沉淀物过滤，滤饼干燥即得落叶松阿拉伯半乳聚糖。该方法采用有机溶剂预先处理落叶松粉末，改善了cn200710144650.3专利中首先用热水处理增加阿拉伯半乳聚糖杂质的引入。但是，接着用有机溶剂提取阿拉伯半乳聚糖，而不使用水提取，这不仅增加成本，也没有用水更环保。
阿拉伯半乳聚糖通过为结肠细胞提供主要能量来源并增加有益细菌如双歧杆菌和乳酸菌来保护肠道免受疾病和癌症促进剂的影响。落叶松阿拉伯半乳聚糖基本上是平衡菌群保护胃肠道的一种很好的方法。由于大部分免疫系统驻留在胃肠道，这是落叶松阿拉伯半乳聚糖能够增强免疫系统的机制之一。这种奇妙的化合物增强免疫系统的另一种方式是通过巨噬细胞和自然杀伤（nk）细胞激活。通过刺激这两种重要的免疫系统成分，落叶松阿拉伯半乳聚糖能够直接影响人体靶向细菌和病毒以及癌症或癌前细胞等外部入侵者的能力。已显示其在促进患有慢性疲劳综合征，病毒性肝炎，hiv/aids和自身免疫疾病的患者中的nk活性方面特别有用。
落叶松阿拉伯半乳聚糖上个世纪就被美国fda批准为膳食补充剂，被认为是安全有效的免疫刺激补品。由于其对胃肠道微生物区系的影响，其唯一的副作用是轻度腹胀和肠胃胀气，但这些副作用通常是短暂的，只有少部分人体验过。每天服用可以改善肠道健康，或在急性疾病期间服用增强免疫力。它的味道温和，在水和果汁中具有优异的溶解性，使其成为儿童以及成人的极好免疫补充剂。
落叶松阿拉伯半乳聚糖安全性：作为食物食用时，落叶松阿拉伯半乳聚糖是安全的。它可能会引起一定副作用，如腹胀和肠气（胀气）。
二氢杨梅素是从显齿蛇葡萄（ampelopsisgrossedentata（hand-mazz）
w.t.wang）中分离得到。其具有很强的抗氧化活性，但是它在水中的溶解度：0.84g/l(20℃),直接影响它的生物利用度。
机械化学处理可能会导致阿拉伯半乳聚糖大分子的许多物理化学转化，首先是价键的打破和形成，其次，是弱的分子内相互作用（无序，构象重排等）。所有这些反过来又可以改变多糖的生物活性和毒理学性质。本专利利用机械化学处理落叶松阿拉伯半乳聚糖与二氢杨梅素的结合，以提高阿拉伯半乳聚糖的抗氧化及其他生物活性，增加二氢杨梅素在水中的溶解度，增加二氢杨梅素的生物活性，从而增加落叶松阿拉伯半乳聚糖组合物的生物利用度。
技术实现要素：
1本发明公开了一种从落叶松中提取阿拉伯半乳聚糖的方法，具体操作如下：落叶松根木屑粉碎成直径0.5mm以下小颗粒，先用乙醇处理浸泡过夜，超高压（50兆帕）处理20分钟，过滤，去除滤液，得滤渣；滤渣再加10倍量水浸泡过夜，过滤得滤液，残渣继续用8倍量水浸泡8小时，过滤得滤液，合并2次滤液，减压回收乙醇，浓缩至一定体积，离心去除不溶物质，得浓缩液，以大孔树脂为层析材料，将浓缩液上样，吸附4h后，用水洗脱，收集洗脱液，过分子量10,000道尔顿的中空滤膜，弃去滤液，截留部分为落叶松多糖，再经过超高压均质，喷雾干燥得落叶松阿拉伯半乳聚糖。
2加入适量藤茶提取物（主要含有二氢杨梅素）用水调比重至1.08-1.12，再经过超高压均质，喷雾干燥得落叶松阿拉伯半乳聚糖组合物。
3.落叶松阿拉伯半乳聚糖与其他膳食纤维相配合，提高其自身的医疗价值。
积极效果在于：1）超高压提取减少热水提取过程，降低能源消耗，同时减少加热过程中杂质的引入，简化纯化程序；添加藤茶提取物大大增加了落叶松阿拉伯半乳聚糖的抗氧化作用，由单纯落叶松阿拉伯半乳聚糖对dpph自由基清除作用清除率62.51%，落叶松阿拉伯半乳聚糖组合物提高到86.54%；阿拉伯半乳聚糖与二氢杨梅素一起经过机械化学处理，使二氢杨梅素在水中的溶解度增加数倍，由原来的0.84g/l提高到3.38g/l。从而增加落叶松阿拉伯半乳聚糖二氢杨梅素组合物的生物利用度。落叶松阿拉伯半乳聚糖与其他膳食纤维配伍，有效改善便秘症状，便秘人群观察实验结果，有效率达85%。
苯酚-硫酸法测定落叶松多糖含量
一）仪器和试剂
试剂：葡萄糖·一水（c6h12o6·h2o，mw=198）为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司；苯酚为分析纯，购自济南萧试化工有限公司；硫酸为分析纯，购自莱阳市康德化工有限公司。待测样品松树多糖提取物由郑毅男老师提供。
仪器：8302型水浴锅（北京市长风仪器仪表公司）；kq5200e型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。
二）、实验步骤
1.葡萄糖标准贮备液的配制
精密称取c6h12o6·h2o0.0102g，用蒸馏水溶解后定容于100ml容量瓶中，摇匀，得到浓度为0.0927mg/ml葡萄糖标准贮备液，置于冰箱中备用。
2.5%（g/ml）苯酚溶液的配制
称取苯酚5g，用蒸馏水溶解后定容于100ml棕色容量瓶中，得到质量分数为5%（g/ml）的苯酚溶液，置于冰箱中备用。
3.最大吸收波长的确定
精密量取0.0927mg/ml葡萄糖标准储备液2ml置于10ml带塞玻璃试管中，向带塞玻璃试管中加入1.0ml5%的苯酚溶液，于涡旋振荡器上混匀后，贴壁缓慢、逐滴匀速加入5ml浓硫酸溶液，于涡旋振荡器上充分混匀，放置10min，置40℃水浴中保温15min，取出，用冰水迅速冷却至室温。以2ml蒸馏水进行同样处理作为空白对照组，在470~510nm进行扫描，以确定最大吸收波长。
将待测样品松树多糖提取物的水溶液按上述方法反应后，进行波长扫描。
4.葡萄糖标准曲线的绘制
分别精密量取0.0927mg/ml葡萄糖标准储备溶液0ml、0.2ml、0.4ml、0.6ml、0.8ml、1.0ml、1.2ml置于10ml带塞玻璃试管中，用蒸馏水补至2.0ml，分别向带塞玻璃试管中加入1.0ml5%的苯酚溶液，于涡旋振荡器上混匀后，分别贴壁缓慢、逐滴匀速加入5ml浓硫酸溶液，充分混匀，放置10min，置40℃水浴中保温15min，取出，用冰水迅速冷却至室温。以进行同样处理的蒸馏水为空白对照组，在波长489nm，测定吸光度值。以葡萄糖含量（μg）为横坐标，以吸光度值为纵坐标，绘制葡萄糖标准曲线。
5.待测样品溶液的制备
精密称取待测样品4份，加蒸馏水溶解，定容至100ml容量瓶，得到浓度为0.1mg/ml的待测样品溶液。
6.待测样品溶液中多糖含量测定
分别精密量取上述待测样品溶液1ml置于10ml带塞玻璃试管中，加水补至2.0ml，精密加入5%苯酚溶液1ml，摇匀，贴壁缓慢、逐滴匀速加入浓硫酸5ml，摇匀，放置10min，置40℃水浴中保温15min，取出，冰水迅速冷却至室温，以进行同样处理的蒸馏水为空白，在波长489nm测定吸光度。
三）实验结果
1.最大吸收波长的确定
经测定，葡萄糖标准品储备液（图左）和待测样品溶液（图右）与苯酚和硫酸反应后，溶液变粉红色，在波长489nm处均有最大吸收，因此选择489nm作为测定波长。
2.葡萄糖标准曲线的绘制
3.待测样品松树提取物中多糖含量测定
由标准曲线（或者外标两点法）进行测定（详细见附录excel表）
实验例2合物抗氧化作用
实验方法
1.1样品溶液的制备
分别取实施例2和3落叶松阿拉伯半乳聚糖二氢杨梅素组合物1g，以10倍量70%乙醇回流提取1小时，提取液离心过滤，浓缩一定体积，加乙醇和水使溶液乙醇浓度达到70%，定容至50ml容量瓶中，供试。
1.2落叶松阿拉伯半乳聚糖组合物对dpph自由基清除作用
dpph自由基清除作用的实验是最常用的，因为它与抗氧化剂简单，直接，快速地反应。称取dpph0.0128g用无水乙醇将其定溶于50ml容量瓶中，然后取10ml溶液定溶于50ml容量瓶中，避光，最终浓度为1.3×10-4mol/l。
参考luo等的方法，并作适当修改，96孔板用来快速测定样品的吸光度值。分别吸取样品和阳性对照品待测液80μl，加入dpph·溶液80μl，37℃下黑暗静置30分钟之后，以无水乙醇调零，测定517nm波长处的吸光度(a样品)，每个样品平行测定3次；取样品待测液80μl与70%乙醇80μl混合液在517nm处的吸光度(a1)，再测定80μldpph·溶液与80μl70%乙醇在517nm波长处的吸光度(a0)。dpph·清除率按下面的公式计算。
dpph·清除率/%＝(1－
结果：单纯的落叶松阿拉伯半乳聚糖，对dpph自由基清除作用结果：清除率为62.51%。取实施例2方法制备的落叶松阿拉伯半乳聚糖藤茶组合物，对dpph自由基清除作用结果：清除率为86.54%。
实施例1
落叶松根洗净，木屑粉碎成直径0.5mm以下小颗粒，取100公斤，先用乙醇处理浸泡浸泡过夜，超高压（400兆帕）处理10分钟，过滤，去除滤液，得滤渣；残渣再加10倍量水浸泡过夜，过滤得滤液，残渣继续用8倍量水浸泡8小时，过滤得滤液，合并2次滤液，减压浓缩至一定体积，离心去除不溶物质，得浓缩液，以大孔树脂为层析材料，将浓缩液上样，吸附4h后，用水洗脱，收集洗脱液，过分子量10,000道尔顿的中空滤膜，弃去滤液，截留部分为落叶松多糖，再经过超高压均质，喷雾干燥得落叶松阿拉伯半乳聚糖。得10kg落叶松阿拉伯半乳聚糖。
经检测多糖含量为95.98%。
实施例2
取按实施例1方法制备的落叶松阿拉伯半乳聚糖，按实验例2方法
进行体外抗氧化活性测定，对dpph自由基清除作用结果：清除率为62.51%。
实施例3
取实施例1方法制备的落叶松阿拉伯半乳聚糖90g加入藤茶提取物（二氢杨梅素90%以上）10g，用水调比重至1.08-1.12，再经过超高压均质，喷雾干燥得落叶松阿拉伯半乳聚糖组合物。取该组合物10g加水100ml，其中二氢杨梅素溶解度达到3.38g/l，其在水中的溶解度明显增加。对dpph自由基清除作用结果：清除率为86.54%。
实验例4
取实施例1的落叶松阿拉伯半乳聚糖65g，加入抗性糊精17g，圆苞车前子壳18g，置于混匀中，混匀，每袋6g，灌封。
实验例5
取实施例1的落叶松阿拉伯半乳聚糖80g，加入抗性糊精20g，置于混匀器中，混匀，每袋6g，灌封。
实验例6
取实施例1的落叶松阿拉伯半乳聚糖80g，加圆苞车前子壳粉末20g，置于混匀器中，混匀，每袋6g，灌封。
实验例7
利用实施例4中的组合物治疗便秘人群观察：招募志愿者总计29人，其中脱落2人，无效4人。有效与效果明显的计23人，年龄最小的7岁，最大的80岁，其中男性12人，女性11人。最短时间2天见效的有2人，一般在10-15天恢复正常。有效率85%。观察周期一个月。服用方法：取实施例4方法制备的样品，每天早晚饭前各服1克。
实施例8
利用实施例4中的组合物治疗便秘人群观察：招募志愿者总计40人，分别给予分为四组，每组10人，每组的给药剂量分别为0.25g/天，0.5g/天，1.0g/天，3.0g/天。发现其最低有效剂量为0.5g/天。