本发明涉及功能性食品成分的制备
技术领域：
，具体涉及一种桑葚渣降血糖活性成分的提取纯化及制备技术。
背景技术：
：桑葚(morusalbal.)是桑树的果实，属于桑科植物，在我国具有较高的适应性、较大的种植面积以及产量。桑葚味道鲜美，色泽鲜艳，含有促进健康的植物营养化合物，如多酚、矿物质和维生素，对健康起重要作用，因而深受人们的喜爱。长期以来，桑葚一直被作为一般的补品用于预防各种慢性疾病，其提取物可以提高机体的抗氧化活性、抗肿瘤、降血糖、激活巨噬细胞和保护神经组织。然而，桑葚在过去是蚕业的副产品，很少受到关注，近年来，随着人们对健康重视程度的提高，桑葚的营养价值被广泛关注。去离子水是指除去了呈离子形式杂质后的纯水。国际标准化组织iso/tc147规定的“去离子”定义为：去离子水完全或不完全地去除离子物质。目前市场上销售的降糖药如二甲双胍、阿卡波糖等价格昂贵，且会出现副作用如低血糖等，而从植物中提取的自然成分，能有效改变这一现状，因此生产高质量的具有降血糖功效的植物提取物已成为国内市场的迫切需求。桑葚中含有大量的活性成分如多糖、黄酮类化合物、多酚以及花色苷，其都具备降血糖的功效。桑葚渣作为果汁、果酒加工利用之后的副产物，其也含有大量具备降血糖功效的活性成分，其可通过抑制糖尿病大鼠胰岛细胞凋亡和改善胰岛素分泌能力而发挥降血糖作用，本发明通过一系列的提取提纯步骤和实验检测，得到了良好的成果，相比于传统和现实生活中丢弃桑葚渣等废弃的方式，或者直接使用桑葚原料，本发明不仅能降低提取物的生产成本，也能缓解环境的压力、起到环保的作用，因此采用了桑葚渣作为开发降血糖产品的优质原料，并提取其有效成分。技术实现要素：本发明目的是提供一种降低生产成本、有效提纯桑葚渣中的纯抗氧化、降血糖植物成分物质、提高桑葚渣综合利用价值的桑葚渣降血糖活性成分的提取纯化及制备技术。本发明目的通过如下技术方案得以实现：一种桑葚渣降血糖活性成分的提取纯化及制备技术，步骤一原料的收集与处理：将桑葚材料低温零度存储，取出后经40～60摄氏度热风干燥40～80h，然后碾磨成粉末状，再经过药筛为60目以上，制得桑葚渣粉；步骤二降血糖活性成分的浸提：将破碎干燥处理后的桑葚渣粉按1：30～50g/ml料液比加入提取液，使用频率在35～50hz之间、功率为300～550w之间的超声辅助设备，并将超声温度控制在50～70摄氏度条件下，提取120～180分钟；步骤三进行离心处理：在3500～5000rpm的转速下离心10～20分钟，取上层清液，得到桑葚渣粗提液；步骤四浓缩干燥：将上述桑葚渣粗提液经过真空浓缩设备浓缩至原体积的20～25%，得到桑葚渣粗提浓缩液；步骤五脱洗并制备成产品：将桑葚渣粗提浓缩液以0.5～3.0倍柱体积（bv）/h的速度注入树脂层析柱，使用去离子水或浓度为10～90%的乙醇脱洗液，以1.0～3.0bv/h的速度洗脱并得到相应的洗脱液，再进行浓缩操作和冷冻干燥处理，制得桑甚渣降糖活性成分提取物。通过利用桑葚渣作为生产原料有效降低成本，本发明中首先使用提取液萃取桑葚渣中的降血糖活性成分，并使用超声波仪器，在一定的温度环境中提高了萃取的降血糖活性成分数量，又使用树脂层析柱和脱洗液对桑葚渣粗提浓缩液进行进一步的提取其中的有效成分。作为优选，所述热风干燥的条件为40-55摄氏度热风干燥48-72h。作为优选，所述的提取液为去离子水或20-80%的乙醇溶液。作为优选，所述乙醇洗脱液的浓度为50-80%。作为优选，所述超声辅助设备的超声波的频率为35-45hz，功率为300-500w。作为优选，所述树脂层析柱为ab-8大孔树脂或hz-806。作为优选，所述药筛为60～80目药筛。本发明的有益效果是：1）本发明纯化的桑葚提取液，溶解性好，易被人体吸收，降血糖活性高；2）产品从天然植物中提取，稳定性好，比化学降血糖药物更具安全性；3）本发明利用桑葚渣等加工废物为原料，提取纯化成具有降血糖功效的桑葚提取物，大大提高了桑葚渣的经济及利用价值。具体实施方式通过以下实施例对本发明作进一步的详细说明，但绝不是对本发明作任何限制。以下为本发明提取和检测试验所使用仪器：电子天平：bs200s-we1型，余姚金诺电子天平仪器有限公司；旋转蒸发器：r1002b型，上海申生科技有限公司；飞鸽低速大容量离心机：lxj-hb型，上海安亭科学仪器厂；电热恒温鼓风干燥箱：dhg-9146a型，上海精宏实验设备有限公司；冷冻干燥机：scientz-18n型，宁波新芝生物科技股份有限公司；紫外/可见分光光度仪：uv-1800型，日本岛津公司；大孔树脂：ab-8型，天津允开树脂科技有限公司。实施例1：（桑葚渣降糖活性成分提取纯化方法1）该方法按以下步骤进行：原料的收集与处理：取榨汁后的桑葚渣为原料，在50℃下进行热风干燥48h，使之含水量低于5%，将干燥后的桑葚渣碾磨成粉末备用；降血糖活性成分的浸提、离心、浓缩干燥：将桑葚渣粉以1:40(g/ml)的料液比加入去离子水，提取条件为：提取时间1.5h、料液比1:40(g/ml)、超声温度50℃、超声功率350w，提取1次，结束后，以4000rpm的速度离心10min，取上清，即得桑葚渣粗提液，最后将粗提物进行真空浓缩干燥，配制成一定的浓度的桑葚渣粗提浓缩液，备用。桑葚渣粗提液纯化：选用ab-8大孔树脂纯化所得的桑葚渣粗提浓缩液。纯化的工艺参数为：上样速度1bv/h，洗脱流速2.0bv/h用70%、的乙醇溶液洗脱，收集70%乙醇洗脱液，将70%乙醇洗脱液浓缩、冷冻干燥，即得到桑葚渣降糖活性成分提取物。实施例2：（桑葚渣降糖活性成分提取纯化方法2）本例中，该方法按以下步骤进行：原料的收集与处理：取榨汁后的桑葚渣为原料，在50℃下进行热风干燥48h，使之含水量低于5%，将干燥后的桑葚渣碾磨成粉末备用；降血糖活性成分的浸提、离心、浓缩干燥：将桑葚渣粉以1:30(g/ml)的料液比加入去离子水，提取条件为：提取时间1h、料液比1:30(g/ml)、超声温度60℃、超声功率300w，提取1次，结束后，以4000rpm的速度离心10min，取上清，即得桑葚渣粗提液。最后将粗提物进行浓缩干燥，配制成一定的浓度的桑葚渣粗提浓缩液，备用。桑葚渣粗提液纯化：选用ab-8大孔树脂纯化所得的桑葚渣粗提浓缩液。纯化的工艺参数为：上样速度2.0bv/h，洗脱流速1.0bv/h，用70%的乙醇溶液洗脱，收集70%乙醇洗脱液，将70%乙醇洗脱液浓缩、冷冻干燥，即得到桑葚渣降糖活性成分提取物。实施例3：（桑葚渣降糖活性成分提取纯化方法3）本例中，该方法按以下步骤进行：原料的收集与处理：取榨汁后的桑葚渣为原料，在50℃下进行热风干燥48h，使之含水量低于5%，将干燥后的桑葚渣碾磨成粉末备用；降血糖活性成分的浸提、离心、浓缩干燥：将桑葚渣粉以1:50(g/ml)的料液比加入去离子水，提取条件为：提取时间2h、料液比1:50(g/ml)、超声温度70℃、超声功率400w，提取1次，结束后，以4000rpm的速度离心10min，取上清，即得桑葚渣粗提液。最后将粗提物进行浓缩干燥，配制成一定的浓度的桑葚渣粗提浓缩液，备用。桑葚渣粗提液纯化：选用ab-8大孔树脂纯化所得的桑葚渣粗提浓缩液。纯化的工艺参数为：上样速度3.0bv/h，洗脱流速3.0bv/h，用70%的乙醇溶液洗脱，收集70%乙醇洗脱液，将70%乙醇洗脱液浓缩、冷冻干燥，即得到桑葚渣降糖活性成分提取物。实验a：（桑葚渣降糖活性成分提取物的体外降血糖活性试验）体外α-淀粉酶抑制试验：（1）0.02mol/l磷酸缓冲液（ph6.9）：称取7.1628gna2hpo4加蒸馏水溶解，并定容至1l的容量瓶中，备用。称取3.1202gnah2po4加水溶解，并定容至1l的容量瓶中，两者按1:1比例调配至ph为6.9。（2）0.5%可溶性淀粉：称取0.5g可溶性淀粉，溶于100ml的沸水中即可。（3）dns试剂：准确称取5g的3,5-二硝基水杨酸，溶于常温的200mlnaoh（2mol/l）中，接着混入500ml含有130g的酒石酸钾钠溶液，混匀以后接着加入5g的结晶酚以及5g的na2so3，超声溶解，定容至1l的容量瓶中，备用。α-淀粉酶在淀粉消化的过程中起关键性作用，其原理是通过抑制唾液以及α-淀粉酶的活性，阻碍食物中碳水化合物的消化吸收，降低餐后血糖水平，间接减少体内脂肪的合成，延缓糖尿病的发生和发展。α-淀粉酶活性抑制实验相比于动物和细胞实验来说，具有成本较低、操作简便和可控性强等优点，因此，选用α-淀粉酶活性抑制实验来研究桑葚的体外降糖活性。具体的步骤为将实施例1、2或3制得的桑葚渣降糖活性成分提取物与α-淀粉酶（13u/ml）混合，并在37℃的水浴中保温10min，之后加入1ml0.5%可溶性淀粉，同样在37℃的水浴中保温5min，最后加入1mldns试剂，在沸水浴中加热5min，迅速冷却并用去离子水稀释一定的倍数，在540nm出测定各反应体系的吸光度。实施例1、2或3制得的桑葚渣降糖活性成分提取物对α-淀粉酶的半抑制浓度ic50，对比阳性对照阿卡波糖，得到实验a结果，桑葚渣降糖活性成分提取物对α-淀粉酶的半抑制浓度ic50见表1。表1桑葚渣降糖活性成分提取物对α-淀粉酶的半抑制浓度ic50样品实施例1实施例2实施例3阿卡波糖ic50（mg/ml）8.03±0.1711.60±1.5713.33±2.001.32±0.49实施例1、2或3制得的桑葚渣降糖活性成分提取物对α-淀粉酶的半抑制浓度ic50（受试物对α-淀粉酶(72h)的半数抑制浓度）如表1所示。由该表可知，本发明所得体外抑制α-淀粉酶效果较好，考虑到该产品为天然食品成分，安全无毒副作用，将其开发为抗肿瘤新药或保健食品具有广泛的应用前景。实验b：（2型糖尿病小鼠试验）将最佳的实施方案实例1所得桑葚渣降糖活性成分提取物作为提取液a进行小鼠实验；按照随机数字表法从体重相近的130只小鼠中随机选取10只作为正常对照组给予基础饲料饲养，其余120只小鼠作为模型组并给予高脂高糖饲料饲养。对所有小鼠喂养两周后，对模型组小鼠腹腔注射柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液稀释的stz100mg/kg，在一周之后进行重复注射stz100mg/kg。同时，正常对照组小鼠腹腔注射等量的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液。所要注意的是在每次注射之前都需将小鼠禁食一天，stz注射两周后，将禁食6h的小鼠尾部静脉取血，用血糖仪测定所有小鼠空腹血糖，至少两次血糖值大于11mmol/l时，则糖尿病小鼠模型建立成功。反之，则剔除试验。将成模小鼠按照随机数字表法分为a-e共5组，每组各10只。具体分组情况见如下：a：灌喂提取液a100mg/kg/d（pmel），b：灌喂提取液a300mg/kg/d，c：阳性对照组，灌喂二甲双胍溶液600mg/kg/d，d：模型对照组，灌喂无菌水，e：空白对照组，同样灌喂无菌水。每天灌胃1次，避免灌胃对于小鼠的损伤，灌胃的时长为3周。实验b结果：将实例1所得桑葚渣降糖活性成分提取物进行小鼠实验，小鼠3周的血糖变化，pmel对糖尿病小鼠血糖的影响见表2；由该表可知桑葚渣提取液具有较好的降低血糖的作用，且低剂量的降血糖效果好于高剂量，考虑到该产品为天然食品成分，安全无毒副作用，将其开发为降血糖新药或保健食品具有广泛的应用前景。表2pmel对糖尿病小鼠血糖的影响注：与模型组比较，*：p<0.05，**：p<0.01。当前第1页12