本发明属于兽用制剂领域。更具体地，涉及一种兽用桉叶油盐酸多西环素自微乳剂及其制备方法和应用。
背景技术：
：盐酸多西环素(doxycyclinehydrochloride，又名盐酸强力霉素)是一种淡蓝色或黄色结晶性粉末，无臭，味苦，有吸湿性，具有广谱抗菌药，主治细菌、支原体、附红细胞体病、衣原体、立克次氏体等感染，用于呼吸道感染，慢性支气管炎，以及急慢性呼吸道疾病等引起的鼻腔有分泌物、流泪、张口呼吸和气管啰音等症，在呼吸道治疗中得到非常广泛的应用。而多西环素在酸性及碱性条件下都不够稳定，易发生水解。在酸性条件下，多西环素c-6上的羟基和c-5a上氢发生消除反应，不可逆的生成无活性橙黄色脱水物。桉叶油又称白千层脑、桉树脑，是一种无色油状液体。它是桉树叶油腺细胞分泌的芳香精油，特有清凉尖刺桉叶香气并带几分樟脑气味，带些药气，有辣口清凉感，香气强烈而不持久。对呼吸道鼻腔和支气管黏膜有温和的刺激作用，可促进黏液分泌，从而帮助疏通堵塞的鼻腔和支气管。桉叶油能够有效缓解鼻窦感染、流感、支气管炎、伤风鼻塞和其他呼吸系统疾病。但是，植物精油易挥发，不溶于水，稳定性差。单纯的植物精油类乳剂的抗菌效果，远远达不到治疗作用，联合抗生素才能更好的发挥抗菌活性，减少菌株耐药性的发生。另外，由于禽类气囊的特殊结构，肉鸡呼吸道病发生后，有时通过常规的用药途径，如注射、饮水、混饲等，吸收的药物很难在气囊内达到有效浓度，这也是气囊炎在临床上很难得到有效治疗的根本原因。因此，在治疗此病时，需要采用气雾或喷雾等方式给药，药物可以直接通过呼吸道到达并作用于气囊表面；其次，选择通过个体肌肉注射给药，可使血液中药物浓度迅速升高，快速作用于气囊，从而产生良好的治疗效果。雾化治疗药物利用率高，不仅可提高家禽的顺应性，还可降低家禽对药物的副作用。因此，亟需提供一种采用气雾或喷雾等方式给药来有效预防或治疗禽类呼吸道疾病的药物。技术实现要素：本发明要解决的技术问题是克服现有禽类在养殖过程中呼吸道疾病发生严重，而现有的药物治疗效果不好的问题，提供一种兽用桉叶油盐酸多西环素自微乳剂，可采用气雾或喷雾给药来预防和治疗家禽呼吸道疾病和慢性呼吸道疾病。采用气雾或喷雾给药可对肺泡巨噬细胞靶向给药，可提高这些靶细胞内的药物浓度和减少全身性药物浓度，从而减少潜在的毒性，增加局部药物浓度，延长局部药物作用时间，有望减少用药次数。本发明的目的是提供一种兽用桉叶油盐酸多西环素自微乳剂。本发明另一目的是提供所述兽用桉叶油盐酸多西环素自微乳剂的制备方法。本发明再一目的是提供所述兽用桉叶油盐酸多西环素自微乳剂的应用。为了实现上述目的，本发明是通过以下方案予以实现的：本发明提供了一种兽用桉叶油盐酸多西环素自微乳剂，包括以下比例的组分：盐酸多西环素原料药50～250g/l、溶媒1～50g/l、抗氧化剂0.1～2g/l、表面活性剂80～300g/l、助表面活性剂60～300g/l、油相100～450g/l。优选地，所述油相为桉叶油。优选地，所述溶媒为n-n-二甲基甲酰胺、n-甲基吡咯烷酮、α-吡咯烷酮或甘油缩甲醛中的一种或两种以上的混合物。更优选地，所述溶媒为n-甲基吡咯烷酮。优选地，所述抗氧化剂为丁基对羟基茴香醚(bha)、叔丁基对苯二酚(tbhq)、二丁基羟基甲苯(bht)、没食子酸、没食子酸酯、生育酚或抗坏血酸棕榈酸酯中的一种或两种以上的混合物。更优选地，所述抗氧化剂为丁基对羟基茴香醚(bha)。优选地，所述表面活性剂为聚氧乙烯氢化蓖麻油el-35、吐温-80或泊洛沙姆-188中的一种或两种以上的混合物。更优选地，所述表面活性剂为聚氧乙烯氢化蓖麻油el-35。优选地，所述助表面活性剂为无水乙醇、1,2-丙二醇或正丁醇中的一种或两种以上的混合物。更优选地，所述助表面活性剂为1,2-丙二醇。优选地，所述表面活性剂与助表面活性剂的质量比为1～2：1，表面活性剂与助表面活性剂组成混合表面活性剂。更优选地，所述表面活性剂与助表面活性剂的质量比为1.5：1。优选地，所述混合表面活性剂与桉叶油的质量比为1～3：1。更优选地，所述混合表面活性剂与桉叶油的质量比为2～2.5：1。更进一步优选地，所述混合表面活性剂与桉叶油的质量比为2：1。另外，本发明提供了一种兽用桉叶油盐酸多西环素自微乳剂的制备方法，包括以下步骤：s1.称取盐酸多西环素原料药和抗氧化剂，溶于溶媒中，得溶液a，备用；s2.按比例量取表面活性剂和助表面活性剂，然后加入油相，混合得体系b，备用；s3.常温下将溶液a加入到体系b中，搅拌至形成均匀透明的体系，即得到兽用桉叶油盐酸多西环素自微乳剂。步骤s3所述常温为25～30℃。另外本发明提供的兽用桉叶油盐酸多西环素自微乳剂在制备兽用药物或饲料添加剂中的应用，也应在本发明的保护范围之内。与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：本发明提供了一种兽用桉叶油盐酸多西环素自微乳剂，该自微乳剂的稳定性好，粒度分布均匀，分散性好，利用桉叶油与盐酸多西环素原料药的相加作用，桉叶油既作为转相法的油相，解决了桉叶精油的溶解问题，可以提高桉叶油的溶解度和盐酸多西环素原料药的生物利用度；同时，桉叶油对呼吸道鼻腔和支气管黏膜有温和的刺激作用，可促进黏液分泌，疏通堵塞的鼻腔和支气管。而且实验证明了该自微乳剂中，盐酸多西环素和桉叶油具有相加协同作用，抑菌效果较原料药得到显著提升，在临床应用时可以降低临床用药量，提高家禽呼吸道疾病和慢性呼吸道疾病的预防和治疗疗效。该自微乳剂可采用气雾或喷雾给药，还可采用高效饮水剂给药，药物可直接通过呼吸道到达并作用于靶细胞，可有效地预防和治疗家禽呼吸道疾病和慢性呼吸道疾病。另外，该自微乳剂的制备方法简单，条件温和，生产成本低，可应用于制备兽用药物或饲料添加剂，具有较高的经济价值和生物推广价值。附图说明图1是k值为3：2时，以桉叶油为油相的伪三元相图。图2是k值为1：1时，以桉叶油为油相的伪三元相图。图3是盐酸多西环素原料药与桉叶油联合用药的杀菌曲线图。其中，growthcontrol(生长对照组)：代表的是金黄色葡萄球菌在正常生长状态下的生长曲线图；eucalyptusoil(单独桉叶油组)：代表加入1倍mic的桉叶油后的金黄色葡萄球菌的生长曲线图；doxycycline(单独盐酸多西环素组)：代表加入1倍mic的多西环素后的金黄色葡萄球菌的生长曲线图；ec+dox(联合用药组)代表加入1倍mic的桉叶油和多西环素后的金黄色葡萄球菌的生长曲线图。图4是兽用桉叶油盐酸多西环素自微乳稀释到指定倍数后对金黄色葡萄球菌的生长影响图。其中，a、b、c、d、e、f、g分别代表实施例1～7制备得到的兽用桉叶油盐酸多西环素自微乳剂。具体实施方式以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本
技术领域：
常规试剂、方法和设备。除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。本发明中所称的“自微乳”是指由油、表面活性剂、助表面活性剂和药物组成的均一透明溶液。本发明各原料都可以从化工或医药市场购得。实施例15％的兽用桉叶油盐酸多西环素自微乳的制备称取50g盐酸多西环素原料药，0.2g丁基对羟基茴香醚(bha)，加入到49.8g的n-吡咯烷酮中，搅拌溶解得到溶液a，备用；称取360g吐温-80和240g无水乙醇于振荡器上混匀，然后加入300g桉叶油，再加入溶液a，经磁力搅拌器搅拌混匀，得到5％的桉叶油盐酸多西环素自微乳剂，调节ph为4.0，备用。实施例210％的兽用桉叶油盐酸多西环素自微乳的制备称取100g盐酸多西环素原料药，0.5g叔丁基对苯二酚(tbhq)，加入到80.5g的α-吡咯烷酮中，搅拌溶解得到溶液a，备用；称取326g吐温-80和216g1,2-丙二醇于振荡器上混匀，然后加入277g桉叶油，再加入溶液a，经磁力搅拌器搅拌混匀，得到10％的桉叶油盐酸多西环素自微乳剂，调节ph为4.0，备用。实施例320％的兽用桉叶油盐酸多西环素自微乳的制备称取200g盐酸多西环素原料药，0.3g二丁基羟基甲苯(bht)，加入到149.7g的n-n二甲基甲酰胺中，搅拌溶解得到浓溶液a，备用；称取260g聚氧乙烯氢化蓖麻油el-35和175g正丁醇于振荡器上混匀，然后加入215g桉叶油，再加入浓溶液a，经磁力搅拌器搅拌混匀，得到20％的桉叶油盐酸多西环素自微乳剂，调节ph为4.0，备用。实施例410％的兽用桉叶油盐酸多西环素自微乳的制备称取100g盐酸多西环素原料药，0.5g没食子酸，加入到80.5g的甘油缩甲醛中，搅拌溶解得到溶液a，备用；称取326g泊洛沙姆-188和216g1,2-丙二醇于振荡器上混匀，然后加入277g桉叶油，再加入溶液a，经磁力搅拌器搅拌混匀，得到10％的桉叶油盐酸多西环素自微乳剂，调节ph为4.0，备用。实施例510％的兽用桉叶油盐酸多西环素自微乳的制备称取100g盐酸多西环素原料药，0.5g没食子酸酯，加入到80.5g的n-n-二甲基甲酰胺中，搅拌溶解得到溶液a，备用；称取326g泊洛沙姆-188和216g无水乙醇于振荡器上混匀，然后加入277g桉叶油，再加入溶液a，经磁力搅拌器搅拌混匀，得到10％的桉叶油盐酸多西环素自微乳剂，调节ph为4.0，备用。实施例610％的兽用桉叶油盐酸多西环素自微乳的制备称取100g盐酸多西环素原料药，0.5g生育酚，加入到80.5g的甘油缩甲醛中，搅拌溶解得到溶液a，备用；称取326g聚氧乙烯氢化蓖麻油el-35和216g正丁醇于振荡器上混匀，然后加入277g桉叶油，再加入溶液a，经磁力搅拌器搅拌混匀，得到10％的桉叶油盐酸多西环素自微乳剂，调节ph为4.0，备用。实施例710％的兽用桉叶油盐酸多西环素自微乳的制备称取100g盐酸多西环素原料药，0.5g抗坏血酸棕榈酸酯，加入到80.5g的n-吡咯烷酮中，搅拌溶解得到溶液a，备用；称取326g吐温-80和216g无水乙醇于振荡器上混匀，然后加入277g桉叶油，再加入溶液a，经磁力搅拌器搅拌混匀，得到10％的桉叶油盐酸多西环素自微乳剂，调节ph为4.0，备用。实施例8表面活性剂和助表面活性剂的总量与桉叶油的质量比优化1、优化实验本实施例以桉叶油作为转相法的油相，利用相转化法，分别设定表面活性剂和助表面活性剂的总量与桉叶油的比例为1∶3、1∶2、1∶1.5、1∶1、1.5∶1、2∶1、3∶1、6∶1、9∶1，用灭菌水滴定，记录自微乳剂由清至浊或由浊至清的滴定终点状态。2、结果表面活性剂和助表面活性剂的总量与桉叶油的质量比优化结果如表1所示，可以看出，当表面活性剂和助表面活性剂的总量与桉叶油的质量比为2∶1或2.5：1时，自微乳剂的滴定终点状态为：无限稀释，蓝色乳光。因此，选择表面活性剂和助表面活性剂的总量与桉叶油的质量比为2～2.5：1。表1表面活性剂和助表面活性剂的总量与桉叶油的质量比优化结果乳(助)：油吐温/ml乙醇/ml桉油/ml水/ml结果1∶364302.9或2.6先变浑浊，继续滴清，最后滴浑浊1∶264203.4或3.5先变浑浊，继续滴清，最后滴浑浊1∶1.564155.3或5.1先变浑浊，继续滴清，最后滴浑浊1∶164106.1或6.5变浑浊1.5∶1646.710.1或11变浑浊，白色乳剂2∶1645-无限稀释，蓝色乳光2.5∶1644-无限稀释，蓝色乳光3∶1643.3-无限稀释，澄清透明6∶1641.7-无限稀释，澄清透明9∶1641.1-无限稀释，澄清透明实施例9表面活性剂和助表面活性剂的质量比优化1、优化实验本实施例分别将表面活性剂和助表面活性剂相、水相、油相作为伪三元相图的三个终点，表面活性剂和助表面活性剂的质量比设为k值，选择吐温-80为表面活性剂，无水乙醇为助表面活性剂，当k值为3∶2、1∶1时，根据滴定终点数据值，绘制以桉叶油为油相的伪三元相图。2、结果当k值为3∶2，即表面活性剂和助表面活性剂的质量比为3∶2时，以桉叶油为油相的伪三元相图如图1所示；当k值为1∶1，即表面活性剂和助表面活性剂的质量比为1∶1时，以桉叶油为油相的伪三元相图如图2所示。由图1和图2可以看出当k值为3∶2的自微乳区比k值为1∶1的自微乳区更大，因此，选择表面活性剂和助表面活性剂的质量比为3：2。实施例10兽用桉叶油盐酸多西环素自微乳剂的稀释1、稀释效果试验吸取1ml空白自微乳，依次稀释到50ml、100ml、200ml、500ml、1000ml，静置30min后观察结果。2、结果兽用桉叶油盐酸多西环素自微乳剂的稀释结果如表2所示，可以看出，该兽用桉叶油盐酸多西环素自微乳剂稀释以后，其粒径为10～500nm，稀释后稳定。表2兽用桉叶油盐酸多西环素自微乳剂的稀释结果实施例11兽用桉叶油盐酸多西环素自微乳剂的药效学评价1、棋盘法测定盐酸多西环素与桉叶油之间的关系(1)盐酸多西环素与桉叶油的mic值测定1)盐酸多西环素原料药的mic值测定将盐酸多西环素原料药按说明配制成浓度5120ug/ml，备用；将金黄色葡萄球菌标准株atcc29213和大肠杆菌atcc25922分别接种于新鲜的mh肉汤中，于37℃，200rpm震荡培养4h后，稀释菌量为106cfu/ml。向96孔板第一列加入180μl的mh肉汤，其他每孔加入100μl的mh肉汤；在第一列加入20μl稀释好的盐酸多西环素原料药，倍比稀释至第12列；在每孔中加入稀释好的菌液100μl，同时设置mh肉汤阴性对照组和菌液的阳性对照组，每株菌做三个平行对照并且重复三次；37℃恒温培养18～22h后，观察并记录试验结果，以每孔中完全抑制细菌生长的最低浓度为盐酸多西环素原料药的mic值。2)桉叶油的mic值测定将桉叶油提取物用0.1％吐温-80进行稀释，按照上述相同的方法测定桉叶油的mic值。3)桉叶油盐酸多西环素自微乳剂的mic值测定测定实施例1～7制备得到的桉叶油盐酸多西环素自微乳剂的mic值，方法同盐酸多西环素原料药的mic值测定的方法。测定结果如表3所示。表3兽用桉叶油盐酸多西环素自微乳剂的mic值测定结果(2)盐酸多西环素原料药和桉叶油联用的部分抑菌浓度(fici指数)利用棋盘法计算盐酸多西环素原料药和桉叶油联用后的fici指数。fici≤0.5协同作用0.5＜fici≤1相加(累加)作用1＜fici≤4无关作用fici＞4拮抗作用经过计算得出盐酸多西环素和桉叶油联用的fici指数为0.75，具有相加作用。2、杀菌曲线验证盐酸多西环素原料药与桉叶油之间的关系将金黄色葡萄球菌标准株atcc29213培养至生长对数期，稀释至指定浓度，加入装有camh肉汤的管中，使得细菌菌液的每管最终体积为4ml，置于37℃，200rpm的摇床式培养箱培养24h。在实验过程中，具体设置以下4个分组，在0h、3h、6h、9h、12h、15h、18h、24h时，分别吸取4个分组中的一定量的菌液滴板，将琼脂板放在37℃培养箱培养20h，进行菌落计数，以时间为横坐标，log10cfu/ml为纵坐标绘制杀菌曲线。4个分组设置如下：(1)生长对照组：只有细菌和肉汤；(2)单独盐酸多西环素组：细菌添加1mic浓度的盐酸多西环素原料药；(3)单独桉叶油组：细菌添加1mic浓度的桉叶油；(4)联合用药组：细菌添加1mic桉叶油盐酸多西环素自微乳剂。由图3可以看出，联合用药组的菌液生长情况明显低于对照组、单独使用植物精油桉叶油组和单独使用抗菌药物多西环素组，由此可以验证：盐酸多西环素原料药与桉叶油之间具有相加作用。图4结果显示，在24h时，联合用药组与单独盐酸多西环素组和单独桉叶油组中最有效的一组相比较，金黄色葡萄球菌的变化范围在1log10～2log10，表明盐酸多西环素和桉叶油具有相加作用，桉叶油盐酸多西环素自微乳剂抑菌效果较盐酸多西环素原料药更好，因此，在临床应用时可以降低临床用药量，提高疗效。上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。当前第1页12