一种海绵状bFGF-PLGA微球药物缓释载体的制备方法与流程

文档序号：17926347发布日期：2019-06-15 00:26阅读：409来源：国知局

本发明属于生物医药材料技术领域，具体涉及一种海绵状bfgf-plga微球药物缓释载体的制备方法。

背景技术：

目前，常用的gfs(growthfactors)缓释载体材料有两种，人工合成材料和天然材料，而人工的又分为可降解的和不可降解的合成材料。目前研究最多的人工合成支架材料包括聚羟基乙酸(pga)，聚乳酸(pla)、聚乳酸和聚羟基乙酸的共聚物(plga)，聚乙内酯(pcl)和聚丙交酯等。其中聚羟基乙酸(pga)，聚乳酸(pla)、聚乳酸和聚羟基乙酸的共聚物(plga)是最早fda认证的同意应用于人体的合成可降解的生物高分子材料。plga共聚物是由聚羟基乙酸(pga)，聚乳酸(pla)各50％的比例混合，结合了这两者的优点，能够完全降解，但强度较高，降解时间延长，可精确调节降解时间，但是存在生物相容性差的缺点。天然材料包括胶原、明胶、壳聚糖、透明质酸等，其生物相容性好，无抗原性，能促进细胞黏附和增殖，且可根据需要制成不同的形状。而天然材料中，胶原蛋白是脊柱动物含量最多，分布最广的蛋白质，体内具有广泛的生物学活性；体外应用具有低免疫原性，良好的生物相容性、可降解性、可参与组织修复重建等优越性，并且其来源丰富，是最重要的天然可降解的生物医用材料。胶原蛋白在生长因子截获，储存、运输等方面有很重要的作用，可以作为生长因子的载体。很多研究报导利用胶原蛋白作为支架，接种碱性成纤维细胞，构建人工皮肤。在众多的胶原蛋白中，i型胶原蛋白属于序列保守性的蛋白质，是被人们了解得最为清楚的，也是组织分布最为广泛的胶原蛋白，在哺乳动物不同种属之间氨基酸种类、数目和排列顺序上基本相同，抗原性很低，因此应用比较广泛。

近年来，国内外很多学者也致力于gfs(growthfactors)缓释载体的研究，但有效的bfgf缓释系统中，理想的缓释载体是应用的关键，目前的缓释载体只要包括bfgf-plga和bfgf-胶原海绵载体，前者只能应用在关节间隙，骨折或静脉给药，在大创伤口愈合应用方面存在不足，应用范围比较窄，并且由于是人工合成的高分子材料，具有疏水性，因此在使用过程，存在组织生物相容性差的缺点；后者的吸水性好，具有高的生物相容性，但是单独做为bfgf的载体，胶原海绵的微纤维与bfgf只有较低的亲和力，以物理吸附方式负载bfgf，因其具有多孔性，一旦接触体液或者是水，导致海绵溶胀及降解过快，不利于bfgf的活性保持，且不能有效地缓慢释放bfgf。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明的主要目的在于提供一种海绵状bfgf-plga微球药物缓释载体的制备方法，解决了现有技术得到的缓释载体不能很好的保持bfgf生物活性、缓释效果差、生物相容性不佳的问题。

为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：一种海绵状bfgf-plga微球药物缓释载体的制备方法，该方法通过以下步骤实现：

步骤1，将蚕茧依次进行脱胶、溶解、过滤、透析、浓缩处理，获得丝素蛋白液；

步骤2，向i型胶原蛋白中加入乙酸溶液得到i型胶原蛋白的乙酸溶液，再将所述i型胶原蛋白的乙酸溶液加入至所述步骤1获得的丝素蛋白液中，获得丝素蛋白与i型胶原蛋白的混合蛋白溶液；

步骤3，将bfgf水溶液作为内水相，plga的有机溶液作为油相，两者经过复乳化，获得bfgf-plga溶液；

步骤4，除去所述步骤3获得的bfgf-plga溶液中的有机溶剂，再进行离心沉淀、冷冻干燥，获得bfgf-plga微球；

步骤5，将所述步骤4获得的bfgf-plga微球加入至步骤2获得的混合蛋白溶液中，搅拌均匀，并于-90～-50℃下进行预冻，再依次进行冷冻干燥、固化、再冷冻干燥处理，获得海绵状bfgf-plga微球药物缓释载体。

优选地，所述蚕茧为桑蚕茧或柞蚕茧。

优选地，所述步骤2中，所述乙酸溶液中乙酸的质量百分比为0.1～0.3％，所述混合蛋白溶液中胶原蛋白和丝素蛋白的质量百分比分别为5～10％和3～6％。

优选地，所述步骤3的具体方法为：将plga溶于有机溶剂中得到plga的有机溶液，将bfgf溶于双蒸水中得到bfgf的水溶液，再将bfgf的水溶液加入plga的有机溶液中，均化后形成初乳；再向所述初乳中加入聚乙烯醇溶液，通过高速乳均机作用，获得w/o/w型的bfgf-plga溶液；

优选地，所述plga是由50％pla和50％plg组成的。

优选地，所述高速乳均机乳均时的转速为1500～2500rpm，乳均时间为1～3min。

优选地，所述bfgf水溶液中bfgf的质量百分比为0.00001～0.001％，所述plga的有机溶液中plga的质量百分比为20～70％。

优选地，所述plga的有机溶液中的有机溶剂为二氯甲烷、四氢呋喃、甲苯、1，2-二氯乙烷中的至少一种。

优选地，所述步骤5中，所述预冻的时间为8h～30h。

优选地，所述步骤5中，所述固化时采用70～90％的乙醇进行固化处理20～30min。

与现有技术相比，本发明获得的海绵状bfgf-plga微球药物缓释载体达到既能很好的保持bfgf生物活性，并且在应用上有较长时间缓释的效果，该缓释载体又能与人体有很好的生物相容性；本发明的海绵状bfgf-plga微球药物缓释载体应用范围广泛，由于胶原具有迅速止血的功效，丝素蛋白具有较好的生物相容性，并且可以作为细胞生长的支架材料，因此可应用于大创伤的治疗和皮肤损伤修复等方面。

附图说明

图1为本发明实施例1获得的海绵状bfgf-plga微球药物缓释载体低倍下的电镜扫描图；

图2为本发明实施例1获得的海绵状bfgf-plga微球药物缓释载体高倍下的电镜扫描图；

图3为本发明实施例1获得的海绵状bfgf-plga微球药物缓释载体体外释放曲线图；

图4为本发明实施例1获得的海绵状bfgf-plga微球药物缓释载体对balb/c3t3细胞增殖作用曲线图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明实施例提供的一种海绵状bfgf-plga微球药物缓释载体的制备方法，该方法通过以下步骤实现：

步骤1，将蚕茧依次进行脱胶、溶解、过滤、透析、浓缩处理，获得丝素蛋白液；其中蚕茧为桑蚕茧或柞蚕茧；

步骤2，将i型胶原蛋白中加入乙酸溶液得到i型胶原蛋白的乙酸溶液，再将所述i型胶原蛋白的乙酸溶液加入至步骤1获得的丝素蛋白液中，获得丝素蛋白与i型胶原蛋白的混合蛋白溶液；其中，所述乙酸溶液中乙酸的质量百分比为0.1～0.3％，所述混合蛋白溶液中胶原蛋白和丝素蛋白的质量百分比分别为5～10％和3～6％；

步骤3，将plga(plga是由50％pla和50％plg组成的)溶于有机溶剂中得到plga有机溶液(作为油相)，将bfgf溶于双蒸水中得到bfgf的水溶液(作为水相)，再将bfgf水溶液加入plga有机溶液中，均化后形成初乳；再向所述初乳中加入聚乙烯醇溶液，通过高速乳均机作用(高速乳均机的转速为1500～2500rpm，乳均时间为1～3min)，形成w/o/w型的bfgf-plga溶液；其中，bfgf水溶液中bfgf的质量百分比为0.00001～0.001％，plga的有机溶液中plga的质量百分比为20～70％；plga的有机溶液中有机溶剂为二氯甲烷、四氢呋喃、甲苯、1，2-二氯乙烷中的至少一种，优选为二氯甲烷；

步骤4，再通过旋转蒸发仪减压旋转除去步骤3获得的bfgf-plga溶液中的有机溶剂，离心沉淀微球后冷冻干燥即得包封了bfgf的plga微球；

步骤5，将步骤4获得的bfgf-plga微球加入至步骤2获得的混合蛋白溶液中，搅拌均匀，并于-90～-50℃下进行预冻8h～30h，再依次进行冷冻干燥、使用70～90％的乙醇进行固化20～30min、再冷冻干燥处理，获得海绵状bfgf-plga微球药物缓释载体。

实施例1

步骤1，将桑蚕茧或柞蚕茧依次进行脱胶、溶解、过滤、透析、浓缩处理，获得丝素蛋白液；

步骤2，将i型胶原蛋白中加入质量百分比为0.2％的乙酸溶液得到i型胶原蛋白的乙酸溶液，再将i型胶原蛋白的乙酸溶液加入至步骤1获得的丝素蛋白液中，获得胶原蛋白、丝素蛋白的质量百分比分别为8％和4％的混合蛋白溶液；

步骤3，将plga(pla：plg＝50：50)溶于二氯甲烷中得到plga的质量百分比为50％的二氯甲烷溶液(作为油相)，将bfgf溶于双蒸水中得到bfgf的质量百分比为0.001％的水溶液(作为水相)，再将bfgf水溶液加入plga有机溶液中，均化后形成初乳；再向所述初乳中加入40ml质量百分比为1％的聚乙烯醇溶液，通过高速乳均机作用(高速乳均机的转速为2000rpm，乳均时间为2min)，形成w/o/w型的bfgf-plga溶液；