环格列酮在制备治疗肺动脉高压的药物中的应用的制作方法

本发明属于生物医药领域，涉及一种环格列酮，具体来说是环格列酮在制备治疗肺动脉高压的药物中的应用。

背景技术：

肺动脉高压(pulmonaryarterialhypertension,pah)是一组以肺血管阻力持续增加为特征的恶性疾病，最终可导致右心衰竭而死亡。肺血管收缩、肺血管重构以及血栓形成是肺血管阻力增加的主要原因，其中由细胞增殖及血管重构是导致pah发病机制的中心环节。近年，前列环素类似物、内皮素受体拮抗剂以及5型磷酸二酯酶抑制剂等靶向药物的出现，在一定程度上改善了pah患者的生活质量。然而，这些药物虽然能够扩张肺动脉，降低肺血管阻力，改善临床症状，但并不能抑制或逆转肺血管重构的发生，且不良反应多、副作用大。因此，寻找和开发新型的pah治疗药物，探索治疗的新靶点是医药研究人员面临的艰巨任务之一。

pah的发病与过氧化物酶体增殖物激活型受体γ(peroxisomeproliferationactivatedreceptor,pparγ)表达降低相关，而pparγ的配体能够减轻pah的发生和发展。环格列酮属于噻唑烷二酮(thiazolidinedione,tzds)类药物，是pparγ的人工合成配体，对pparγ很高的选择性，除了具有胰岛素增敏的作用外，还具有调控炎症、抑制细胞增殖、诱导细胞凋亡、调节细胞代谢等方面发挥作用。但对于肺血管疾病和肺动脉高压的治疗作用目前尚未见报道。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供环格列酮在制备治疗肺动脉高压的药物中的应用，所述的这种环格列酮在制备治疗肺动脉高压病的药物中的应用要解决现有技术中治疗肺动脉高压的药物的治疗效果不佳的技术问题。

本发明提供了环格列酮在制备治疗肺动脉高压的药物中的应用，所述环格列酮的结构式如式(1)所示：

进一步的，所述肺动脉高压为野百合碱诱导形成的肺动脉高压。

进一步的，所述药品为环格列酮纯品。

进一步的，所述环格列酮的剂型为药剂学上允许的口服剂型。

本发明和已有技术相比，其效果是积极和明显的。本发明通过大鼠肺动脉高压模型，给予环格列酮干预治疗，明确了环格列酮对于肺血管的作用。环格列酮可降低肺动脉高压大鼠的平均肺动脉压力和肺血管阻力，增加心输出量，降低右心室肥厚指数，改善肺血管重构，抑制肺动脉平滑肌细胞的异常增殖，促进凋亡，显著减轻肺血管重构和右心室肥厚。实验证明，本发明通过增加pparγ的表达达到治疗肺动脉高压的效果。

附图说明：

图1是环格列酮显著降低肺动脉高压大鼠平均肺动脉压(mpap)。

图2是环格列酮显著降低肺动脉高压大鼠右心室收缩压(rvsp)。

图3是环格列酮显著增加肺动脉高压大鼠心输出量(co)。

图4是环格列酮显著降低肺动脉高压大鼠肺血管阻力(pvr)。

图5是环格列酮对肺动脉高压大鼠肺组织病理变化影响的苏木精-伊红(he)染色结果。

图6是环格列酮增加肺动脉高压大鼠肺组织pparγ蛋白表达水平。

具体实施方式：

下面结合实施例对本发明作进一步详细说明，以下实施例中使用的环格列酮均为前述式(1)所示的化合物，购买自美国caymanchemical(annarbor,michigan48108,usa,货号71730)。分子式为：c18h23no3s，分子量为：333.4。

实施例1

一、材料与方法

1.1建立大鼠肺动脉高压模型

一次性颈背部皮下注射野百合碱(monocrotaline,mct,60mg/kg)，3周后，随机采用右心导管方法测定肺动脉压力及血流动力学参数，鉴定是否造模成功。

1.2实验分组及药物干预

雄性spf级sd大鼠(上海中科院动物房提供)，50只，体重200-220g。sd大鼠随机分为正常对照组、模型组、环格列酮不同剂量组(1mg/kg/d、3mg/kg/d、10mg/kg/d)，每组各10只。正常对照组灌胃给予生理盐水(0.3ml/kg/d)，其余各组大鼠颈背部皮下一次性注射mct(60mg/kg)，造模后的第22天开始，环格列酮不同的剂量组灌胃给药，每隔24小时一次，连续3周。正常对照组和模型组给予等量的生理盐水。连续给药后的第22天进行血流动力学、组织病理学与分子生物学等评价。

1.3血流动力学测定

1.3.1右心导管法测定给药3周后各组动物的平均肺动脉压(meanpulomonaryarterialpressure,mpap)、右心室收缩末期压力(rightventriclesystolicpressure,rvsp)、心输出量(cardiacoutput,co)以及心率等参数。具体方法如下：大鼠经戊巴比妥钠(40mg/kg)腹腔麻醉，仰卧固定后分离右侧颈外静脉约1cm左右，结扎远心端，并作“v”形切口，将与换能器连接并充满肝素盐水的右心导管(自制末端弯曲pe50导管，内径0.6mm，外径0.9mm)插入，动物生理多导仪记录右心室收缩末期压力rvsp、肺动脉收缩压(pulmonaryarterialsystolicpressure,pasp)、肺动脉舒张压(pulmonaryarterialdiastolicpressure,padp)，计算mpap。

mpap(mmhg)＝1/3pasp(mmhg)+2/3padp(mmhg)

1.3.2心输出量测定：热稀释法测定心输出量。具体方法：将右心导管回抽至上腔静脉，分离左侧颈总动脉，结扎远心端，剪口，将穿有温度探测器的pe管插入胸主动脉或腹主动脉。用1ml针筒抽取0-4℃肝素化生理盐水，迅速向上腔静脉推进0.2-0.3ml，观察并记录温度曲线的变化，计算心输出量，同时计算肺血管阻力(pulmonaryvesselresistance,pvr)。

pvr(wood)＝mpap(mmhg)/co(ml/min)

1.4右心室肥厚指数(rightventricularhypertrophyindex,rvhi)测定

血流动力学测定完毕后，开胸取出整个心脏，用预冷生理盐水冲洗，沿着房室沟剪去心房及大血管根部，沿后室壁间沟将右心室游离壁分离，滤纸吸水后称量右心室游离壁(rv)及左心室+室间隔(lv+s)的重量，并计算右心室肥厚指数。

右心室肥厚指数(rvhi)＝rv/(lv+s)。

1.5肺组织苏木精-伊红(he)染色

处死大鼠后，取右肺中叶以10％中性甲醛溶液固定1天，石蜡包埋，沿肺门水平横切，厚度约为5μm，进行he染色。切片经常规二甲苯脱蜡，经各级乙醇至水洗，苏木精染色5min，自来水冲洗。根据染色的深浅，用0.5％盐酸乙醇分化，自来水浸泡15min，置伊红液2min，常规脱水，透明，封片。

1.6肺小动脉血管形态分析

常规he染色，随机选取直径100～200μm范围的肺小动脉，运用ipp6.0图像分析软件测定血管壁厚度(wallthickness,wt)、血管外径(externaldiameter,ed)、血管总面积(totalarea,ta)以及血管腔面积(lumenarea,la)，分析wt％和wa％等衡量血管重构的指标。

wt％＝(2×wt/ed)×100％

wa％＝[(ta-la)/ta]×100％

1.7westernblot蛋白免疫印迹检查pparγ蛋白表达

肺组织在组织匀浆器中，冰上匀浆后，加入蛋白裂解液及pmsf，离心40取上清。以bsa为标准，用bradford法对上清进行蛋白定量。取40μg蛋白样品，进行sds-page电泳，转移至硝酸纤维素薄膜，放入封闭液中37℃封闭，pparγ蛋白(一抗，ab209350，1:500)4℃过夜，辣根过氧化酶标记二抗孵育1小时，用图像分析测定各带灰度值作定量分析。

1.8统计学处理

数据均采用均值±标准差表示，组间比较采用t检验，统计处理由spss10.0完成，以p<0.05为差异有统计学意义。

二、结果

2.1大鼠一般情况与死亡情况

对照组及不同剂量环格列酮各给药组大鼠体毛光泽，反应敏捷，饮食正常。但是，模型组大鼠逐渐变得虚弱，反应迟钝，蜷缩少动，体毛暗淡无光泽。

实验动物死亡情况：本实验共用50只sd大鼠，死亡2只，均为模型组，分别死于实验第18天和20天。大鼠死亡前表现为呼吸困难、口唇发绀。解剖后可见胸腔积液，腹腔积液，肝脏淤血肿胀。取出心肺后，大体可见肺部瘀点瘀斑，短轴横切心脏，可见右心室游离壁明显肥厚，提示大鼠在肺动脉高压病程中发生了右心衰竭。

2.2血流动力学变化

模型组大鼠mpap明显高于对照组，模型建立成功。与模型组相比，3个不同剂量组的环格列酮均可显著降低肺动脉高压大鼠的mpap和rvsp，明显改善肺动脉高压所致co减少，降低pvr。(见图1-4)^##p表示，与正常组相比，p值小于0.01；^#p表示，与正常组相比，p值小于0.05；^**p表示，与模型组相比，p值小于0.01；^*p表示，与模型组相比，p值小于0.05；

2.3右心室肥厚指数和肺血管重构

一次性皮下注射mct21天后，可见明显的右心室肥厚，rvhi为(0.42±0.02)，罗格列酮可明显改善大鼠右心肥厚指数(p<0.05或p<0.01)，见表1。大鼠中、小肺动脉图像分析结果可见，罗格列酮可明显改善肺动脉高压大鼠的肺血管重构。模型组大鼠的中、小肺动脉wt％和wa％均明显高于正常对照组。而不同剂量的罗格列酮组中大鼠中、小肺动脉wt％和wa％均明显低于模型组。(见表1)

肺组织he染色显示，正常组大鼠小肺动脉内皮连续性好，细胞分布均匀，薄厚一致；模型组大鼠内皮细胞连续性破坏，呈立方形或柱状突向管腔，中层管壁厚度明显增加，管腔面积明显变小，伴有血管周围炎。环格列酮剂量组大鼠肺血管小动脉内皮连续性良好，管壁厚度较模型组明显减少，管腔变宽，血管周围炎症减轻。(见图5)

表1各组大鼠中rvhi,wt％和wa％比较

p*<0.05,comparedwithcontrolgroup；p*<0.01,comparedwithmctgroup；

p^#<0.05,comparedwithcontrolgroup；p^##<0.05,comparedwithmctgroup；

2.4环格列酮对肺动脉高压大鼠肺组织pparγ蛋白表达水平的影响

与正常组相比，模型组大鼠pparγ蛋白表达量均显著降低。然而，与模型组相比，3种剂量环格列酮组的pparγ蛋白表达量均明显上调。(见图6)

三、结论

环格列酮可降低肺动脉高压大鼠的平均肺动脉压力和肺血管阻力，增加心输出量，改善肺血管重构和右心室肥厚，通过增加pparγ蛋白表达治疗肺动脉高压。