本发明涉及一种生物医学材料以及医疗器械技术领域，特别是一种干化心包膜的制备方法。
背景技术：
心脑血管疾病已成为威胁人类健康的“第一杀手”。其中，冠心病和心脏瓣膜类疾病是最常见的两类疾病。心脏瓣膜病就是指因人体自身瓣膜发生病变影响血流的正常流动，从而造成心脏功能异常的一类疾病。随着人口老龄化，我国瓣膜性心脏病，特别是老年主动脉瓣膜狭窄疾病的发病率逐年上升。据不完全统计，国内仅主动脉瓣膜病变，每年新增的患者就有约20万人。对于产生严重病变的瓣膜，通常需要采用人工心脏瓣膜进行置换手术。其中，采用动物源(猪或牛)心包膜制备的人工生物心脏瓣膜是瓣膜置换手术的主流产品。当前生物瓣膜的工艺流程是将从屠宰场获得的新鲜心包膜在水溶液当中低温(通常是4摄氏度)冷链条件下运输和储存，并在一定时间(3-7天)内尽快进行交联处理。若是运输和储存不当，例如没有按照规范要求将新鲜心包膜浸泡于水溶液当中，会导致心包膜的风干并发生不可逆的形变；或者没有按照规范要求将新鲜心包膜存放于低温环境，会导致心包膜的腐烂；或者在水溶液低温环境存放太长时间(超过7天或者更长时间)，也可能导致新鲜膜的降解损坏。
冠心病是另一种常见的心脏病。冠状动脉搭桥手术是目前治疗冠心病的重要手段之一，而寻找并研制理想的人工小血管材料一直是大家研究的重点。脱细胞血管支架具有低的免疫原性和良好的力学性能，具备与受者血管相似的力学特性，其被认为是除自身血管之外最有潜力的血管替代材料之一。然而目前的用于人工小血管的动物细胞外基质材料通常需要液体保存，从而造成动物细胞外基质材料无法长时间保存和长途运输。本发明所述的一种干化的动物细胞外基质材料的制备方法，其发明目的是将上述当前的细胞外基质材料的工艺流程进行优化改进，将动物细胞外基质材料制备得到脱水的干化细胞外基质材料，将极大地提高细胞外基质材料在运输和储存方面的方便性，降低冷链运输和储存的成本。
技术实现要素：
本发明的目的是为了解决上述现有技术的不足而提供一种采用交联处理之后，确保相比于没有经过干化而直接交联的心包膜，具有相当的最大断裂拉伸应力和伸长率的制备方法。
本发明的目的通过以下技术方案予以实现。
一种干化的动物细胞外基质材料的制备方法，包括以下具体步骤：
a.多重脱细胞处理：采用dna酶、rna酶、胰蛋白酶、十二烷基硫酸钠、脱氧胆酸、聚乙二醇辛基苯基醚组合联用对心包膜和血管进行脱细胞处理时间,并且脱细胞处理时间为数小时至数天。
b.蛋白清洗：采用ripa裂解液进行蛋白清洗。
c.特定模具固定外形：包括使用有机玻璃板模具固定外形。
d.特定溶剂适度脱水：包括使用乙醇、甘油、异丙醇等多元醇溶剂进行适度脱水，并且脱水处理时间为数小时至数天。
进一步的，所述心包膜为猪心包膜或牛心包膜。
进一步的，所述血管为动物的小口径的静脉血管。
进一步的，所述步骤a中的多重脱细胞处理的dna酶使用浓度为10-1000u/ml，rna酶使用浓度为2-200μg/ml,胰蛋白酶使用浓度为20-2000u/ml，sds使用浓度为0.05％-5％，脱氧胆酸使用浓度为0.01％-1％，tritonx-100使用浓度为0.01％-1％。
进一步的，所述步骤c中特定模具为有机玻璃板模具或有机玻璃管模具中的其中一种。
进一步的，所述步骤d中所用的多元醇溶剂优选地包括75％乙醇、100％乙醇、25％甘油和75％乙醇混合物、100％甘油、25％甘油配合50％乙醇和25％异丙醇的混合物。
进一步的，所述步骤d通过特定溶剂适度脱水后的干化心包膜在室温普通空气环境下存放3个月之后，交联制备得到的心包膜。
本发明的有益效果是：采用本发明所述的方法制备得到的细胞外基质材料在干燥状态下具有良好的平整度和弹性。其中，在长期(至少3个月)干化存放之后交联得到的心包膜，相比于没有经过干化直接交联的心包膜，具有相当的最大断裂拉伸应力和伸长率。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实例对本发明进一步详细说明，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定
一种干化的动物细胞外基质材料的制备方法，包括以下具体步骤：
a.多重脱细胞处理：采用dna酶、rna酶、胰蛋白酶、十二烷基硫酸钠、脱氧胆酸、聚乙二醇辛基苯基醚组合联用对心包膜和血管进行脱细胞处理时间,并且脱细胞处理时间为数小时至数天。
b.蛋白清洗：采用ripa裂解液进行蛋白清洗。
c.特定模具固定外形：包括使用有机玻璃板模具固定外形。
d.特定溶剂适度脱水：包括使用乙醇、甘油、异丙醇等多元醇溶剂进行适度脱水，并且脱水处理时间为数小时至数天。
在本具体实施方式中，所述心包膜为猪心包膜或牛心包膜。所述血管为动物的小口径的静脉血管。所述步骤a中的多重脱细胞处理的dna酶使用浓度为10-1000u/ml，rna酶使用浓度为2-200μg/ml,胰蛋白酶使用浓度为20-2000u/ml，sds使用浓度为0.05％-5％，脱氧胆酸使用浓度为0.01％-1％，tritonx-100使用浓度为0.01％-1％。所述步骤c中特定模具为有机玻璃板模具或有机玻璃管模具中的其中一种。所述步骤d中所用的多元醇溶剂优选地包括75％乙醇、100％乙醇、25％甘油和75％乙醇混合物、100％甘油、25％甘油配合50％乙醇和25％异丙醇的混合物。所述步骤d通过特定溶剂适度脱水后的干化心包膜在室温普通空气环境下存放3个月之后，交联制备得到的心包膜。
根据上述内容对心包膜进行五组实施：
实施例1
从屠宰场获得新鲜的猪心包膜，去除表面附着的脂肪。用整张完整的猪心包膜固定于方形的有机玻璃板模具上，用橡皮筋固定外形。采用100u/ml的dna酶，20μg/ml的rna酶，200u/ml的胰蛋白酶混合液浸泡4小时。ripa裂解液浸泡4小时。0.5％的sds浸泡24小时。采用75％乙醇浸泡4小时，100％乙醇浸泡4小时，25％甘油配合50％甘油和25％异丙醇浸泡24小时。得到干化的心包膜。
实施例2
从屠宰场获得新鲜的猪心包膜，去除表面附着的脂肪。用整张完整的猪心包膜固定于方形的有机玻璃板模具上，用橡皮筋固定外形。采用100u/ml的dna酶，20μg/ml的rna酶，200u/ml的胰蛋白酶混合液浸泡4小时。ripa裂解液浸泡4小时。0.5％的sds浸泡24小时。0.1％的tritonx-100浸泡24小时。采用75％乙醇浸泡4小时，100％乙醇浸泡4小时，25％甘油配合50％甘油和25％异丙醇浸泡24小时。得到干化的心包膜。
实施例3
从屠宰场获得新鲜的牛心包膜，去除表面附着的脂肪。用整张完整的猪心包膜固定于方形的有机玻璃板模具上，用橡皮筋固定外形。采用100u/ml的dna酶，20μg/ml的rna酶，200u/ml的胰蛋白酶混合液浸泡4小时。ripa裂解液浸泡4小时。0.5％的sds浸泡24小时。采用75％乙醇浸泡4小时，100％乙醇浸泡4小时，25％甘油配合50％甘油和25％异丙醇浸泡24小时。得到干化的心包膜。
实施例4
从屠宰场获得新鲜的猪股静脉血管，去除表面附着的脂肪。将猪股静脉血管固定于圆形的有机玻璃管模具上，用橡皮筋固定外形。采用100u/ml的dna酶，20μg/ml的rna酶，200u/ml的胰蛋白酶混合液浸泡4小时。ripa裂解液浸泡4小时。0.5％的sds浸泡24小时。采用75％乙醇浸泡4小时，100％乙醇浸泡4小时，25％甘油配合50％甘油和25％异丙醇浸泡24小时。得到干化的猪股静脉血管。
实施例5
从屠宰场获得新鲜的猪股静脉血管，去除表面附着的脂肪。将猪股静脉血管固定于圆形的有机玻璃管模具上，用橡皮筋固定外形。采用100u/ml的dna酶，20μg/ml的rna酶，200u/ml的胰蛋白酶混合液浸泡4小时。ripa裂解液浸泡4小时。0.5％的sds浸泡24小时。0.1％的tritonx-100浸泡24小时。采用75％乙醇浸泡4小时，100％乙醇浸泡4小时，25％甘油混合75％甘油浸泡24小时。得到干化的猪股静脉血管。
实验例
为了验证最大断裂拉伸应力和伸长率以及制备干化的心包膜的长期稳定性，因此对实施例1-2中制得的干化的动物细胞外基质材料进行单轴拉伸测试。
将上述实施例制备得到的干化心包膜在室温普通空气环境下存放3个月之后，用1％戊二醛溶液浸泡24小时，0.25％戊二醛浸泡24小时，制备得到的交联生物膜编号分别为干化膜1和干化膜2。
戊二醛对照组为新鲜采集的猪心包膜在3-7天内保存于生理盐水4摄氏度环境下，直接采用1％戊二醛溶液浸泡24小时，0.25％戊二醛浸泡24小时。制备尺寸为2cm*35cm的哑铃型拉伸试样，测量并记录试样厚度。
测试方式：采用万能力学实验机进行拉伸测试，拉伸速率为12mm/min，拉伸直至试样反生断裂。
记录并计算最大断裂拉伸应力和最大断裂伸长率。每组重复测试样品5个。
表1
表2
表1最大断裂拉伸应力计算和统计结果。
表2最大断裂伸长率计算和统计结果。
表1和表2的结果表明：采用实施例1以及2制备得到的干化膜1和干化膜2的最大断裂拉伸应力以及最大断裂伸长率，相比于没有经过干化直接交联的对照膜，具有相当的最大断裂拉伸应力以及最大断裂伸长率。
本发明的有益效果是：采用本发明所述的方法制备得到的细胞外基质材料在干燥状态下具有良好的平整度和弹性。其中，在长期(至少3个月)干化存放之后交联得到的心包膜，相比于没有经过干化直接交联的心包膜，具有相当的最大断裂拉伸应力和伸长率。
当然，以上只是本发明的典型实例，除此之外，本发明还可以有其它多种具体实施方式，凡采用等同替换或等效变换形成的技术方案，均落在本发明要求保护的范围之内。