用于癌症治疗的化合物、组合物和方法与流程

在联邦政府资助的研究下进行的发明的权利声明

本发明是在政府支持下根据美国国立卫生研究院授予的批准号3u54hg005032进行的。政府对本发明享有一定的权利。

背景技术：

癌症每年导致美国超过550,000人死亡，全球超过800万人死亡。新的药物，包括小分子、影响组织特异性生长要求的分子以及免疫调节剂，已被证明有益于癌症具有独特基因组突变或其他特征的患者亚组。不幸的是，许多癌症患者仍然没有有效的治疗选择。

鉴定新的抗癌剂的一种方法是进行表型筛选，以发现在癌细胞系之间显示出强选择性的新型小分子，然后通过预测化学基因组学来鉴定与药物反应相关的细胞特征。在20世纪90年代，weinstein及其同事证明，化合物的细胞毒性特征可用于鉴定与药物敏感性相关的细胞特征，如基因表达谱和dna拷贝数。近年来，通过对大批量细胞系的自动化高通量化学敏感性测试以及细胞系的全面基因组和表型表征，鉴定介导其对小分子的响应的癌细胞系的特征的能力大大增加。小分子敏感性的表型观察可以与表达模式或体细胞改变相关联，如在曲妥单抗敏感的her2扩增的乳腺癌或埃罗替尼敏感的egfr突变肺癌的情况中。

savai等(expertopiniononinvestigationaldrugs，第19卷，第1期,2010，第117-131页)指出，用磷酸二酯酶抑制剂靶向癌症可能是治疗癌症的有前途有前途的方法。然而，几种磷酸二酯酶抑制剂已被批准用于临床治疗，包括用于心血管适应症和抑制血小板凝血的pde3抑制剂米力农、西洛他唑和左西孟旦，以及用于血小板增多症的pde3抑制剂阿那格雷，但无癌症适应症。pde抑制剂最近的质量评价(naturereviewsdrugdiscovery13,290-314，(2014))几乎没有提到癌症。从wo2014/164704中已知一些用于治疗癌症的新型pde3抑制剂。

在分子水平上表征恶性肿瘤的方法可用于对患者进行分级，从而快速指导他们进行有效的治疗。迫切需要用于预测患有癌症的受试者的响应性的改进方法。

技术实现要素：

如下所述，本发明涉及化合物、其制备方法和癌症治疗的方法。

该化合物适合治疗患有对磷酸二酯酶3a(pde3a)和/或磷酸二酯酶3b(pde3b)调节剂(例如，化合物1和2)的治疗敏感的癌症的患者，其通过在源自该患者的癌细胞中检测pde3a和/或pde3b和schlafen12(slfn12)多核苷酸或多肽的共表达和/或creb3l1多核苷酸或多肽表达减少的缺失。

在一方面，本发明提供具有以下结构的化合物

其中r¹在每种情况下相同且为cl或f或其药学上可接受的盐或前药。

在另一方面，本发明提供具有以下结构的化合物:

或其药学上可接受的盐或前药。

在另一方面，本发明提供具有以下结构的化合物:

或其药学上可接受的盐或前药。

在另一方面，本发明提供药物组合物，其包含一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂和式(i)的化合物

其中r¹在每种情况下相同且为cl或f或其药学上可接受的盐或前药。

在另一方面，本发明提供药物组合物，其包含一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂和选自以下的化合物之一:

或其药学上可接受的盐或前药。

在一方面，本发明提供杀死经选择对磷酸二酯酶3a(pde3a)和/或磷酸二酯酶3b(pde3b)调节剂有响应的癌细胞或减少其存活的方法，包括将细胞与具有以下结构的pde3a和/或pde3b调节剂接触:

其中r¹在每种情况下相同且为cl或f或其药学上可接受的盐或前药。

在一些实施方案中该细胞选择为相对参照具有增加水平的pde3a和/或pde3b或schlafen12(slfn12)多肽或多核苷酸，或其组合，从而减少所述癌细胞的存活。

在另一方面，本发明提供在预先经选择患有对pde3a和/或pde3b调节剂有响应的癌症的受试者中减少癌细胞增殖的方法，包括将细胞与具有以下结构的pde3a和/或pde3b调节剂接触:

其中r¹在每种情况下相同且为cl或f或其药学上可接受的盐或前药，且其中该受试者通过以下预先选择：检测相对参照pde3a和/或pde3b或schlafen12(slfn12)多肽或多核苷酸或其组合的水平的增加，从而在所述受试者中减少癌细胞增殖。

在一些实施方案中，所述受试者预先经选择，其通过检测相对参照，pde3a和/或pde3b多肽或多核苷酸水平的增加和检测slfn12多肽或多核苷酸水平的增加，从而在所述受试者中用式(i)的化合物治疗后减少癌细胞增殖。在一些实施方案中，所述受试者预先经选择，其通过检测相对参照，pde3a和/或pde3b多肽或多核苷酸水平的增加和检测slfn12多肽或多核苷酸水平的增加，从而在用式(i)的化合物治疗后在所述受试者中减少癌细胞增殖。

在另一方面，本发明提供治疗过度增殖性疾病，特别是癌症的方法，包括向需要的受试者给药式(i)的具有以下结构的化合物

其中r¹在每种情况下相同且为cl或f或其药学上可接受的盐或前药。

在另一方面，本发明提供治疗过度增殖性疾病，特别是癌症的方法，包括向需要的受试者给药式(i)的具有以下结构的化合物

其中r¹在每种情况下相同且为cl或f；或其药学上可接受的盐或前药，其中所述癌症对pde3a和/或pde3b调节剂有响应。

在另一方面，本发明提供治疗过度增殖性疾病，特别是癌症的方法，包括向需要的受试者给药具有以下结构的式(i)的化合物

其中r¹在每种情况下相同且为cl或f；或其药学上可接受的盐或前药，其中所述受试者已诊断为患有对pde3a和/或pde3b调节剂有响应的癌症。

在另一方面，本发明提供治疗过度增殖性疾病，特别是癌症的方法，包括向需要的受试者给药式(i)的具有以下结构的化合物

其中r¹在每种情况下相同且为cl或f，或其药学上可接受的盐或前药，其中所述癌症为骨癌、乳腺癌、子宫颈癌、结肠癌、子宫内膜癌、胃肠道间质瘤(gist)、头颈癌、造血系统癌、肾癌、平滑肌肉瘤、肝癌、肺癌、淋巴癌、黑素瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、皮肤癌、软组织肉瘤、甲状腺癌、泌尿道癌症。

在另一方面，本发明提供试剂盒，其用于在预先经选择对pde3a和/或pde3b调节剂有响应的受试者中减少癌细胞增殖，该pde3a和/或pde3b调节剂包含具有以下结构的化合物

其中r¹在每种情况下相同且为cl或f；或其药学上可接受的盐或前药。

在另一方面，本发明提供pde3a和/或pde3b调节剂在制备用于治疗癌症的药物中的用途，其中所述pde3a和/或pde3b调节剂为式(i)的具有以下结构的化合物

其中r¹在每种情况下相同且为cl或f；或其药学上可接受的盐或前药。

在另一方面，本发明提供pde3a和/或pde3b调节剂，其用于治疗癌症，其中所述pde3a和/或pde3b调节剂为式(i)的具有以下结构的化合物

其中r¹在每种情况下相同且为cl或f；或其药学上可接受的盐或前药。

在其它实施方案中，本发明提供pde3a和/或pde3b调节剂，其用于治疗癌症，其中所述pde3a和/或pde3b调节剂为式(i)的具有以下结构的化合物

其中r¹在每种情况下相同且为cl或f；或其药学上可接受的盐或前药，其中所述癌症为骨癌、乳腺癌、子宫颈癌、结肠癌、子宫内膜癌、胃肠道间质瘤(gist)、头颈癌、造血系统癌、肾癌、平滑肌肉瘤、肝癌、肺癌、淋巴癌、黑素瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、皮肤癌、软组织肉瘤、甲状腺癌、泌尿道癌症。

在本文描绘的任意方面的各种实施方案中，该pde3a和/或pde3b调节剂减少pde3a和/或pde3b的活性。

在不同实施方案中，所述pde3a和/或pde3b调节剂具有以下结构:

在一些其它实施方案中，本发明提供具有以下结构的化合物作为pde3a/pde3b调节剂:

或其药学上可接受的盐或前药。

在各种实施方案中本发明提供上述组合物和方法，其中所述pde3a/pde3b调节剂为化合物1。

在另一方面，本发明提供具有以下结构的化合物:

或其药学上可接受的盐或前药。

在各种实施方案中本发明提供上述组合物和方法，其中所述pde3a和/或pde3b调节剂为化合物2。

在本文描绘的任意方面的各种实施方案中，该方法包括检测相对参照creb3l1多肽或多核苷酸表达水平的减少的缺失。

在本文描绘的任意方面的各种实施方案中，该方法包括检测slfn12水平的增加。

在本文描绘的任意方面的各种实施方案中，所述生物样品为组织样品，其包括癌细胞。

在不同实施方案中，pde3a、pde3b、slfn12或creb3l1多肽的水平通过选择以下的方法检测：免疫印迹、质谱分析和免疫沉淀。

在不同实施方案中，pde3a、pde3b、slfn12或creb3l1多核苷酸的水平通过选择以下的方法检测：定量pcr、rna测序、northern印迹、微阵列、质谱分析和原位杂交。

在本文描绘的任意方面的各种实施方案中，经选择对磷酸二酯酶3a(pde3a)和/或磷酸二酯酶3b(pde3b)调节剂有响应的癌细胞表达creb3l1或相对参照没有creb3l1表达的缺失。

在各种实施方案中，所述经选择对磷酸二酯酶3a(pde3a)和/或磷酸二酯酶3b(pde3b)调节剂有响应的癌细胞为骨癌、乳腺癌、子宫颈癌、结肠癌、子宫内膜癌、胃肠道间质瘤(gist)、头颈癌、造血系统癌、肾癌、平滑肌肉瘤、肝癌、肺癌、淋巴癌、黑素瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、皮肤癌、软组织肉瘤、甲状腺癌、泌尿道癌细胞。

因此在本文描绘的任意方面的各种实施方案中，上面公开的方法进一步包括creb3l1多肽或多核苷酸相对参照的水平没有降低。

在本文描绘的任意方面的各种实施方案中，对磷酸二酯酶3a(pde3a)和/或磷酸二酯酶3b(pde3b)调节剂有抗性的癌细胞相对参照具有减少的creb3l1和/或slfn12表达或creb3l1和/或slfn12表达缺失。

在不同实施方案中，经选择对磷酸二酯酶3a(pde3a)和/或磷酸二酯酶3b(pde3b)调节剂有响应的癌细胞为皮肤癌(例如，黑素瘤)、子宫内膜癌、肺癌、造血系统癌/淋巴癌、卵巢癌、子宫颈癌、软组织肉瘤、平滑肌肉瘤、泌尿道癌、胰腺癌、甲状腺癌、肾癌、成胶质细胞瘤或乳腺癌细胞。

在不同实施方案中，经选择对磷酸二酯酶3a(pde3a)和/或磷酸二酯酶3b(pde3b)调节剂有响应的癌细胞为骨癌、乳腺癌、子宫颈癌、结肠癌、子宫内膜癌、胃肠道间质瘤(gist)、头颈癌、造血系统癌、肾癌、平滑肌肉瘤、肝癌、肺癌、淋巴癌、黑素瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、皮肤癌、软组织肉瘤、甲状腺癌、泌尿道癌细胞。

在本文描绘的任意方面的各种实施方案中，经选择对磷酸二酯酶3a(pde3a)和/或磷酸二酯酶3b(pde3b)调节剂有响应的癌细胞具有增加的pde3a和/或pde3b和schlafen12(slfn12)表达。

在本文描绘的任意方面的各种实施方案中，对磷酸二酯酶3a(pde3a)调节剂有抗性的癌细胞相对参照具有减少的creb3l1和/或slfn12表达或creb3l1和/或slfn12表达缺失。

本文中的“参照”是指在肿瘤细胞或肿瘤细胞系代表性组中的平均表达。

在本文描绘的任意方面的各种实施方案中，所述癌症对pde3a和/或pde3b调节剂有响应。

在不同实施方案中，所述受试者已诊断为患有对pde3a和/或pde3b调节剂有响应的癌症。

在不同实施方案中，所述癌症为黑素瘤、子宫内膜癌、肺癌、造血系统癌/淋巴癌、卵巢癌、子宫颈癌、软组织肉瘤、平滑肌肉瘤、泌尿道癌、胰腺癌、甲状腺癌、肾癌、成胶质细胞瘤或乳腺癌。

在不同实施方案中，所述癌症为皮肤癌(例如，黑素瘤)或子宫颈癌。

在本文描绘的任意方面的各种实施方案中，所述pde3a和/或pde3b调节剂口服给药。

在本文描绘的任意方面的各种实施方案中，所述pde3a和/或pde3b调节剂通过静脉注射给药。

在本文描绘的任意方面的各种实施方案中，所述pde3a/pde3b调节剂口服或静脉注射给药。

本发明提供治疗患有癌症的受试者的方法，该癌症鉴定为对用选自化合物1-2的pde3a和/或pde3b调节剂的治疗有响应，其通过检测癌症中pde3a和/或pde3b和schlafen12(slfn12)多核苷酸或多肽的共表达和/或creb3l1多核苷酸或多肽表达减少的缺失。

因此本发明进一步提供检测creb3l1多核苷酸或多肽表达的方法，其用于对使用化合物1或化合物2治疗的患者分级，其使用creb3l1多核苷酸或多肽的表达作为生物标记。

本发明进一步提供检测pde3a和/或pde3b和/或schlafen12(slfn12)多核苷酸或多肽表达的方法，其用于对使用化合物1或化合物2治疗的患者分级，其使用pde3a和/或pde3b和/或schlafen12(slfn12)多核苷酸或多肽的表达作为生物标记。

由本发明定义的组合物和制品是根据下面提供的实施例分离或制造的。本发明的其它特征和优点将从发明详述和权利要求中显而易见。

定义

除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所属领域的技术人员通常理解的含义。以下参考文献为本领域技术人员提供了本发明中使用的许多术语的一般定义：singleton等人,dictionaryofmicrobiologyandmolecularbiology(第2版，1994)；thecambridgedictionaryofscienceandtechnology(walker编，1988)；theglossaryofgenetics,第5版,r.rieger等人(编),springerverlag(1991)；和hale&marham,theharpercollinsdictionaryofbiology(1991)。如本文所用，除非另有说明，否则以下术语具有下面赋予它们的含义。

所谓“化合物1”是指具有以下结构的小分子抑制剂：

所谓“化合物2”是指具有以下结构的小分子抑制剂:

所画的结构包括围绕键的所有可允许的旋转。

在一些实施方案中，化合物1、化合物2的任一个，为小分子磷酸二酯酶抑制剂。

在一些实施方案中，可使用小分子磷酸二酯酶抑制剂或调节剂的组合。

在一些实施方案中，可使用化合物1-2的任何组合。

在一些实施方案中，可使用小分子磷酸二酯酶抑制剂或调节剂，尤其是化合物1-2，与抗癌剂的组合。

关于化合物1的合成的概述

存在几种制备化合物1的方法。上述方案中所示的数字是指在实验部分中编号和提供的方案。

在一个实施方案中，本发明提供制备化合物1的方法，所述方法包括以下步骤：

将式(iv)的化合物

与纯的吗啉在升高的温度，或与吗啉和碱，如胺或碳酸盐，尤其是n,n-二异丙基乙基胺，任选在极性非质子溶剂如醇或ch3cn中，在回流温度反应，以得到化合物(v)

然后将其与强碱，在极性非质子溶剂中在低温如-78°至-60℃反应，然后添加纯的或在极性非质子溶剂中的(c1-c4-烷基)溴乙酸酯或(c1-c4-烷基)氯乙酸酯，将混合物从初始低温(例如，-78℃)升温至室温，任选分离粗产物，然后在回流温度添加在极性质子有机溶剂中的肼或水合肼以得到外消旋化合物(1c)

随后分离化合物(1c)的对映异构体以得到化合物1和化合物(1a)

其中任选将化合物(1a)转化为外消旋化合物(1c)，然后其可被再次分离以获得从对映体分离的化合物1和化合物1a初始量的较少部分。

在另一实施方案中，本发明提供制备化合物1的方法，其中化合物(iv)

与强碱在极性非质子溶剂中在-78°至-60℃的低温反应，然后添加纯的或在极性非质子溶剂中的(c1-c4-烷基)溴乙酸酯或(c1-c4-烷基)氯乙酸酯，将混合物从初始低温(例如，-78℃)升温至室温，任选分离粗产物，然后在回流温度添加在极性质子有机溶剂中的肼或水合肼以制备化合物(vii)

且进一步使化合物(vii)与纯的吗啉在升高的温度，或与吗啉和碱在极性非质子溶剂中在回流温度反应以得到化合物(1c)

随后分离化合物(1c)的对映异构体以得到化合物1和化合物(1a)

其中任选将化合物(1a)转化为外消旋物质，然后可将其分离以得到化合物1和化合物(1a)初始量的较少部分。

在另一实施方案中，本发明提供中间体化合物(iv)、(v)、(vi)、(vii)，

用于制备化合物1的用途

本发明另一方面为制备化合物1的方法，所述方法包括将式(iv)的化合物

与纯的吗啉在升高的温度，或与吗啉和碱，如胺例如二异丙基胺、三乙胺、二异丙基乙基胺或碳酸盐例如碳酸钠、碳酸钙、碳酸镁，尤其是n,n-二异丙基乙基胺，任选在极性溶剂，如醇例如甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、丁醇(正丁醇、仲丁醇、叔丁醇)、甲氧基异丁醇、乙腈，但尤其是ch3cn中，在回流温度反应的步骤，以得到化合物(v)

然后将其与强碱，如氢化钠、丁基锂(ⁿbuli、^sbuli、^t-buli))、二异丙基胺基锂(lda)或六甲基二硅基胺基锂(lihmds)，尤其是lihmds，在极性非质子溶剂，如四氢呋喃、二噁烷、己烷、环己烷、甲苯，尤其是四氢呋喃中，在低温如-78°至-60℃，优选在-78℃反应，然后添加纯的或在四氢呋喃、二噁烷、己烷、环己烷、或甲苯中，尤其是在四氢呋喃或其它溶剂中的(c1-c4-烷基)溴乙酸酯或(c1-c4-烷基)氯乙酸酯，尤其是溴乙酸乙酯，使混合物从初始-78℃升温至室温，任选分离粗产物，然后在回流温度添加在极性质子有机溶剂，如水、甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、丁醇或甲氧基异丁醇中，优选在乙醇中的肼或水合肼，以得到外消旋化合物1c

随后分离化合物1c的对映异构体以得到化合物1和化合物(1a)

其中任选将化合物1a转化为化合物1c，然后可将其分离以得到化合物1和化合物1a初始量的较少部分。

本发明另一方面为化合物(v)和/或(vi)或(vii)

用于化合物1的用途

本发明另一方面为制备化合物1的方法，其中将化合物(iv)

与强碱，如氢化钠、丁基锂(ⁿbuli、^sbuli、^t-buli))、二异丙基胺基锂(lda)或六甲基二硅基胺基锂(lihmds)，尤其是lihmds，在极性非质子溶剂，如四氢呋喃、二噁烷、己烷、环己烷、甲苯，尤其是四氢呋喃中，在低温如-78°至-60℃，优选在-78℃反应，然后添加纯的或在四氢呋喃、二噁烷、己烷、环己烷、或甲苯中，尤其是在四氢呋喃或其它溶剂中的(c1-c4-烷基)溴乙酸酯或(c1-c4-烷基)氯乙酸酯，尤其是溴乙酸乙酯，使混合物从初始-78℃升温至室温，任选分离粗产物，然后在回流温度添加在极性质子有机溶剂，如水、甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、丁醇或甲氧基异丁醇中，优选在乙醇中的肼或水合肼，以得到外消旋化合物1c以制备化合物(vii)

且进一步使化合物(vii)与纯的吗啉在升高的温度，或与吗啉和碱，如胺例如三乙胺、二异丙基胺、n,n-二异丙基乙基胺、三乙胺或碳酸盐例如碳酸钠、碳酸钙、碳酸镁，尤其是n,n-二异丙基乙基胺，任选在极性非质子溶剂如醇例如甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、丁醇(正丁醇、仲丁醇、叔丁醇)、甲氧基异丁醇或乙腈(ch3cn)中，在回流温度反应，以得到化合物1c

随后分离化合物1c的对映异构体以得到化合物1和化合物(1a)

其中任选将化合物1a转化为化合物1c，然后可将其分离以得到化合物1和化合物1a初始量的较少部分。

因此本发明另一方面为化合物(iv)和(vii)制备化合物1的用途。

所谓“creb3l1多肽”是指与genbank登录号aah14097.1提供的序列具有至少85％氨基酸序列同一性的蛋白质或其片段，其在内质网应激时被断裂并具有转录因子活性。genbank登录号aah14097.1提供的氨基酸序列如下所示。

所谓“creb3l1多核苷酸”是指编码creb3l1多肽或其片段的任何核酸分子，包括dna和rna。示例性creb3l1核酸序列在ncbi参考号：nm_052854.3提供。ncbi参考号：nm_052854.3提供的序列如下再现:

所谓“pde3a多肽”是指与在ncbi参考号np_000912.3提供的序列具有至少85％氨基酸序列同一性的蛋白质或其片段，其催化环一磷酸腺苷(camp)和环一磷酸鸟苷(cgmp)的水解。示例性的人全长pde3a氨基酸序列如下提供：

已知三种pde3a同工型：pde3a1、pde3a2和pde3a3。pde3a1包含全长pde3a氨基酸序列的氨基酸146-1141，pde3a2亚型2包含全长pde3a氨基酸序列的氨基酸299-1141，且pde3a3包含全长pde3a氨基酸序列的氨基酸483-1141。

所谓“pde3a多核苷酸”是指编码pde3a多肽或其片段的任何核酸分子，包括dna和rna。示例性pde3a核酸序列在ncbi参考号：nm_000921.4提供:

所谓“schlafen12(slfn12)多肽”是指与在ncbi参考号np_060512.3提供的序列具有至少85％氨基酸序列同一性的蛋白质或其片段，其当与本文所述的化合物之一结合时与pde3a相互作用。示例性人slfn12氨基酸序列如下提供：

所谓“schlafen12(slfn12)多核苷酸”是指编码slfn12多肽或其片段的任何核酸分子，包括dna和rna。示例性slfn12核酸序列在ncbi参考号：nm_018042.4提供:

所谓“pde3b多核苷酸”是指编码pde3b多肽或其片段的任何核酸分子，包括dna和rna。示例性pde3b核酸序列在ncbi参考号：nm_000922.3提供:

所谓“pde3b多肽”是指与在ncbi参考号np_000913.2提供的序列具有至少85％氨基酸序列同一性的蛋白质或其片段。示例性人pde3b氨基酸序列在以下提供：

在一些方面，所述化合物为异构体。"异构体"为具有相同分子式的不同化合物。"立体异构体"为不同仅在于原子在空间排列的方式的异构体。如本文所述，术语"异构体"包括任何和所有几何异构体和立体异构体。例如，"异构体"包括几何双键顺-和反-异构体，也称为e-和z-异构体；r-和s-对映异构体；非对映异构体，(d)-异构体和(l)-异构体，其外消旋混合物；和它们的其它混合物也落在本发明的范围内

符号表示可以为如本文描述的单键、双键或三键的键。本文提供由取代基排列在碳-碳双键周围或取代基排列在碳环周围得到的各种几何学异构体及其混合物。碳-碳双键周围的取代基指定为“z”或“e”构型，其中术语“z”和“e”是根据iupac标准使用。除非另有说明，描述双键的结构同时涵盖“e”和“z”异构体。

碳-碳双键周围的取代基可选地可以称为“顺式”或“反式”，其中“顺式”代表取代基在双键同侧，″反式″代表取代基在双键对侧。取代基在碳环周围的排列也可以指定为″顺式″或″反式″。术语“顺式”代表取代基在环平面的同侧，术语“反式”代表取代基在环平面的对侧。其中取代基位于环平面的同侧和对侧的化合物的混合物指定为“顺式/反式”。

术语“对映异构体”是指具有彼此为不能重叠的镜像的一对立体异构体。具有不对称组的取代基的原子可产生对映异构体。一对对映异构体的任何比例的混合物可以称为“外消旋”混合物。当合适时，术语“(±)”用于指外消旋混合物。“非对映异构体”是具有至少两个不对称原子的立体异构体，且彼此不成镜像。绝对立体化学是根据cahn-ingold-prelogr-s系统指定的。当化合物为对映异构体时，各个手性碳的立体化学可以表示为r或s。未知绝对构型的拆分化合物可根据其使波长为钠d线的平面偏振光旋转的方向(右旋或左旋)来指定(+)或(-)。本文描述的某些化合物包含一个或多个不对称中心，因此可生成对映异构体、非对映异构体和其它立体异构形式，可以根据在各不对称原子的绝对立体化学将其定义为(r)-或(s)-。本发明化学实体、药物组合物和方法意味着包括所有此类可能的异构体(包括外消旋混合物、光学基本上纯形式和介于其间的混合物)。

光学活性的(r)-异构体和(s)-异构体可使用例如手性合成子或手性试剂制备，或使用常规技术拆分。可以通过本领域技术人员已知的任何方法从外消旋混合物分离对映异构体，所述方法包括手性高压液相色谱(hplc)、手性盐的形成和结晶或者通过不对称合成制备。

光学异构体可通过根据常规方法拆分外消旋混合物，例如通过用光学活性酸或碱处理来形成非对映异构盐加以获得。适当酸的实例为酒石酸、二乙酰基酒石酸、二苯甲酰基酒石酸、二甲苯酰基酒石酸和樟脑磺酸。通过结晶分离非对映异构体的混合物，随后使光学活性碱从这些盐释放提供异构体的分离。另一方法涉及通过使公开的化合物与呈活化形式的光学纯酸或光学纯异氰酸酯反应来合成共价非对映异构分子。合成的非对映异构体可通过常规手段，诸如色谱法、蒸馏、结晶或升华来分离，接着水解以提供对映异构富集的化合物。光学活性化合物也可通过使用活性起始物质来获得。在一些实施方案中，这些异构体可呈游离酸、游离碱、酯或盐形式。

在某些实施方案中，本发明的化合物可是互变异构体。如本文所用，术语“互变异构体”是一种类型的异构体，其包括两种或更多种由氢原子的至少一种形式迁移和至少一种化合价变化(例如单键成为双键，三键成为单键，或反之亦然)产生的可互相转化的化合物。“互变异构”包括质子移变或质子转移互变异构，其被视为酸-碱化学的一个亚组。“质子移变互变异构”或“质子转移互变异构”涉及伴有键级变化的质子迁移。互变异构体的精确比率取决于若干因素，包括温度、溶剂和ph。当互变异构是可能的(例如在溶液中)时，可达到互变异构体的化学平衡。互变异构(即提供互变异构对的反应)可由酸或碱催化，或可在无外部试剂作用或存在下发生。示例性互变异构体包括但不限于酮至烯醇；酰胺至酰亚胺；内酰胺至内酰亚胺；烯胺至亚胺；以及烯胺至(不同)烯胺互变异构。酮-烯醇互变异构的一个具体实例是戊烷-2,4-二酮和4-羟基戊-3-烯-2-酮互变异构体的相互转化。互变异构的另一实例是酚-酮互变异构。酚-酮互变异构的一个具体实例是吡啶-4-醇和吡啶-4(1h)-酮互变异构体的相互转化。

除非特别指明具体的立体化学或异构体形式，否则结构的所有手性、非对映异构体、外消旋和几何异构体形式都是预期的。用于制备本发明化合物和其中制备的中间体的所有方法被认为是本发明的一部分。所示或描述的化合物的所有互变异构体也被认为是本发明的一部分。

“试剂”是指任何小分子化学化合物、抗体、核酸分子或多肽或其片段。

“改善”意指降低、抑制、减弱、减少、阻滞或稳定疾病的发展或进展。

“改变”是指基因或多肽的表达水平或活性的变化(增加或减少)，如本领域标准的已知方法所检测，如本文所述的那些。如本文所述，在一个实施方案中，改变包括表达水平的约10％变化，优选约25％变化，更优选约40％变化，且最优选表达水平的约50％或更大变化。在某些实施方案中，改变包括表达水平的10％或更少(包括10％)的变化，优选25％或更少(包括25％)的变化，更优选40％或更少(包括40％)的变化，且最优选表达水平的50％或更少(包括50％)或更大变化。在其它实施方案中，改变包括表达水平的9％-11％(包括9％和11％)的变化，优选10％-25％(包括10％和25％)的变化，更优选25％-40％(包括25％和40％)的变化，且最优选表达水平的40％-50％(包括40％-50％)或大于50％(包括50％)的变化。在其它某些实施方案中，改变包括表达水平的9％-11％(包括9％和11％)的变化，优选22％-28％(包括22％和28％)的变化，更优选35％-45％(包括35％和45％)的变化，且最优选表达水平的45％-55％(包括45％-55％)或大于或等于55％的变化。

“类似物”意指不相同但是具有类似的功能或结构特征的分子。例如，多肽类似物保留相应的天然存在的多肽的生物学活性，同时相对于天然存在的多肽具有增强类似物的功能的某些生物化学修饰。此类生物化学修饰可以提高类似物的蛋白酶抗性、膜通透性或半衰期，而不改变例如配体结合。类似物可以包括非天然的氨基酸。

在本公开中，“包含”、“包括”、“含有”和“具有”等可以具有美国专利法赋予它们的意义，并且可以意指“包括”等；同样地，“基本上由…组成”同样具有美国专利法赋予的意义，并且该术语是开放式的，允许存在叙述项以外的其他因素，只要叙述项的基本或新颖特征不因该叙述项以外的因素的存在而变化，但是排除现有技术实施方案。

“检测”指鉴定要检测的分析物的存在、不存在或量。在具体实施方案中，所述分析物为pde3a或pde3ab或slfn12多肽。

“疾病”意指损害或干扰细胞、组织或器官的正常功能的任何疾患或病症。疾病的实例包括黑素瘤、腺癌、肺癌、子宫颈癌、肝癌和乳腺癌。

“有效量”意指相对于未治疗的患者改善疾病症状需要的本文所述的化合物的量。用于实施本发明以治疗性处理疾病的活性化合物的有效量随施用方式、受试者的年龄、体重和一般健康而变化。最后，主治医生或兽医会决定合适的量和剂量方案。此类量称为“有效”量。在其它实施方案中，所述pde3a和/或pde3b调节剂为化合物1、化合物2。

本发明提供了许多靶标，其可用于开发治疗以本文描述的方法为特征的病症的高度特异性的药物。此外，本发明的方法提供了一种简便的方法来鉴定对受试者安全使用的疗法。此外，本发明的方法提供了用于分析几乎任何数目的化合物对本文所述疾病的影响的途径，其具有高体积通量、高灵敏度和低复杂性。

"片段"是指多肽或核酸分子的一部分。该部分包含，优选地，参照核酸分子或多肽整个长度的至少约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、或约90％。在某些实施方案中该部分包含，优选地，参照核酸分子或多肽整个长度的至少9％-11％(包括9％和11％)、18％-22％(包括18％和22％)、27％-33％(包括27％和33％)、36％-44％(包括36％和44％)、45％-55％(包括45％和55％)、54％-66％(包括54％和66％)、63％-77％(包括63％和77％)、72％-88％(包括72％和88％)、或81％-99％(包括81％和99％)。一个片段可包含约10、约20、约30、约40、约50、约60、约70、约80、约90、约100、约200、约300、约400、约500、约600、约700、约800、约900、或约1000个核苷酸或氨基酸。在某些实施方案中，一个片段可包含9-11、约18-22、27-33、36-44、45-55、54-66、63-77、72-88、81-99、90-110、180-220、270-330、360-440、450-550、540-660、630-770、720-880、810-990、或900-1100个核苷酸或氨基酸(包括各个所述的极限值，例如对于“9-11”意味着包括9和11)。

“血液肿瘤”包括侵袭性和惰性形式的白血病和淋巴瘤，即非霍奇金病、慢性和急性髓性白血病(cml/aml)、急性成淋巴细胞白血病(all)，霍奇金病，多发性骨髓瘤和t细胞淋巴瘤。还包括骨髓增生异常综合征，浆细胞瘤，副肿瘤综合征，原发部位未知的癌症以及aids相关的恶性肿瘤。

“杂交”是指氢键合，其可以是互补核碱基之间的watson-crick、hoogsteen或反向hoogsteen氢键。例如，腺嘌呤和胸腺嘧啶是互补的核碱基，其通过形成氢键而配对。

“过度增殖性疾病”包括例如牛皮癣、瘢痕瘤和其它影响皮肤的增生，良性过度增殖性疾病，造血系统过度增殖性疾病，癌症(例如，转移性或恶性肿瘤，实体瘤和血液肿瘤)。

“良性过度增殖性疾病”包括例如，子宫内膜异位、平滑肌瘤和良性前列腺增生。

“造血过度增殖性疾病”也称为肌增殖(myoproliferative)疾病包括例如真性红细胞增多症、特发性血小板增多症、血小板增多症、原发性骨髓纤维化，等等。

所谓“标记”或“生物标记”是指具有与疾病或障碍相关的表达水平或活性(例如，在蛋白质或mrna水平)的改变的任何蛋白质或多核苷酸。在具体实施方案中，本发明的标记为pde3a或pde3b或slfn12或creb3l1。

“调节剂”是指任何与多肽结合并改变多肽的生物学功能或活性的试剂。调节剂包括但不限于降低或消除多肽的生物学功能或活性的试剂(例如“抑制剂”)。例如，调节剂可以抑制多肽的催化活性。调节剂包括但不限于增加或减少多肽与另一种试剂结合的试剂。例如，调节剂可以促进多肽与另一种多肽的结合。在一些实施方案中，pde3a/pde3b多肽的调节剂是dnmdp。在一些其他实施方案中，pde3a/pde3b多肽的调节剂是阿那格雷或扎达维林。在其他实施方案中，pde3a/pde3b多肽的调节剂是化合物1、化合物2。

术语“前药(一种或多种)”表示本身可以是生物学活性或无活性的化合物，但在它们在体内的停留时间内转化(例如代谢或水解)成本发明的化合物。在生物系统中转化为化合物1或其盐的化合物1及其盐的衍生物(生物前体或前药)包括在本发明中。所述生物系统可以是例如哺乳动物生物，特别是人类受试者。生物前体例如通过代谢过程转化为化合物1或2或其盐。

所谓“参照”是指标准或对照条件。

可用于本发明的方法的核酸分子包括编码本发明的多肽或其片段的任何核酸分子。此类核酸分子不需要与内源核酸序列是100％相同的，而是通常会展现出基本上同一性。与内源序列具有“基本上同一性”的多核苷酸通常能够与双链核酸分子的至少一条链杂交。可用于本发明的方法的核酸分子包括编码本发明的多肽或其片段的任何核酸分子。此类核酸分子不需要与内源核酸序列是100％相同的，而是通常会展现出基本上同一性。与内源序列具有“基本上同一性”的多核苷酸通常能够与双链核酸分子的至少一条链杂交。

“杂交”指在各种严苛条件下配对以形成互补多核苷酸序列(例如本文中描述的基因)或其部分间的双链分子。(参见，例如，wahl，g.m.ands.l.berger(1987)methodsenzymol.152:399；kimmel，a.r.(1987)methodsenzymol.152:507)。

例如，严苛的盐浓度通常是小于约750mmnacl和75mm柠檬酸三钠，优选小于约500mmnacl和50mm柠檬酸三钠，并且更优选小于约250mmnacl和25mm柠檬酸三钠。可以在不存在有机溶剂，例如甲酰胺的情况下获得低严苛性杂交，而可以在存在至少约35％甲酰胺，并且更优选至少约50％甲酰胺的情况下获得高严苛性杂交。严苛温度条件通常会包括至少约30℃，更优选至少约37℃，并且最优选至少约42℃的温度。改变其他的参数，如杂交时间、去污剂，例如十二烷硫酸钠(sds)的浓度和载体dna的纳入或排除是本领域技术人员公知的。通过根据需要组合这些各种条件实现各种严苛性水平。在优选的实施方案中，在30℃在750mmnacl、75mm柠檬酸三钠和1％sds中发生杂交。在更优选的实施方案中，在37℃在500mmnacl、50mm柠檬酸三钠、1％sds、35％甲酰胺和100μg/ml变性的鲑鱼精dna(ssdna)中发生杂交。在最优选的实施方案中，在42℃在250mmnacl、25mm柠檬酸三钠、1％sds、50％甲酰胺和200μg/mlssdna中发生杂交。这些条件的有用的变化对于本领域技术人员是非常显而易见的。

对于大多数应用，杂交后的洗涤步骤在严苛性上也发生变化。洗涤严苛性条件可以以盐浓度和温度限定。如上文，可以通过降低盐浓度或者通过提高温度提高洗涤严苛性。例如，用于洗涤步骤的严苛的盐浓度优选将是小于约30mmnacl和3mm柠檬酸三钠，并且最优选小于约15mmnacl和1.5mm柠檬酸三钠。用于洗涤步骤的严苛温度条件一般将包括至少约25℃，更优选至少约42℃，并且甚至更优选至少约68℃的温度。在优选的实施方案中，在25℃在30mmnacl、3mm柠檬酸三钠和0.1％sds中发生洗涤步骤。在更优选的实施方案中，在42℃在15mmnacl、1.5mm柠檬酸三钠和0.1％sds中发生洗涤步骤。在更优选的实施方案中，在68℃在15mmnacl、1.5mm柠檬酸三钠和0.1％sds中发生洗涤步骤。这些条件的另外的变化对于本领域技术人员将是非常显而易见的。杂交技术是本领域技术人员公知的，并且记载于例如benton和davis(science196:180，1977)；grunstein和hogness(proc.natl.acad.sci.，usa72:3961，1975)；ausubel等人(currentprotocolsinmolecularbiology，wileyinterscience，newyork，2001)；berger和kimmel(guidetomolecularcloningtechniques，1987，academicpress，newyork)；和sambrook等人，molecularcloning：alaboratorymanual，coldspringharborlaboratorypress，newyork。

“实体瘤”包括例如乳腺、呼吸道、脑、骨、中枢和外周神经系统、结肠、直肠、肛门、生殖器官(例如，子宫颈、卵巢、前列腺)、胃肠道、泌尿生殖道、内分泌腺(如甲状腺和肾上腺皮质)、甲状腺、甲状旁腺、食道、子宫内膜、眼、生殖细胞、头部和颈部、肾、肝、喉和下咽、肺、间皮瘤、胰腺、前列腺、直肠、肾、小肠、皮肤、软组织、胃、睾丸、输尿管、阴道和外阴和结缔组织的肿瘤，以及这些肿瘤的转移。恶性肿瘤包括遗传性癌症，例如视网膜母细胞瘤和维尔姆斯肿瘤。

可治疗的“乳腺肿瘤”包括，例如，具有阳性激素受体状态的乳腺癌、具有阴性激素受体状态的乳腺癌、her-2-阳性乳腺癌、激素受体-和her-2-阴性乳腺癌、brca-相关的乳腺癌和炎性乳腺癌。

可治疗的“呼吸道肿瘤”包括，例如，非小细胞支气管癌和小细胞支气管癌、非小细胞肺癌和小细胞肺癌。

可治疗的“脑肿瘤”包括，例如，神经胶质瘤、胶质母细胞瘤、星形细胞瘤、脑膜瘤和成神经管细胞瘤。

可治疗的“男性生殖器官肿瘤”包括，例如，前列腺癌、恶性附睾肿瘤、恶性睾丸瘤和阴茎癌。

可治疗的“女性生殖器官肿瘤”包括，例如，子宫内膜癌、子宫颈癌、卵巢癌、阴道癌和外阴癌。

可治疗的“胃肠道肿瘤”包括，例如，结肠直肠的癌、肛门癌、胃癌、胰腺癌、食管癌、胆囊癌、小肠癌、唾液腺癌、神经内分泌肿瘤和胃肠道间质瘤。

可治疗的“泌尿生殖道肿瘤”包括，例如，膀胱癌、肾细胞癌、和肾盂和泌尿道的癌。

可治疗的“眼肿瘤”包括，例如，视网膜母细胞瘤和眼内黑素瘤。

可治疗的“肝肿瘤”包括，例如，肝细胞癌和胆管细胞癌。

可治疗的“皮肤肿瘤”包括，例如，恶性黑素瘤、基底细胞瘤、spinalioma、卡波西肉瘤和梅克尔细胞癌。

可治疗的“头与颈肿瘤”包括，例如，喉癌以及咽部和口腔癌。

可治疗的“肉瘤”包括，例如，软组织肉瘤、滑膜肉瘤、横纹肌样肉瘤和骨肉瘤。

可治疗的淋巴瘤包括，例如，非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、皮肤淋巴瘤、中枢神经系统淋巴瘤和aids-相关的淋巴瘤。

可治疗的白血病包括，例如，急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病、急性淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病和毛细胞白血病。

“基本上相同”意指与参照氨基酸序列(例如本文中描述的任一种氨基酸序列)或核酸序列(例如，本文中描述的任一种核酸序列)展现至少50％同一性的多肽或核酸分子。优选地，此类序列与用于比较的序列在氨基酸水平或核酸上是至少60％，更优选80％或85％，并且更优选90％、95％或甚至99％相同。

通常使用序列分析软件(例如，sequenceanalysissoftwarepackageofthegeneticscomputergroup,universityofwisconsinbiotechnologycenter,1710universityavenue,madison,wis.53705，blast，bestfit，gap或pileup/prettybox程序)测量序列同一性。此类软件通过将同源性程度归属到各种取代、缺失和/或其它修饰来匹配相同或相似的序列。保守取代通常包括以下组内的取代：甘氨酸，丙氨酸；缬氨酸，异亮氨酸，亮氨酸；天冬氨酸，谷氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺；丝氨酸，苏氨酸；赖氨酸，精氨酸；和苯丙氨酸，酪氨酸。在测定同一性程度的示例性的方法中，可以使用blast程序，在e^-3和e^-100之间的概率得分指示紧密相关的序列。

“受试者”意指哺乳动物，包括但不限于人或非人哺乳动物，如牛、马、犬、绵羊或猫。

本文中提供的范围理解为该范围内的所有数值的速记。例如，1至50的范围理解为包括来自下组的任何数目、数目的组合或亚范围：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50。

如本文中使用，术语“治疗/处理”等指降低或改善病症和/或与其相关的症状。应当理解，虽然未排除，但是治疗病症或疾患不需要完全消除病症、疾患或与其相关的症状。

除非明确叙述或根据上下文明显的，如本文中使用，术语“或”理解为包括在内的。除非明确叙述或根据上下文明显的，如本文中使用，术语“一个/种”和“所述/该”理解为单数或复数。

除非明确叙述或根据上下文明显的，如本文中使用，术语“约”理解为在本领域中的正常容差的范围内，例如在平均值的2个标准偏差内。约可以理解为在所述数值的10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.1％、0.05％或0.01％内。除非另外根据上下文清楚，本文中提供的所有数值以术语“约”来修饰。

除非特别说明或从上下文中显而易见，否则如本文所用，如果提供范围，则总是意味着包括上限和下限。

本文中的变量的任何定义中的一批化学基团的叙述包括定义所述变量为所列基团的任何单一基团或组合。本文中的变量或方面的实施方案的叙述包括作为任何单一实施方案或与任何其它实施方案或其部分组合的该实施方案。

本文中提供的任何组合物或方法可以与本文中提供了一种或多种任何其它组合物和方法组合。

附图简述

结合下面提供的实施例，将由本发明限定的组合物和物品分离或另外制备。根据详细描述和权利要求，本发明的其他特征和优点将显而易见。

图1提供了通过实施例2中公开的方法获得的化合物1和化合物2在hela细胞中的剂量响应曲线。

图2提供了化合物1和化合物2在hut78细胞中的剂量响应曲线，该hut78细胞缺乏pde3a表达但表达升高水平的pde3b和slfn12。

图3是免疫印迹，显示在化合物敏感性细胞系hut78和rvh421中内源性pde3a蛋白表达的缺乏，与hela细胞中pde3a的高表达形成对照。粘着斑蛋白作为负载对照检测。

图4是显示pde3a-crispra2058细胞中pde3a表达缺失的免疫印迹。粘着斑蛋白作为负载对照检测。

图5显示化合物1在敏感性细胞系a2058中的剂量响应曲线，该敏感性细胞系a2058通过crispr敲除内源性pde3a而具有抗性。尽管gfp的异位表达对化合物1的缺乏响应没有影响，但pde3b的异位表达使缺乏pde3a的a2058细胞对化合物1细胞毒性作用再敏化。

发明详述

本发明至少部分基于以下发现，即化合物1和2对磷酸二酯酶3a调节(pde3a调节)和/或磷酸二酯酶3bpde3b调节确实具有敏感性，且确实在人肝细胞中具有增加的稳定性和/或在狗中具有减少的清除率。

因此，本发明提供了选择患有对pde3a/pde3b调节剂尤其是化合物1和/或化合物2响应的癌症的受试者的方法，其中所述选择方法涉及在来源于这种受试者的癌细胞中检测pde3a和/或pde3b和schlafen12(slfn12)多肽或多核苷酸的共表达。

在一个具体的实施方案中，creb3l1和/或slfn12多核苷酸或多肽的表达在已获得对pde3a/pde3b调节剂的抗性的癌细胞中降低或不可检测。

pde3a/pde3b调节剂

pde3a/pde3b调节剂的鉴定是与被设计用于鉴定突变tp53背景中的细胞毒性小分子的表型筛选相关联的。预测性化学基因组学方法补充了靶标驱动的药物研发计划，其由广泛的体外和体内靶标验证组成，并且也可以被称为逆向化学基因组学(zheng等人，currissuesmolbiol4,33-43,2002)。许多美国食品和药物管理局(fda)批准的靶向疗法已经以此方式研发，其中包括靶向致癌体细胞驱动突变的小分子激酶抑制剂(moffat等人，natrevdrugdiscov13,588-602,2014)。然而，靶向疗法的发现和研发往往受到靶标生物学功能知识的局限性、其作用机制和选择性抑制靶标的可用化学物质的限制。

表型筛选可以发现癌症治疗的新靶点，其特定分子机制通常由未来研究阐明(swinney等人，natrevdrugdiscov10,507-519,2011)。近年来，通过无偏的表型筛选努力发现的两类抗癌药物已经被fda批准。发现来那度胺和泊马度胺是e3-连接酶的调节剂，其改变了其靶标的亲和力，导致谱系特异性转录因子的降解(等人,science343,301-305,2014；lu等人,science343,305-309,2014)，而罗米地辛和伏立诺他后来被确定为组蛋白脱乙酰酶(hdac)抑制剂(moffat等人,natrevdrugdiscov13,588-602,2014；nakajima等人,exp.cellres.241,126-133,1998,marks等人,natbiotechnol25,84-90,2007)。

肿瘤抑制基因的改变是表型筛选的合适目标，因为它们不能用小分子直接靶向，尽管合成致死方法如奥拉帕尼治疗brca1/brca2突变型癌症已被证明是有效的。根据目前的知识，tp53肿瘤抑制基因是人类癌症中发生频率最高的突变，在进行整个外显子组测序的4742例癌症中有36％检测到体细胞突变。尽管进行了许多尝试，但没有发现选择性杀死tp53突变细胞的化合物。

被研发用于鉴定在tp53突变体癌细胞中引起合成致死性的小分子的表型筛选能够偶然发现一类用作磷酸二酯酶3a(pde3a)和磷酸二酯酶3b(pde3b)调节剂的癌症选择性细胞毒性剂，如下文所述。环核苷酸磷酸二酯酶催化第二信使分子环状腺苷一磷酸(camp)和环状鸟苷一磷酸(cgmp)的水解，并且在许多生理过程中很重要。几种磷酸二酯酶抑制剂已被批准用于临床治疗，包括用于心血管适应症和血小板凝固抑制的pde3抑制剂米力农，西洛他唑和左西孟旦，以及用于血小板增多症的pde3抑制剂阿那格雷。其它pde3a抑制剂从wo2014/164704已知。pde5抑制剂如瓦地那非用于包括勃起功能障碍和肺动脉高压在内的平滑肌障碍，以及pde4抑制剂罗氟司特减少慢性阻塞性肺病(copd)的恶化。

磷酸二酯酶抑制剂通过直接抑制其靶标或通过变构调节起作用；例如，pde4的结构分析导致设计pde4d和pde4b变构调节剂(burgin等人，natbiotechnol28,63-70,2010；gurney等人，neurotherapeutics12,49-56,2015)。下文提供的数据表明癌症细胞毒性磷酸二酯酶调节剂dnmdp可能通过类似的变构机制起作用。

因此，本发明提供鉴定具有恶性肿瘤的受试者的方法，该恶性肿瘤很可能对pde3a/pde3b调节剂治疗，尤其是化合物1和/或化合物2的治疗有响应，该鉴定方法基于在受试者生物样品(包括癌细胞)中pde3a和slfn12表达的水平。

在具体实施方案中，本发明提供鉴定具有恶性肿瘤的受试者的方法，该恶性肿瘤对pde3a调节剂，尤其是化合物1和或化合物2的治疗有抗性，该鉴定方法基于creb3l1和/或slfn12表达的缺失或相对参照creb3l1和/或slfn12表达水平的减少。

化合物形式和盐

本发明的化合物包括化合物自身以及其盐和前药(如果可适用的话)。

盐例如可在阴离子与本文所述的化合物上的荷正电的取代基(例如，氨基)之间形成。适合的阴离子包括氯离子、溴离子、碘离子、硫酸根、硝酸根、磷酸根、柠檬酸根、甲磺酸根、三氟乙酸根和乙酸根。同样地，盐还可在阳离子与本文所述的化合物上的荷负电的取代基(例如，羧酸根/盐)之间形成。适合的阳离子包括钠离子、钾离子、镁离子、钙离子和铵阳离子例如四甲基铵离子。前药的实例包括羧酸基团的c1-6烷基酯，其在施用于个体后能够提供活性化合物。

本发明的化合物的可药用盐包括衍生自可药用的无机和有机酸和碱的那些。如本文使用的，术语“可药用盐”是指通过将可药用酸或碱加至本文所公开的化合物而形成的盐。如本文使用的，短语“可药用的”是指从毒理学前景来说对于在药物应用中的使用是可接受的并且不会不利地与活性成分相互作用的物质。

本发明化合物的合适的药学上可接受的盐可以是，例如，在链或环中带有氮原子的本发明化合物的酸加成盐，例如，它是足够碱性的，例如，与无机酸或“矿物酸”的酸加成盐，例如盐酸、氢溴酸、氢碘酸、硫酸、氨基磺酸、重硫酸(bisulfuricacid)、磷酸或硝酸，或与有机酸的酸加成盐，如甲酸、乙酸、乙酰乙酸、丙酮酸、三氟乙酸、丙酸、丁酸、己酸、庚酸、十一烷酸、月桂酸、苯甲酸、水杨酸、2-(4-羟基苯甲酰基)-苯甲酸、樟脑酸、肉桂酸、环戊烷丙酸、二葡萄糖酸、3-羟基-2-萘甲酸、烟碱、双羟萘酸、果胶酯酸、3-苯基丙酸、新戊酸、2-羟基乙磺酸、衣康酸、三氟甲磺酸、十二烷基硫酸、乙磺酸、苯磺酸、对甲苯磺酸、甲磺酸、2-萘磺酸、萘二磺酸、樟脑磺酸、柠檬酸、酒石酸、硬脂酸、乳酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、苹果酸、己二酸、海藻酸、马来酸、富马酸、d-葡糖酸、扁桃酸、抗坏血酸、葡庚酸、甘油磷酸、天冬氨酸、磺基水杨酸或硫氰酸。

合适的酸式盐的其它实例包括乙酸盐、己二酸盐、藻酸盐、天冬氨酸盐、苯甲酸盐、苯磺酸盐、硫酸氢盐、丁酸盐、柠檬酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、二葡糖酸盐、十二烷基硫酸盐、乙磺酸盐、甲酸盐、富马酸盐、葡庚糖酸盐(glucoheptanoate)、羟乙酸盐、半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、2-羟基乙磺酸盐、乳酸盐、马来酸盐、丙二酸盐、甲磺酸盐、2-萘磺酸盐、烟酸盐、硝酸盐、扑酸盐、果胶酸盐、过硫酸盐、3-苯基丙酸盐、磷酸盐、苦味酸盐、新戊酸盐、丙酸盐、水杨酸盐、琥珀酸盐、硫酸盐、酒石酸盐、硫氰酸盐、甲苯磺酸盐和十一酸盐。其它酸(例如草酸)，其本身并非药学上可接受的，但是可以在制备盐中用作中间体，以获得本发明化合物及其可药用的酸加成盐。

此外，足够碱性的化合物1-2，尤其是化合物1的其它合适的药学上可接受的盐，是碱金属盐，例如钠或钾盐，碱土金属盐，例如钙、镁或锶盐，或铝或锌盐，或衍生自氨或具有1至20个碳原子的有机伯、仲或叔胺的铵盐，如乙基胺、二乙基胺、三乙胺、乙基二异丙基胺、单乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、二环己基胺、二甲基氨基乙醇、二乙基氨基乙醇、三(羟基甲基)氨基甲烷、普鲁卡因、二苄基胺、n-甲基吗啉、精氨酸、赖氨酸、1,2-乙二胺、n-甲基哌啶、n-甲基-葡糖胺、n,n-二甲基-葡糖胺、n-乙基-葡糖胺、1,6-己烷二胺、葡糖胺、肌氨酸、丝氨醇、2-氨基-1,3-丙二醇、3-氨基-1,2-丙二醇、4-氨基-1,2,3-丁三醇，或具有含1至20个碳原子的季铵离子的盐，如四甲基铵、四乙基铵、四(正丙基)铵、四(正丁基)铵、n-苄基-n,n,n-三甲基铵、胆碱或苄烷铵。

在某些实施方案中，衍生自适当的碱的盐包括碱金属(例如钠)盐、碱土金属(例如镁盐)、铵盐和n-(烷基)4⁺盐。本发明也涉及本文中所公开的任何碱性含氮基团的季铵化。通过此类季铵化可以获得水或油溶性或可分散的产物。本文中任何式的化合物的盐形式可以为羧基的氨基酸盐(例如l-精氨酸、l-赖氨酸、l-组氨酸盐)。

适合的盐的列表记载于remington'spharmaceuticalsciences，第17版，mackpublishingcompany，easton，pa.，1985，第1418页；journalofpharmaceuticalscience，66，2(1977)；和“pharmaceuticalsalts：properties，selection，anduseahandbook；wermuth，c.g.andstahl，p.h.(eds.)verlaghelveticachimicaacta，zurich，2002[isbn3-906390-26-8]，其全部内容各自通过引用并入本文。本领域技术人员将进一步认识到，要求保护的化合物的酸加成盐可以通过化合物与适当的无机或有机酸通过许多已知方法中的任何一种反应来制备。或者，本发明的酸性化合物的碱金属和碱土金属盐通过各种已知方法使本发明化合物与适当的碱反应来制备。

本发明包括本发明化合物的所有可能的盐，作为单一盐，或所述盐的任何比例的任何混合物。

可通过将盐与碱或酸接触并以常规方式分离母体化合物而使化合物的中性形式再生。化合物的母体形式在某些物理性质方面(例如极性溶剂的溶解度)不同于各种盐形式，但是为了本发明的目的，在其它方面盐与化合物的母体形式相等。

除盐形式以外，本发明提供呈前药形式的化合物。本文所述的化合物的前药是在生理条件下经受化学变化以提供本发明化合物的那些化合物。此外，前药可通过化学或生物化学方法在离体环境中转化为本发明的化合物。例如，当与合适的酶或化学试剂一起放置在透皮贴剂贮库中，前药可缓慢地转化为本发明的化合物。前药通常是有用的，因为在某些情况下，它们比母体药物更容易施用。例如，它们通过口服施用的生物利用度可高于母体药物。与母体药物相比，前药在药理学组合物中还可具有改善的溶解度。多种前药衍生物在本领域中已知，例如依赖于前药的水解性断裂或氧化激活的那些。前药的实例(不限于)是作为酯(“前药”)施用但是然后可被代谢水解成活性实体羧酸的本发明化合物。另外的实例包括本发明的化合物的肽基衍生物。

本发明还包括化合物的各种水合物和溶剂合物形式。

本发明的化合物还可包含一个或多个组成此类化合物的原子中的非天然比例的原子同位素。例如，化合物可用放射性同位素进行放射性标记，例如氚(³h)、碘-125(¹²⁵i)或碳-14(¹⁴c)。本发明化合物的所有同位素变化，无论是否具有放射性，意图包括在本发明的范围之内。特别是含氘的化合物。

术语化合物或试剂的“同位素变体”定义为表现出构成化合物的一种或多种同位素的非天然比例的化合物。

表述“非天然的比例”是指高于其天然丰度的同位素的比例。在本上下文中应用的同位素的天然丰度描述在“isotopiccompositionsoftheelements1997”，pureappl.chem.，70(1)，217-235，1998。

这种同位素的实例包括氢、碳、氮、氧、磷、硫、氟、氯、溴和碘的稳定和放射性的同位素，分别如²h(氘)、³h(氚)、¹¹c、¹³c、¹⁴c、¹⁵n、¹⁷o、¹⁸o、³²p、³³p、³³s、³⁴s、³⁵s、³⁶s、¹⁸f、³⁶cl、⁸²br、¹²³i、¹²⁴i、¹²⁵i、¹²⁹i和¹³¹i。

关于治疗和/或预防本文所述的疾病，化合物1-2(特别是化合物1)的一种或多种同位素变体优选含有氘(“含氘的”)。其中掺入一种或多种放射性同位素，例如³h或¹⁴c的化合物1-2(特别是化合物1)的同位素变体可用于例如药物和/或底物组织分布研究。这些同位素由于其易于掺入和检测是特别优选的。可以将正电子发射同位素，例如¹⁸f或¹¹c掺入化合物1-2(特别是化合物1)。化合物1-2的这些同位素变体可用于体内成像应用。在临床前或临床研究的情况下，含氘和含¹³c的化合物1-2可用于质谱分析。

化合物1-2的同位素变体通常可通过本领域技术人员已知的方法，例如本文中方案和/或实施例中描述的那些，通过将试剂替换为所述试剂的同位素变体，优选替换为含氘试剂制备。取决于所需氘化位点，在一些情况下，可以将来自d2o的氘直接掺入化合物中或掺入可用于合成这样的化合物的试剂中。氘气也是可用于将氘掺入分子中的试剂。烯属键的催化氘化和炔属键的催化氘化是掺入氘的快速途径。在氘气存在下，金属催化剂(即pd、pt和rh)可用于将含官能团的烃中的氢直接交换成氘(j.g.atkinson等人,美国专利3966781)。各种氘化试剂和合成结构单元从例如c/d/nisotopes,quebec,canada；cambridgeisotopelaboratoriesinc.,andover,ma,usa和combiphoscatalysts,inc.,princeton,nj,usa的公司商业可得。

术语“含氘的化合物1-2”定义为以下化合物，其中一个或多个氢原子被一个或多个氘原子替代并且其中在化合物1-2任一个的每个氘化位置的氘的丰度高于氘的自然丰度，其为约0.015％。特别地，在含氘的化合物1-2任一个中，在化合物的每个氘化位置的氘的丰度高于10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％或80％，优选高于90％、95％、96％或97％，甚至更优选在所述一个或多个位置高于98％或99％。应理解的是在各氘化位置的氘的丰度与其它一个或多个氘化位置的氘的丰度无关。

将一个或多个氘原子选择性掺入化合物1-2任一个可改变分子的物理化学性质(例如酸度[c.l.perrin，等人，j.am.chem.soc.，2007，129，4490]，碱度[c.l.perrin等人，j.am.chem.soc.，2005，127，9641]，亲脂性[b.testa等人,int.j.pharm.,1984,19(3),271])和/或代谢曲线并可导致母体化合物与代谢物的比率的改变或所形成的代谢物的量的改变。这样的改变可导致某些治疗优点并因此在一些情况下可以是优选的。已报道了降低的代谢速率和代谢转换，其中代谢物的比率改变(a.e.mutlib等人，toxicol.appl.pharmacol.，2000，169，102)。暴露于母体药物和代谢物的这些改变对于含氘的通式(i)的化合物的药效学、耐药性和效力可具有重要结果。在一些情况下，氘取代降低或消除不期望或毒性代谢物的形成并提高所需代谢物的形成(例如奈韦拉平：a.m.sharma等人，chem.res.toxicol.，2013，26，410；依非韦伦：a.e.mutlib等人，toxicol.appl.pharmacol.，2000，169，102)。在其它情况下，氘化的主要作用是降低全身清除速率。因此，化合物的生物半衰期提高。潜在的临床益处可包括保持相似的全身暴露伴有降低的峰值水平和增加的谷水平的能力。这可导致降低的副作用和提高的效力，取决于具体化合物的药代动力学/药效学关系。ml-337(c.j.wenthur等人,j.med.chem.,2013,56,5208)和奥当卡替(k.kassahun等人,wo2012/112363)是该氘化效果的实例。已报道了另一些情况，其中降低的代谢速率导致增加的药物暴露而没有改变全身清除速率(例如罗非考昔:f.schneider等人,arzneim.forsch.drug.res.,2006,56,295；特拉匹韦:f.maltais等人,j.med.chem.,2009,52,7993)。显示该效果的氘化的药物可具有降低的给药需要(例如降低的给药次数或降低的剂量以达到所需效果)和/或可产生降低的代谢物负载。

化合物1-2可具有多个潜在的代谢攻击位点。为了优化上述物理化学性质和代谢分布的效果，可以选择具有一种或多种氘-氢交换的特定模式的含氘的化合物1-2。特别地，一种或多种含氘的化合物1-2的一个或多个氘原子连接至碳原子和/或位于化合物1-2的作为代谢酶，例如细胞色素p450的攻击位点的那些位置。

药物组合物

化合物1-2，尤其是化合物1，可能具有全身和/或局部活性。为此目的，它们可以以合适的方式施用，例如通过口服、肠胃外、肺、鼻、舌下、舌、含剂、直肠、阴道、皮肤、透皮、结膜、耳部途径或作为植入物或支架。

对于这些给药途径，化合物1-2可以以合适的给药形式给药。

对于口服给药，可以将化合物1-2配制成本领域已知的剂型，其快速和/或以改良的方式递送本发明的化合物，例如片剂(未包衣或包衣片剂，例如，具有延迟溶解或不溶解的肠溶或控释包衣、口腔崩解片剂、薄膜/薄片、薄膜/冻干物、胶囊(例如硬或软明胶胶囊)、糖衣片剂、颗粒剂、丸剂、粉末、乳液、悬浮液、气溶胶或溶液。可以将化合物1-2以结晶和/或无定形和/或溶解形式掺入所述剂型中。

可以在避免吸收步骤(例如静脉内、动脉内、心脏内、脊柱内或腰内)或包括吸收(例如肌内、皮下、皮内、经皮或腹膜内)的情况下进行肠胃外给药。适于肠胃外给药的给药形式尤其为溶液剂、混悬剂、乳剂、冻干物或无菌粉末形式的用于注射和输注的制剂。

适合于其它给药途径的实例为用于吸入的药物形式[尤其是粉末吸入器、喷雾器]、滴鼻剂、鼻溶液、鼻喷雾剂；用于舌、舌下或口腔给药的片剂/薄膜/薄片/胶囊；栓剂；滴眼剂、眼药膏、眼部浴液、眼部插入物、滴耳剂、耳喷雾剂、耳粉、耳洗液、耳塞；阴道胶囊、水性悬浮液(洗剂、振荡合剂(mixturaeagitandae))、亲脂悬浮液、乳剂、软膏、乳膏、透皮治疗系统(例如贴剂)、乳液、糊剂、泡沫、粉剂、植入物或支架。

根据本发明的化合物可以掺入所述的给药形式中。这可以通过与药学上合适的赋形剂混合以本身已知的方式实现。药学上合适的赋形剂尤其包括：

·填料和载体(例如纤维素、微晶纤维素(例如，)、乳糖、甘露醇、淀粉、磷酸钙(例如，)),

·软膏基质(例如矿脂、石蜡、甘油三酯、蜡、羊毛蜡、羊毛蜡醇、羊毛脂、亲水性软膏、聚乙二醇),

·栓剂基质(例如聚乙二醇、可可脂、硬脂),

·溶剂(例如水、乙醇、异丙醇、甘油、丙二醇、中链-长度甘油三酯脂肪油、液体聚乙二醇、石蜡),

·表面活性剂、乳化剂、分散剂或湿润剂(例如十二烷基硫酸钠)、卵磷脂、磷脂、脂肪醇(例如，)、脱水山梨醇脂肪酸酯(例如，)、聚氧乙烯脱水山梨醇脂肪酸酯(例如，)、聚氧乙烯脂肪酸甘油酯(例如，)、聚氧乙烯脂肪酸酯、聚氧乙烯脂肪醇醚、甘油脂肪酸酯、泊洛沙姆(例如，),

·缓冲剂、酸和碱(例如磷酸盐、碳酸盐、柠檬酸、乙酸、盐酸、氢氧化钠溶液、碳酸铵、氨丁三醇、三乙醇胺),

·等渗剂(例如葡萄糖、氯化钠),

·吸附剂(例如高度分散二氧化硅(silicas)),

·粘度-增强剂、凝胶形成剂、增稠剂和/或结合剂(例如聚乙烯吡咯烷酮、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羟丙基纤维素、羧基甲基纤维素-钠、淀粉、卡波姆、聚丙烯酸(例如，)；藻酸盐、明胶),

·崩解剂(例如改性淀粉、羧基甲基纤维素-钠、羟乙酸淀粉钠(例如，)、交联聚乙烯吡咯烷酮、交联羧甲基纤维素-钠(例如，)),

·流动调节剂、润滑剂、助流剂和脱模剂(例如硬脂酸镁、硬脂酸、滑石、高度分散二氧化硅(例如，)),

·包衣材料(例如糖、虫胶)和用于膜或快速或以改性方式溶解的扩散膜的成膜剂(例如聚乙烯吡咯烷酮(例如，)、聚乙烯醇、羟丙基甲基纤维素、羟丙基纤维素、乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯、乙酸纤维素、邻苯二甲酸乙酸纤维素、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、例如，)),

·胶囊材料(例如明胶、羟丙基甲基纤维素),

·合成聚合物(例如聚交酯、聚乙交酯、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯(例如，)、聚乙烯吡咯烷酮(例如，)、聚乙烯醇、聚乙酸乙烯酯、聚氧化乙烯、聚乙二醇和它们的共聚物和嵌段共聚物),

·增塑剂(例如聚乙二醇、丙二醇、甘油、三乙酸甘油酯、柠檬酸三乙酰基酯、二丁基邻苯二甲酸酯),

·渗透增强剂、

·稳定剂(例如抗氧化剂例如，抗坏血酸、抗坏血酸棕榈酸酯、抗坏血酸钠、丁基羟基苯甲醚、丁基羟基甲苯、没食子酸丙酯),

·防腐剂(例如对羟苯甲酸酯、山梨酸、硫柳汞、苯扎氯铵、乙酸氯己定、苯甲酸钠),

·着色剂(例如无机颜料例如，氧化铁、二氧化钛),

·香料、增甜剂、增香剂-和/或气味-掩蔽剂。

本发明进一步涉及药物组合物，其包含至少一种化合物1-2，尤其是化合物1，和与一种或多种药物合适的赋形剂，且涉及它们根据本发明的用途。

因此在一个实施方案中，本发明涉及化合物1或化合物2

或其药学上可接受的盐或前药，和一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂。

在另一实施方案中，本发明涉及化合物1

或其药学上可接受的盐或前药，和一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂。

在另一实施方案中，本发明涉及化合物2

或其药学上可接受的盐或前药，和一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂。

组合

根据另一方面，本发明涵盖药物组合，特别是药物，其包含化合物1和2至少之一，尤其是化合物1和至少一种或多种其它活性成分，尤其用于治疗和/或预防过度增殖性疾病，尤其是癌症。

特别地，本发明涉及一种药物组合，其包含：

·一种或多种第一活性成分，特别是化合物1和2中的一种，尤其是化合物1，如上文所定义，和

·一种或多种其他活性成分，特别是过度增殖性疾病，尤其是癌症

本发明中的术语“组合”如本领域技术人员已知使用，所述组合可以是固定组合、非固定组合或多部件试剂盒。

在本发明中，如同本领域技术人员已知那般使用“固定组合”，并且定义为这样的组合，其中例如第一活性成分例如化合物1-2中的一种或多种，和其它活性成分共同存在于一个单位剂量中或者单个实体中。“固定组合”的一个实例是药物组合物，其中第一活性成分和其它活性成分存在于同时施用的混合物中，例如制剂中。“固定组合”的另一个实例是药物组合，其中第一活性成分和其它活性成分存在于一个单位中，而不是在混合物中。

在本发明中，如同本领域技术人员已知那般使用非固定组合或者“多部件试剂盒”，并且定义为这样的组合，其中第一活性成分和其它活性成分存在于多于一个单位中。非固定组合或者多部件试剂盒的一个实例是这样的组合，其中第一活性成分和其它活性成分分开存在。非固定组合或者多部件试剂盒的组分可以分开、相继、同时、并行或者按时间顺序错开施用。

本发明化合物可以作为唯一的药剂给药或与一种或多种其它药物活性成分组合给药，其中该组合不会引起不可接受的副作用。

本发明还涵盖这些药物组合。例如，本发明化合物可与已知的抗癌剂和改善这些抗癌剂可能具有的潜在副作用的药剂组合。这些药剂的实例包括:

131i-chtnt、阿巴瑞克、阿比特龙、阿柔比星、阿达木单抗、曲妥珠单抗抗体-药物偶联物(ado-trastuzumabemtansine)、阿法替尼、阿柏西普、阿地白介素、艾乐替尼、阿仑珠单抗、阿仑膦酸、阿利维a酸、六甲蜜胺、氨磷汀、氨鲁米特、氨基酮戊酸己酯、氨柔比星、安吖啶、阿那曲唑、安西司亭、茴香脑二硫杂环戊二烯硫酮(anetholedithiolethione)、anetumabravtansine、血管紧张素ii、抗凝血酶iii、阿瑞匹坦、阿西莫单抗、arglabin、三氧化二砷、天冬酰胺酶、阿特珠单抗、阿西替尼、阿扎胞苷、巴利昔单抗、贝洛替康、苯达莫司汀、贝索单抗、贝利司他、贝伐珠单抗、贝沙罗汀、比卡鲁胺、比生群、博来霉素、博纳吐单抗、硼替佐米、布舍瑞林、博舒替尼(bosutinib)、brentuximabvedotin、白消安、卡巴他赛(cabazitaxel)、卡博替尼、降钙素、亚叶酸钙、左亚叶酸钙、卡培他滨、卡罗单抗、卡马西平、卡铂、卡波醌、卡非佐米、卡莫氟、卡莫司汀、卡妥索单抗、塞来考昔、西莫白介素、色瑞替尼、西妥昔单抗、苯丁酸氮芥、氯地孕酮、氮芥、西多福韦、西那卡塞、顺铂、克拉屈滨、氯膦酸、氯法拉滨、考比替尼、库潘尼西(copanlisib)、crisantaspase、克里唑蒂尼、环磷酰胺、环丙孕酮、阿糖胞苷、达卡巴嗪、放线菌素d、达雷木单抗、达贝泊汀α、达拉菲尼、达沙替尼、柔红霉素、地西他滨、地加瑞克、地尼白介素(denileukindiftitox)、地舒单抗、地普奥肽、地洛瑞林、二去水卫矛醇、右雷佐生、二溴螺氯铵、二去水卫矛醇、双氯芬酸、地努图希单抗、多西他赛、多拉司琼、去氧氟尿苷、多柔比星、多柔比星+雌酮、屈大麻酚、依库珠单抗、依决洛单抗、依利醋铵、埃罗妥珠单抗、艾曲波帕、内皮抑素、依诺他滨、恩杂鲁胺、表柔比星、环硫雄醇、阿法依伯汀、倍他依泊汀、泽塔依泊汀、依他铂、艾瑞布林(eribulin)、厄洛替尼、埃索美拉唑、雌二醇、雌莫司汀、乙炔雌二醇、依托泊苷、依维莫司、依西美坦、法倔唑、芬太尼、非格司亭、氟甲睾酮、氟尿苷、氟达拉滨、氟尿嘧啶、氟他胺、亚叶酸、福美坦、福沙吡坦、福莫司汀、氟维司群、钆布醇、钆特醇、钆特酸葡甲胺、钆弗塞胺、钆塞酸、硝酸镓、加尼瑞克、吉非替尼、吉西他滨、吉妥珠单抗、羧肽酶、glutoxim、gm-csf、戈舍瑞林、格拉司琼、粒细胞集落刺激因子、二盐酸组胺、组氨瑞林、羟基脲、i-125种子、兰索拉唑、伊班膦酸、替伊莫单抗、依鲁替尼、伊达比星、异环磷酰胺、伊马替尼、咪喹莫德、英丙舒凡、吡地司琼、英卡膦酸、巨大戟醇甲基丁烯酸酯、α干扰素、β干扰素、γ干扰素、碘比醇、碘苄胍(123i)、碘美普尔、伊匹木单抗、伊立替康、伊曲康唑、伊沙匹隆、伊沙佐米、兰瑞肽、兰索拉唑、拉帕替尼、lasocholine、来那度胺、乐伐替尼、来格司亭、香菇多糖、来曲唑、亮丙瑞林、左旋咪唑、左炔诺孕酮、左甲状腺素钠、麦角乙脲、洛铂、洛莫司汀、氯尼达明、马索罗酚、甲羟孕酮、甲地孕酮、美拉胂醇、美法仑、美雄烷、巯嘌呤、美司钠、美沙酮、甲氨蝶呤、甲氧沙林、氨基酮戊酸甲酯、甲基泼尼松龙、甲睾酮、甲酪氨酸、米伐木肽、米替福新、米铂(miriplatin)、二溴甘露醇、米托胍腙、二溴卫矛醇、丝裂霉素、米托坦、米托蒽醌、mogamulizumab、莫拉司亭、莫派达醇、盐酸吗啡、硫酸吗啡、大麻隆、nabiximols、那法瑞林、纳洛酮+喷他佐辛、纳曲酮、那托司亭、耐昔妥珠单抗、奈达铂、奈拉滨、奈立膦酸、奈妥吡坦/帕洛诺司琼、nivolumab、喷曲肽(pentetreotide)、尼洛替尼、尼鲁米特、尼莫拉唑、尼妥珠单抗、尼莫司汀、尼达尼布、二胺硝吖啶、纳武单抗(nivolumab)、奥奴珠单抗(obinutuzumab)、奥曲肽、奥法木单抗、奥拉帕尼、olaratumab、高三尖杉酯碱(omacetaxinemepesuccinate)、奥美拉唑、昂丹司琼、奥普瑞白介素、奥古蛋白(orgotein)、orilotimod、奥希替尼、奥沙利铂、羟考酮、羟甲烯龙、奥佐米星(ozogamicine)、p53基因疗法、紫杉醇、帕布昔利布、帕利夫明、钯-103种子、帕洛诺司琼、帕米膦酸、帕尼单抗、帕比司他、泮托拉唑、帕唑帕尼、培门冬酶、peg-倍他依泊汀(甲氧基peg-倍他依泊汀)、派姆单抗(pembrolizumab)、培非司亭、peg干扰素α-2b、派姆单抗、培美曲塞、喷他佐辛、喷司他丁、培洛霉素、全氟正丁烷、培磷酰胺、帕妥珠单抗、溶血性链球菌制剂、匹鲁卡品、吡柔比星、匹克生琼、普乐沙福、普卡霉素、聚氨葡糖、聚磷酸雌二醇、聚乙烯吡咯烷酮+透明质酸钠、多糖-k、泊马度胺、帕纳替尼、卟吩姆钠、普拉曲沙、泼尼莫司汀、强的松、丙卡巴肼、丙考达唑、普萘洛尔、喹高利特、雷贝拉唑、racotumomab、氯化镭-223、雷多替尼、雷洛昔芬、雷替曲塞、雷莫司琼、雷莫芦单抗、雷莫司汀、拉布立酶、雷佐生、refametinib、瑞格非尼(regorafenib)、利塞膦酸、铼-186依替膦酸、利妥昔单抗、罗拉吡坦、罗米地新、罗米司亭(romiplostim)、罗莫肽、roniciclib、来昔决南钐[153sm](samarium(153sm)lexidronam)、沙格司亭、沙妥莫单抗、促胰液素、司妥昔单抗、西普鲁塞t、西佐喃、索布佐生、甘氨双唑钠(sodiumglycididazole)、索尼吉布、索拉非尼、司坦唑醇、链佐星、舒尼替尼、他拉泊芬、talimogenelaherparepvec、他米巴罗汀、他莫昔芬、他喷他多、他索纳明、替西白介素、technetium(99mtc)nofetumomabmerpentan、99mtc-hynic-[tyr3]-奥曲肽、替加氟、替加氟+吉美嘧啶+奥替拉西、替莫泊芬、替莫唑胺、坦罗莫司、替尼泊苷、睾酮、替曲膦、沙利度胺、塞替派、胸腺法新、促甲状腺素α、硫鸟嘌呤、托珠单抗、托泊替康、托瑞米芬、托西莫单抗、曲贝替定、曲美替尼、曲马多、曲妥珠单抗、曲妥珠单抗-emtansine缀合物、曲奥舒凡、维甲酸、三氟尿苷+tipiracil、曲洛司坦、曲普瑞林、曲美替尼、曲磷胺、促血小板生成素、色氨酸、乌苯美司、瓦他拉尼、戊柔比星、凡德他尼、伐普肽、维莫非尼(vemurafenib)、长春碱、长春新碱、长春地辛、长春氟宁、长春瑞滨、维莫德吉、伏林司他、伏氯唑、钇-90玻璃微球、净司他丁、净司他丁斯酯、唑来膦酸、佐柔比星。

实用性

化合物1和化合物2为pde3a/pde3b调节剂，因此根据用磷酸二酯酶调节剂靶向癌症可能为有希望的方法的事实，化合物1和化合物2，尤其是化合物1，可用于治疗癌症。

本发明另一方面为化合物1和化合物2，其用于治疗过度增殖性疾病。

本发明另一方面为化合物1和化合物2，其用于治疗过度增殖性疾病或造血过度增殖性疾病，包括真性红细胞增多症、特发性血小板增多症、原发性骨髓纤维化，等等。

另一方面为预防和/或治疗过度增殖性疾病的方法，尤其是治疗过度增殖性疾病的方法，包括给药有效量的化合物1和/或化合物2，尤其是化合物1，例如治疗癌症的方法。

另一方面为治疗过度增殖性疾病的方法，包括向需要的受试者给药选自以下的化合物之一

或其药学上可接受的盐或前药。

在另一方面，本发明涉及使用选自以下的化合物之一

或其药学上可接受的盐或前药治疗过度增殖性疾病的方法，更具体其中过度增殖性疾病为癌症。

在本发明的一个方面，所述癌症为骨癌、乳腺癌、子宫颈癌、结肠癌、子宫内膜癌、胃肠道间质瘤(gist)、头颈癌、造血系统癌、肾癌、平滑肌肉瘤、肝癌、肺癌、淋巴癌、黑素瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、软组织肉瘤、甲状腺癌或泌尿道癌症。

化合物1和/或化合物2，尤其是化合物1，也适合预防和/或治疗良性过度增殖性疾病，例如子宫内膜异位、平滑肌瘤和良性前列腺增生。

因此另一方面过度增殖性疾病为良性过度增殖性疾病。

本发明另一方面为化合物1和/或化合物2，尤其是化合物1，其用于治疗癌症。它们特别可用于治疗转移性或恶性肿瘤。

因此本发明另一方面为治疗癌症的方法，包括给药有效量的至少一种化合物1和/或2，尤其是化合物1。

本发明另一方面为治疗转移性或恶性肿瘤的方法，包括给药有效量的化合物1和/或2，尤其是化合物1。

本发明另一方面化合物1和/或2，尤其是化合物1用于治疗实体瘤的用途。

本发明另一方面为化合物1和/或2，尤其是化合物1，其用于治疗实体瘤。

本发明另一方面为治疗实体瘤的方法，包括给药有效量的化合物1和/或2，尤其是化合物1。

本发明另一方面为化合物1和/或2，尤其是化合物1治疗实体瘤的用途，实体瘤如乳腺、呼吸道、脑、骨、中枢和外周神经系统、结肠、直肠、肛门、生殖器官(例如，子宫颈、卵巢、前列腺)、胃肠道(包括胃肠间质肿瘤)、泌尿生殖道、内分泌腺(如甲状腺和肾上腺皮质)、甲状腺、甲状旁腺、食道、子宫内膜、眼、生殖细胞、头部和颈部、肾、肝、喉和下咽、肺、间皮瘤、胰腺、前列腺、直肠、肾、小肠、皮肤、软组织、胃、睾丸、输尿管、阴道和外阴和结缔组织的肿瘤，以及这些肿瘤的转移。恶性瘤形成包括遗传性癌症，例如视网膜母细胞瘤和维尔姆斯肿瘤。

本发明另一方面为治疗上述肿瘤的方法，包括给药有效量的化合物1和/或2，尤其是化合物1。

本发明另一方面化合物1和/或化合物2治疗血液肿瘤的用途。

本发明另一方面为化合物1和/或2，尤其是化合物1，其用于治疗血液肿瘤。

本发明另一方面为治疗血液肿瘤的方法，包括给药有效量的化合物1和/或2，尤其是化合物1。

本发明另一方面为化合物1和/或2，尤其是化合物1治疗癌症的用途，其中癌症类型为骨、乳腺、子宫颈、结肠、子宫内膜、胃肠道间质瘤(gist)、头颈部(例如，头、神经胶质瘤、胶质母细胞瘤)、造血系统、肾、平滑肌肉瘤、肝、肺、淋巴、黑素瘤、卵巢、胰腺、前列腺、软组织肉瘤、甲状腺癌、泌尿道的癌症。

本发明另一方面为化合物1和/或2，尤其是化合物1治疗黑素瘤、腺癌、乳腺癌、子宫颈癌、子宫内膜癌、胶质母细胞瘤、造血系统/淋巴癌、肾癌、平滑肌肉瘤、肝癌、肺癌、卵巢癌、胰腺癌、软组织肉瘤、甲状腺癌或泌尿道癌症的用途。

本发明另一方面化合物1和/或2，尤其是化合物1治疗癌症的用途，其中所述癌症类型为黑素瘤、子宫内膜癌、肺癌、造血系统癌、淋巴癌、卵巢癌、子宫颈癌、软组织肉瘤、平滑肌肉瘤、泌尿道癌、胰腺癌、甲状腺癌。

本发明另一方面为化合物1和/或2，尤其是化合物1用于治疗皮肤癌(例如，黑素瘤)、肺癌(例如，肺腺癌)和子宫颈癌的用途。

本发明另一方面为化合物1和/或2，尤其是化合物1用于治疗皮肤癌(例如，黑素瘤)和子宫颈癌的用途。

本发明另一方面为化合物1和/或2，尤其是化合物1用于治疗骨癌、中枢神经系统癌(例如，多形性成胶质细胞瘤和神经胶质瘤)、结肠癌、造血系统和淋巴样组织癌(例如，红白血病和t-细胞淋巴瘤)、肝癌、肺癌(例如，肺腺癌和小细胞肺癌(sclc))、卵巢癌、皮肤癌(例如，黑素瘤)的用途。

本发明另一方面为pde3a和/或pde3b调节剂在制备用于治疗癌症的药物中的用途，其中所述pde3a和/或pde3b调节剂为选自以下的化合物之一

或其药学上可接受的盐或前药

本发明另一方面为pde3a和/或pde3b调节剂在制备用于治疗癌症的药物中的用途，其中所述pde3a和/或pde3b调节剂为选自化合物1和化合物2的化合物之一或其药学上可接受的盐或前药，且其中所述癌症为骨癌、乳腺癌、子宫颈癌、结肠癌、子宫内膜癌、胃肠道间质瘤(gist)、头颈癌、造血系统癌、肾癌、平滑肌肉瘤、肝癌、肺癌、淋巴癌、皮肤癌、黑素瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、软组织肉瘤、甲状腺癌或泌尿道癌症，更具体为黑素瘤或子宫颈癌。

本文公开的化合物也可用于在受试者中减少癌细胞增殖的方法中。

在一些实施方案中，所述在受试者中减少癌细胞增殖的方法包括向该受试者给药pde3a和/或pde3b调节剂从而减少受试者的癌症增殖。该受试者可为预先经选择的(例如，在给药前选择)，通过在源自受试者癌症的细胞中检测pde3a和/或pde3b多肽或多核苷酸相对参照水平的增加。

在一些实施方案中，所述受试者的预先选择可通过在源自受试者癌症的细胞中检测slfn12相对参照水平的减少而进行。在一些实施方案中，所述受试者的预先选择可通过在源自受试者癌症的细胞中检测slfn12相对参照水平的增加而进行。

在一些实施方案中，经选择对磷酸二酯酶3a(pde3a)和/或pde3b调节剂有响应的癌细胞的存活涉及将细胞与一种或多种pde3a和/或pde3b调节剂接触，其中所述细胞经选择相对参照具有增加水平的pde3a和/或pde3b多肽或多核苷酸，或其组合，从而减少所述癌细胞的存活。

在一些实施方案中，提供杀死经选择对磷酸二酯酶3a(pde3a)和/或pde3b调节剂有响应的癌细胞或减少其存活的方法，其中所述方法可包括将该细胞与一种或多种pde3a和/或pde3b调节剂接触，其中所述细胞经选择相对参照具有增加水平的pde3a和/或pde3b多肽或多核苷酸，或其组合，从而减少所述癌细胞的存活。通常，该pde3a和/或pde3b调节剂减少pde3a和/或pde3b的酶活性。

在一些实施方案中，所述癌症为黑素瘤、前列腺癌或淋巴瘤。

在一些实施方案中，所述在受试者中减少癌细胞增殖的方法包括向该受试者给药pde3a和/或pde3b调节剂从而减少受试者的癌症增殖。该受试者可为预先经选择的(例如，在给药前选择)，通过在源自受试者癌症的细胞中检测pde3a和/或pde3b多肽或多核苷酸和/或schlafen12(slfn12)相对参照水平的增加。

在一些实施方案中，经选择对磷酸二酯酶3a(pde3a)和/或pde3b调节剂有响应的癌细胞的存活涉及将细胞与一种或多种pde3a和/或pde3b调节剂接触，其中所述细胞经选择相对参照具有增加水平的pde3a和/或pde3b多肽或多核苷酸或schlafen12(slfn12)，或其组合，从而减少所述癌细胞的存活。

在一些实施方案中，提供杀死经选择对磷酸二酯酶3a(pde3a)和/或pde3b调节剂有响应的癌细胞或减少其存活的方法，其中所述方法可包括将该细胞与一种或多种pde3a和/或pde3b调节剂接触，其中所述细胞经选择相对参照具有增加水平的pde3a和/或pde3b多肽或多核苷酸或schlafen12(slfn12)，或其组合，从而在处理后减少所述癌细胞的存活。通常，该pde3a和/或pde3b调节剂减少pde3a和/或pde3b的活性。

在其它实施方案中，本文所述的杀死癌细胞或减少癌细胞存活的方法中使用的(pde3a)和/或pde3b调节剂为化合物1和/或化合物2。

因此在另一方面，本发明涉及在预先经选择患有对一种或多种具有以下结构的pde3a和/或pde3b调节剂有响应的癌症的受试者中减少癌细胞增殖的方法:

包括向受试者给药pde3a/pde3b调节剂，其中该受试者预先经选择，其通过检测在源自受试者癌症的细胞中pde3a或pde3b或schlafen12(slfn12)多肽或多核苷酸或其组合的水平相对参照的增加，从而在所述受试者中减少癌细胞增殖。

在其它实施方案中，所述方法中使用的(pde3a)和/或pde3b调节剂减少pde3a和/或pde3b的活性。

本文所述的方法中受试者的预先选择可通过获得肿瘤生物样品(例如组织样品)(包括癌细胞)而进行。

在另一方面本文所述的方法进一步包括检测相对参照creb3l1多肽或多核苷酸表达水平减少的缺失的步骤。

在另一方面本文所述的方法进一步包括检测相对参照creb3l1多肽或多核苷酸表达水平减少的缺失的步骤，进一步包括检测slfn12水平的减少的步骤。

在本文公开的方法的一方面，其中检测pde3a、pde3bslfn12或creb3l1多肽的水平，该检测通过选自以下的方法进行：免疫印迹、质谱分析和免疫沉淀。

在本文公开的方法的一方面，其中检测pde3a、pde3b、slfn12或creb3l1多核苷酸的水平，该检测通过选自以下的方法进行：定量pcr、rna测序、northern印迹、微阵列、质谱分析和原位杂交。

在另一方面，本发明涉及在预先选择的受试者中减少癌细胞增殖的方法，该方法包括向受试者给药一种或多种pde3a和/或pde3b调节剂，其中所述受试者预先经选择，其通过检测相对参照在源自受试者的样品中pde3a和/或pde3b多肽或多核苷酸的水平的增加，从而在所述受试者中减少癌细胞增殖。

在另一方面，本发明涉及在预先选择的受试者中减少癌细胞增殖的方法，该方法包括向受试者给药一种或多种pde3a和/或pde3b调节剂，其中所述受试者预先经选择，其通过检测相对参照在源自受试者的样品中pde3a和/或pde3b多肽或多核苷酸的水平的增加，进一步包括检测slfn12水平的增加，从而在所述受试者中减少癌细胞增殖。

在另一方面，本发明涉及杀死癌细胞或减少其存活的方法，包括将该细胞与一种或多种pde3a和/或pde3b调节剂接触，其中该细胞相对参照具有增加的pde3a和/或pde3b多肽或多核苷酸水平，从而减少所述癌细胞的存活。

在另一方面，本发明涉及杀死癌细胞或减少其存活的方法，包括将该细胞与一种或多种pde3a和/或pde3b调节剂接触，其中该细胞相对参照具有增加的pde3a和/或pde3b多肽或多核苷酸水平，进一步包括检测slfn12水平的增加，从而减少所述癌细胞的存活。

在另一方面，本发明涉及使用化合物1和化合物2治疗pde3b和slfn12敏感性癌症的方法。

在另一方面，本发明涉及使用化合物1和化合物2处理对黑素瘤、前列腺癌、子宫颈癌或淋巴瘤敏感的pde3b和slfn12的方法。

诊断学

本发明的一个特征为用于表征癌症的诊断测定法。在一个实施方案中，在受试者样品中测量pde3a、pde3b、schlafen12(slfn12)或creb3l1多核苷酸或多肽的水平，并用作对化合物1和/或2，尤其是化合物1治疗有响应的癌症指标。

在另一个实施方案中，在受试者的生物样品中测量creb3l1多核苷酸或多肽的水平。相对于参照，受试者的生物样品(例如，包含癌细胞的生物样品)中creb3l1或slfn12多核苷酸或多肽表达水平的丧失或降低表明该癌症对用pde3a和/或pde3b调节剂治疗具有抗性。pde3a、pde3b、slfn12和/或creb3l1多核苷酸的水平可以通过标准方法测量，例如定量pcr、rna测序、northern印迹、微阵列、质谱和原位杂交。标准方法可用于测量源自肿瘤的生物样品中pde3a、slfn12和/或creb3l1多肽的水平。这些方法包括免疫测定、elisa、使用结合pde3a、pde3b、slfn12和/或creb3l1的抗体的western印迹，以及放射免疫测定。相对于参照，升高水平的pde3a和slfn12多核苷酸或多肽被认为是对用pde3a和/或pde3b调节剂治疗有响应的癌症的阳性指标。降低的creb3l1或slfn12多核苷酸或多肽的水平被认为是对用化合物1和/或2，尤其是化合物1治疗具有抗性的癌症的指标。

生物样品的类型

在表征受试者中恶性肿瘤对化合物1和/或2，尤其是化合物1治疗的响应性时，在不同类型的生物样品中测量pde3a、pde3b、slfn12和/或creb3l1表达的水平。在一个实施方案中，生物样品是肿瘤样品。

pde3a、pde3b和/或slfn12在从对pde3a和/或pde3b调节剂治疗有响应的受试者获得的样品中的表达高于在非响应性受试者中的表达水平。在另一个实施方案中，pde3a和/或pde3b和/或slfn12在患有恶性肿瘤的受试者中为在健康对照中的至少约5倍、10倍、20倍或30倍。使用本领域已知的任何方法确定倍数变化值。在一个实施方案中，相对于参照，creb3l1或slfn12表达降低或不可检测。

在特定实施方案中，creb3l1或slfn12表达降低约10％、25％、50％、75％、85％、95％或更多。

在一个实施方案中，通过计算癌细胞中pde3a、pde3bslfn12和/或creb3l1的表达与非响应性癌细胞中存在的水平或相应的健康对照细胞中存在的水平的差异来确定变化。

治疗方法的选择

如下文所报道的，可以在选择治疗方法的过程中测试患有过度增殖性疾病的受试者的pde3a、pde3b、slfn12和/或creb3l1表达。表征为相对于参照水平具有增加的pde3a和/或slfn12的患者被鉴定为对pde3a和/或pde3b调节剂，尤其是化合物1和/或2，更具体是化合物1的治疗有响应。相对于参照具有降低的或不可检测的slfn12或creb3l1表达水平的受试者被鉴定为对pde3a和/或pde3b调节剂，尤其是化合物1和/或2，更具体是化合物1的治疗具有抗性。

试剂盒

本发明提供了用于表征受试者对pde3a和/或pde3b调节剂，尤其是化合物1和/或2，更具体是化合物1的治疗的响应性或抗性的试剂盒。

本文还提供了试剂盒，其可包括例如在单位剂型中含有有效量的pde3a和/或pde3b调节剂的治疗组合物。

在一些实施方案中，试剂盒包含无菌容器，其包含治疗或诊断组合物；这种容器可以是盒、安瓿、瓶、小瓶、管、袋、小袋、泡罩包装或本领域已知的其它合适的容器形式。这种容器可以由塑料、玻璃、层压纸、金属箔或适于容纳药物的其他材料制成。

在一个实施方案中，本发明的试剂盒包含用于测量pde3a、slfn12和/或creb3l1水平的试剂。如果需要，该试剂盒还包括用于测量pde3a和/或slfn12的说明书和/或用于将pde3a/pde3b调节剂给予患有恶性肿瘤的受试者的说明书，例如选择的对pde3a/pde3b调节剂治疗有响应的恶性肿瘤。在特定实施方案中，说明书包括以下中的至少一种：治疗剂的描述；剂量方案和用于治疗或预防恶性肿瘤或其症状的给药；注意事项；警告；适应症；禁忌症；超剂量信息；不良反应；动物药理学；临床研究；和/或参考。说明书可以直接印在容器上(当存在时)，或作为施加于容器的标签，或作为在容器中或与容器一起提供的单独的薄片、小册子、卡片或文件夹。

在一个实施方案中，本发明的试剂盒包含用于测量pde3a/pde3b、slfn12和/或creb3l1水平的试剂。

在一个实施方案中，本发明的试剂盒包含用于测量slfn12和/或creb3l1水平的试剂。

在一个实施方案中，本发明的试剂盒包含结合creb3l1多肽或多核苷酸的捕获试剂和/或结合slfn12多肽或多核苷酸的捕获试剂。

除非另有说明，本发明的实践采用分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学和免疫学的常规技术，这些技术完全在本领域技术人员的知识范围内。这些技术在文献中有充分的解释，例如“molecularcloning:alaboratorymanual”,第二版(sambrook,1989)；“oligonucleotidesynthesis”(gait,1984)；“animalcellculture”(freshney,1987)；“methodsinenzymology”“handbookofexperimentalimmunology”(weir,1996)；“genetransfervectorsformammaliancells”(miller和calos,1987)；“currentprotocolsinmolecularbiology”(ausubel,1987)；“pcr:thepolymerasechainreaction”,(mullis,1994)；“currentprotocolsinimmunology”(coligan,1991)。这些技术适用于本发明的多核苷酸和多肽的产生，因此，可以在制备和实施本发明时考虑这些技术。用于特定实施例的特别有用的技术将在以下部分中讨论。

提出以下实施例以向本领域普通技术人员提供如何制备和使用本发明的测定、筛选和治疗方法的完整公开和描述，并且不旨在限制本发明的范围。

实施例

化学实验方法

lc-ms-方法:

方法1:

仪器：watersacquityuplcmssinglequad；柱：acquityuplcbehc181.7μm，50x2.1mm；洗脱液a：水+0.1体积％甲酸(99％)，洗脱液b：乙腈；梯度：0-1.6分钟1-99％b，1.6-2.0分钟99％b；流速0.8ml/min；温度：60℃；dad扫描：210-400nm。

方法2:

仪器：watersacquityuplcmssinglequad；柱：acquityuplcbehc181.7μm，50x2.1mm；洗脱液a：水+0.2体积％氨水(32％)，洗脱液b：乙腈；梯度：0-1.6分钟1-99％b，1.6-2.0分钟99％b；流速0.8ml/min；温度：60℃；dad扫描：210-400nm。

nmr-数据

所选化合物的1h-nmr数据以1h-nmr峰列表的形式列出。其中，对于每个信号峰，给出以ppm为单位的δ值，然后是括号中报告的信号强度。来自不同峰的δ值-信号强度对用逗号分隔。因此，峰列表由一般形式描述：δ1(强度1)，δ2(强度2)，...，δi(强度i)，...，δn(强度n)。

尖锐信号的强度与打印出的nmr光谱中信号的高度(以cm为单位)相关。当与其他信号比较时，该数据可以与信号强度的实际比率相关联。在宽信号的情况下，与谱中显示的最强信号相比，显示了不止一个峰值或信号的中心及其相对强度。1h-nmr峰列表类似于经典的1h-nmr读数，因此通常包含经典nmr解释中列出的所有峰。此外，类似于经典的1h-nmr打印输出，峰列表可以显示溶剂信号、来自特定目标化合物的立体异构体的信号、杂质峰、13c卫星峰和/或旋转边带。与目标化合物的峰(例如，纯度>90％)相比，立体异构体的峰和/或杂质峰通常以较低的强度显示。这种立体异构体和/或杂质对于特定的制造过程可能是典型的，因此它们的峰值可以有助于基于“副产物指纹”识别制造过程的再现。通过已知方法(mestrec，acd模拟或通过使用经验评估的期望值)计算目标化合物的峰的专家可以根据需要分离目标化合物1的峰，任选地使用额外的强度过滤器。这种操作类似于经典的1h-nmr解释中的峰值拾取。以峰列表形式报告nmr数据的详细描述可在出版物“citationofnmrpeaklistdatawithinpatentapplications”中找到(参见http://www.researchdisclosure.com/searching-disclosures，researchdisclosure数据库编号605005,2014，2014年8月1日)。在峰值拾取惯例中，如researchdisclosure数据库编号605005中所述，参数“最小高度”可以在1％和4％之间调整。但是，根据化学结构和/或取决于测量化合物的浓度，将参数“最小高度”设置为<1％可能是合理的。

一般细节

所有反应均在氮气(n2)气氛下进行。所有试剂和溶剂均购自商业供应商并按原样使用。在bruker(300或400mhz¹h，75或101mhz¹³c)光谱仪上记录核磁共振(nmr)光谱。以nmr溶剂为参考的ppm(δ)报告质子和碳化学位移。数据报告如下：化学位移，多重性(br＝宽，s＝单峰，d＝双峰，t＝三重峰，q＝四重峰，m＝多重峰；偶合常数(s)，单位为hz)。在teledyneiscocombiflashrf上使用40-60μm硅胶(目)进行快速色谱。串联液相色谱/质谱(lc/ms)在waters2795分离模块和3100质量检测器上进行，使用waterssymmetryc18柱(3.5μm，4.6×100mm)，梯度为水中的0-100％ch3cn，经2.5分钟，用恒定的0.1％甲酸。在emreagent0.25mm硅胶60-f板上进行分析型薄层色谱(tlc)。元素分析由robertsonmicrolitlaboratories，ledgewoodnj进行。

方案1：合成6-[3,5-二氟-4-(吗啉-4-基)苯基]-5-甲基-4,5-二氢哒嗪-3(2h)-酮:

a)吗啉，n,n-二异丙基乙基胺，ch3cn，回流；b)lihmds，thf，-78℃，然后溴乙酸乙酯，thf，-78℃至室温；c)肼，etoh，回流.

步骤a：1-[3,5-二氟-4-(吗啉-4-基)苯基]丙-1-酮.

将7.0g1-(3,4,5-三氟苯基)丙-1-酮(37mmol)、32.5ml吗啉(372mmol)和13.2mln,n-二异丙基乙基胺(77.4mmol)在70mlch3cn中的溶液在回流温度加热过夜。将反应冷却且浓缩，添加水且用ch2cl2冲洗。将ch2cl2干燥(mgso4)且浓缩。粗产物溶于ch2cl2和己烷的混合物。旋转蒸发导致大量固体形成，然后浓缩完全且停止蒸发。将固体过滤且用己烷冲洗得到6.06g产物，其为灰白色固体，通过lc和nmr分析为清洁的。将母液浓缩且从己烷重结晶得到另外1.67g产物，为黄色固体，总产量为7.73g(81％)。¹hnmr(300mhz，cdcl3)δ7.46(d，j＝10.8hz，2h)，3.89–3.75(m，4h)，3.41–3.24(m，4h)，2.90(q，j＝7.2hz，2h)，1.21(t，j＝7.2hz，3h)。¹⁹fnmr(376mhz，cdcl3)δ-119.79.质量256(m+1)。

步骤b：4-[3,5-二氟-4-(吗啉-4-基)苯基]-3-甲基-4-氧代丁酸乙酯。

将lihmds(28.8ml，28.8mmol)在thf中的1.0m溶液中添加至30mlthf且用干冰/异丙醇浴冷却。通过注射器向其缓慢添加7.42g1-[3,5-二氟-4-(吗啉-4-基)苯基]丙-1-酮(29.2mmol)在20mlthf中的溶液。冷却搅拌1h后，通过注射器缓慢添加3.85ml(34.6mmol)溴乙酸乙酯在10ml四氢呋喃中的溶液且将反应混合物温热至室温过夜。第二天该反应用nh4cl(aq)淬灭，添加etoac，分离且用盐水冲洗。干燥且浓缩后，产物用己烷中的0-10％etoac层析以得到6.20g(63％)产物，其油状物。¹hnmr(400mhz，cdcl3)δ7.51(d，j＝10.7hz，2h)，4.11(q，j＝7.1hz，2h)，3.81(dd，j＝16.8，5.0hz，5h)，3.33(s，4h)，2.96(dd，j＝16.9，8.9hz，1h)，2.45(dd，j＝16.9，5.3hz，1h)，1.27–1.18(m，6h)。质量342(m+1)。

步骤c：6-[3,5-二氟-4-(吗啉-4-基)苯基]-5-甲基-4,5-二氢哒嗪-3(2h)-酮.

向6.20g4-[3,5-二氟-4-(吗啉-4-基)苯基]-3-甲基-4-氧代丁酸乙酯在100mletoh中的溶液中添加2.84ml肼(90.5mmol)且反应在回流温度加热过夜。第二天早上将溶液冷却至室温得到白色晶体，将其过滤且用etoh冲洗得到1.8g清洁产物，其通过lc和nmr分析测定。¹hnmr(400mhz，cdcl3)δ8.84(s，1h)，7.28(d，j＝11.1hz，2h)，3.91–3.79(m，4h)，3.30–3.26(m，4h)，3.26–3.20(m，1h)，2.72(dd，j＝17.0，6.9hz，1h)，2.50(d，j＝16.9hz，1h)，1.25(d，j＝7.4hz，3h)。¹⁹fnmr(376mhz，cdcl3)δ-119.69。质量310(m+1)。将母液浓缩一半且回流6h。冷却生成的晶体，将其过滤且用etoh冲洗得到另外910mg产物，其包含少量杂质。总产量2.71g(48％)。

对映异构体通过手性超临界流体色谱法分离：柱：chiralpakas-h，250x4.6mm，5um，流动相改性剂：100％甲醇，梯度：5至50％甲醇，经10分钟，流速：4ml/min，反压力：100巴，柱温：40℃。uv检测为200-400nm。更有活性的(r)-对映异构体(保留时间7.08min)称为化合物1。化合物1在hela细胞活力测定中测试且其ec50测定为1.1nm。化合物1以5nm的ic50抑制pde3a，且化合物1以12nm的ic50抑制pde3b。

方案2：合成(5r)-6-[3,5-二氟-4-(吗啉-4-基)苯基]-5-甲基-4,5-二氢哒嗪-3(2h)-酮和(5s)-6-[3,5-二氟-4-(吗啉-4-基)苯基]-5-甲基-4,5-二氢哒嗪-3(2h)-酮：

a)吗啉，n,n-二异丙基乙基胺，ch3cn，回流；b)lihmds，thf，-78℃，然后溴乙酸乙酯，thf，-78℃至室温；然后水合肼，etoh，回流；c)分离对映异构体。

步骤a：1-[3,5-二氟-4-(吗啉-4-基)苯基]丙-1-酮。两个平行反应以以下方式进行：在氮气氛将1-(3,4,5-三氟苯基)丙-1-酮(110ml，740mmol)溶于乙腈(1.4l，27mol)。添加吗啉(490ml，5.6mol)和n,n-二异丙基乙基胺(200ml，1.1mol)且将混合物在100℃搅拌4h。去除溶剂且合并两个这种反应的粗产物。添加二氯甲烷(1000ml)且用h2o(400ml)和饱和氯化钠水溶液(300ml)洗涤5次。有机相用硫酸镁干燥，过滤且真空干燥以得到标题化合物(383.29g，理论值的100％)，纯度为90％。1h-nmr(400mhz，dmso-d6)δ[ppm]1.03(t，j＝7.22hz，3h)2.72(q，j＝7.18hz，2h)3.14(m，4h)3.58-3.67(m，4h)7.19-7.34(m，2h)。

步骤b：6-[3,5-二氟-4-(吗啉-4-基)苯基]-5-甲基-4,5-二氢哒嗪-3(2h)-酮.

将1,1,1,3,3,3-六甲基二硅基胺基锂(lithium1,1,1,3,3,3-hexamethyldisilazan-2-ide)(510ml，thf中1.0m，510mmol)添加至thf(560ml)且冷却至-78℃，然后缓慢添加溶于thf(850ml)的1-[3,5-二氟-4-(吗啉-4-基)苯基]丙-1-酮(128g，501mmol)。将反应在-70℃搅拌1h。缓慢添加溶于thf(110ml)的溴乙酸乙酯(67ml，600mmol)。将混合物在-70℃搅拌30分钟。移除冷却浴且将混合物搅拌16h。添加氯化铵水溶液(100ml)和乙酸乙酯(100ml)。水相用乙酸乙酯(500ml)萃取两次。将所有收集的有机相与饱和氯化钠水溶液(500ml)经硫酸镁干燥，过滤且真空干燥。得到粗4-[3,5-二氟-4-(吗啉-4-基)苯基]-3-甲基-4-氧代丁酸乙酯(181g，530.6mmol，定量)且将50g直接进行下一反应。因此，在氮气氛中将粗4-[3,5-二氟-4-(吗啉-4-基)苯基]-3-甲基-4-氧代丁酸乙酯(50.0g，146mmol)溶于乙醇(310ml，5.3mol)。添加水合肼(22ml，65％纯度，290mmol)且将混合物在回流搅拌16h。添加水(1000ml)且将有机相用乙酸乙酯(300ml)萃取三次。有机相用饱和氯化钠水溶液洗涤，用硫酸钠干燥，过滤且进一步真空干燥。粗产物通过色谱法纯化(二氧化硅，二氯甲烷/乙酸乙酯梯度)以得到标题化合物(9.78g，理论值的22％)，纯度为95％。lc-ms(方法2)：rt＝0.96min；ms(esipos)：m/z＝310[m+h]⁺。1h-nmr(400mhz，dmso-d6)δ[ppm]：1.03(d，j＝7.35hz，3h)2.15-2.27(m，1h)2.60-2.74(m，1h)3.09-3.20(m，4h)3.37(m，1h)3.65-3.73(m，4h)7.42(d，j＝11.66hz，2h)11.04(s，1h)。

步骤c：将6-[3,5-二氟-4-(吗啉-4-基)苯基]-5-甲基-4,5-二氢哒嗪-3(2h)-酮(8.0g，25,86mmol)分离为(5r)-6-[3,5-二氟-4-(吗啉-4-基)苯基]-5-甲基-4,5-二氢哒嗪-3(2h)-酮(化合物1)和(5s)-6-[3,5-二氟-4-(吗啉-4-基)苯基]-5-甲基-4,5-二氢哒嗪-3(2h)-酮(化合物1a)。

仪器：labomatichd5000，labocord-5000；gilsongx-241，labcolvario4000，柱：ymcamylosesa5μ250x50mm；溶剂a：二氯甲烷；溶剂b：乙醇；等度：80％a+20％b；流速100.0ml/min；uv325nm。

(5r)-6-[3,5-二氟-4-(吗啉-4-基)苯基]-5-甲基-4,5-二氢哒嗪-3(2h)-酮.3.77g(95％纯度，45％产率)。lc-ms(方法1)：rt＝0.99min；ms(esipos)：m/z＝310[m+h]⁺。1h-nmr(500mhz，dmso-d6)δ[ppm]：1.024(15.88)，1.038(16.00)，2.209(3.09)，2.242(3.49)，2.357(0.46)，2.361(0.65)，2.365(0.48)，2.514(2.20)，2.518(1.98)，2.522(1.56)，2.631(0.54)，2.635(0.75)，2.643(2.60)，2.657(2.91)，2.676(2.45)，2.690(2.28)，3.146(6.85)，3.154(9.80)，3.163(7.30)，3.352(1.66)，3.354(1.66)，3.366(2.32)，3.369(2.28)，3.381(1.56)，3.382(1.47)，3.395(0.40)，3.679(11.05)，3.688(11.70)，3.697(10.24)，5.758(1.59)，7.395(0.53)，7.400(1.00)，7.412(7.35)，7.434(7.49)，7.446(0.94)，7.451(0.61)，11.038(8.10)。[α]²⁰＝-377.7°(dmso)wl＝589nm。

(5s)-6-[3,5-二氟-4-(吗啉-4-基)苯基]-5-甲基-4,5-二氢哒嗪-3(2h)-酮。3.92g(95％纯度，47％产率)。lc-ms(方法1)：rt＝0.99min；ms(esipos)：m/z＝310[m+h]⁺。¹h-nmr(500mhz，dmso-d6)δ[ppm]：1.024(15.91)，1.038(16.00)，2.209(3.44)，2.242(3.87)，2.361(0.71)，2.518(2.69)，2.522(2.03)，2.635(0.91)，2.643(2.77)，2.657(2.97)，2.676(2.50)，2.690(2.34)，3.154(11.36)，3.352(2.22)，3.366(2.70)，3.381(1.81)，3.394(0.47)，3.679(11.54)，3.688(13.11)，3.697(10.77)，5.758(0.69)，7.395(0.60)，7.400(1.08)，7.412(7.61)，7.434(7.72)，7.445(1.07)，7.451(0.68)，11.038(8.42)。[α]²⁰＝+356.9°(dmso)wl＝589nm。

方案3：合成6-[3,5-二氟-4-(吗啉-4-基)苯基]-5-甲基-4,5-二氢哒嗪-3(2h)-酮：

a)lihmds，thf，-78℃，然后溴乙酸乙酯，thf，-70℃至室温；b)吗啉，n,n-二异丙基乙基胺，然后水合肼，100℃.

步骤a：3-甲基-4-氧代-4-(3,4,5-三氟苯基)丁酸乙酯.

将1,1,1,3,3,3-六甲基二硅基胺基锂(12ml，thf中1.0m，12mmol)添加至thf(10ml)且冷却至-70℃，然后缓慢添加溶于thf(8ml)的1-(3,4,5-三氟苯基)丙-1-酮(1.7ml，12mmol)。将反应在-70℃搅拌1.5h。缓慢添加溶于thf(3ml)的溴乙酸乙酯(1.6ml，14mmol)。将混合物在-70℃搅拌30分钟。移除冷却浴且将混合物搅拌16h。将混合物添加至盐酸水溶液(200ml，1minh2o)且用二氯甲烷萃取三次。所有收集的有机相用硫酸镁干燥，蒸发且真空干燥。通过柱色谱法纯化(硅胶，己烷/乙酸乙酯，梯度)得到标题化合物(1.75g，理论值的46％)，纯度为85％。lc-ms(方法1)：rt＝0.1.31min；ms(esipos)：m/z＝275.3[m+h]⁺。

步骤b：6-[3,5-二氟-4-(吗啉-4-基)苯基]-5-甲基-4,5-二氢哒嗪-3(2h)-酮.

向3-甲基-4-氧代-4-(3,4,5-三氟苯基)丁酸乙酯(110mg，401μmol)在n,n-二异丙基乙基胺中的溶液中添加吗啉(70μl，800μmol)。将混合物在100℃搅拌16h。冷却至室温后，添加水合肼(1:1)(240μl，80％纯度，4.0mmol)且将混合物在100℃搅拌3h。将水缓慢添加至温热的混合物中且持续搅拌30分钟。将沉淀过滤，用水洗涤且真空干燥以得到标题化合物(65mg，理论值的50％)，纯度为95％。lc-ms(方法1)：rt＝0.99min；ms(esipos)：m/z＝310[m+h]⁺。

1h-nmr(400mhz，dmso-d6)δ[ppm]：1.022(15.91)，1.040(16.00)，2.205(3.14)，2.245(3.67)，2.322(0.60)，2.326(0.84)，2.332(0.60)，2.518(3.03)，2.522(1.99)，2.637(2.53)，2.655(2.96)，2.664(0.77)，2.668(0.96)，2.673(0.86)，2.679(2.51)，2.697(2.25)，3.143(7.04)，3.154(10.24)，3.166(7.62)，3.348(1.74)，3.351(1.77)，3.366(2.35)，3.370(2.34)，3.384(1.61)，3.403(0.41)，3.677(11.35)，3.689(12.18)，3.700(10.28)，7.388(0.58)，7.395(1.07)，7.409(7.78)，7.438(8.13)，7.452(1.03)，7.459(0.68)，11.038(8.33)。

合成化合物2

6-[3,5-二氯-4-(吗啉-4-基)苯基]-5-甲基-4,5-二氢哒嗪-3(2h)-酮

化合物2

步骤1):

向溶于1mldmf的200mg(0.984mmol)(r)-6-(4-氨基苯基)-5-甲基-4,5-二氢哒嗪-3(2h)-酮中添加250μl(2.00mmol)双(2-溴乙基)醚和400mgk2co3且将混合物在60℃搅拌过夜。第二天添加额外250μl双(2-溴乙基)醚和170mgk2co3。3h后，添加etoac和水，水用etoac冲洗，将合并的etoac洗涤物干燥且浓缩。用ch2cl2中的0-4％meoh进行的色谱法得到125mg产物化合物3(46％)。1hnmr(300mhz，cdcl3)δ8.61(s，1h)，7.68(d，j＝8.8，2h)，6.92(d，j＝8.8，2h)，3.99–3.76(m，4h)，3.44–3.31(m，1h)，3.29–3.22(m，4h)，2.70(dd，j＝6.7，16.8，1h)，2.46(d，j＝16.7，1h)，1.24(d，j＝7.3，3h)。¹³cnmr(75mhz，cdcl3)δ166.64，154.05，152.18，127.10，125.33，114.73，66.69，48.33，33.93，27.94，16.36.ms：274(m+1)。c15h19n3o2的分析计算值：c，65.91；h，7.01；n，15.37；实测值65.81，h，6.66，n，15.26.

化合物2a和化合物2

步骤2

将溶于5mlhoac的300mg化合物3(1.10mmol)的溶液剧烈搅拌且在冷却水浴中在约10-15℃冷却使得不发生冷冻。通过注射器经约30分钟向其添加总共2.2ml10-15％naocl(aq)，然后lc指示化合物3消失。将反应转移至分液漏斗，添加水且用ch2cl2冲洗几次。合并的ch2cl2用nahso3和nahco3的水溶液冲洗，然后干燥且用己烷中的0-60％etoac进行色谱法以分离140mg化合物2(35％，较快洗脱的产物)和135mg(40％)化合物2a。各产物从meoh重结晶。

化合物2a：1hnmr(400mhz，cdcl3)δ8.58(s，1h)，7.80(d，j＝2.2hz，1h)，7.60(dd，j＝8.2，2.5hz，1h)，7.04(d，j＝8.4hz，1h)，4.02-3.76(m，4h)，3.38-3.22(m，1h)，3.23-3.02(m，4h)，2.70(dd，j＝17.0，6.8hz，1h)，2.48(d，j＝17.6hz，1h)，1.24(d，j＝7.3hz，3h)。¹³cnmr(101mhz，cdcl3)δ166.65，152.50，150.20，130.02，128.81，128.39，125.25，119.96，66.99，51.40，33.80，27.92，16.27。质量308(m+1)。c15h18cln3o2的分析计算值：c，58.54；h，5.89；n，13.65。实测值：c，58.30；h，5.99；n，13.63。

化合物2：¹hnmr(400mhz，cdcl3)δ8.95(s，1h)，7.67(s，2h)，3.90-3.75(m，4h)，3.35-3.17(m，5h)，2.70(dd，j＝17.0，6.7hz，1h)，2.49(d，j＝17.0hz，1h)，1.24(d，j＝7.3hz，3h)。¹³cnmr(101mhz，cdcl3)δ166.38，151.17，145.62，134.83，132.35，126.65，67.64，49.97，33.72，27.85，16.19。质量342(m+1)。c15h17cl2n3o2的分析计算值：c，52.64；h，5.01；n，12.28。实测值：c，52.68；h，4.90；n，12.28。

化合物2在hela细胞活力测定中测试且其ec50测定为1.9nm。化合物2以4nm的ic50抑制pde3a，且化合物2以11nm的ic50抑制pde3b。

使用或可以使用以下方法和材料以获得支持化合物1和2的活性的数据：

实施例1

细胞增殖测量

在人癌细胞中体外检测了通式(i)化合物的抗增殖活性。为此目的，将1000个细胞(包括hut78细胞，500个hela细胞或500个a2058细胞)接种在具有适当生长培养基的384孔板中，并在37℃下孵育过夜。24小时后，将测试板上的细胞用通式(i)的化合物处理，并在37℃下孵育72小时。通过hpd300数字分配器以10(或更多)阶梯稀释系列将化合物加入细胞中。作为对照，用媒介物(dmso，终浓度0.3％)处理细胞。72小时后，用20μl/孔的50％ctg在pbs中的溶液(promegacelltiterglo(目录号g755b和g756b))处理细胞，并在室温下温育10分钟，并通过victorv(perkinelmer)测量发光，以确定治疗结束时的细胞活力。使用来自未处理孔的值(＝百分比存活率)测定每种测试物质对细胞生长的百分比作用和由此得到的ic50。使用4-参数拟合计算ic50值。

表2化合物1的细胞增殖结果

因此本发明另一方面为化合物1和/或化合物2，尤其是化合物1治疗皮肤癌(例如，黑素瘤)和子宫颈癌的用途。

实施例2

细胞系中的化合物敏感性测试

将个1000hela(dmem)细胞接种在384孔板中的40μl补充有10％胎牛血清的相应生长培养基中。铺板24小时后，以指定浓度加入指定的化合物并孵育48小时。在nci-h1734和a549细胞系中如化合物文库筛选所述评估细胞活力。如图1所示，化合物1和2在hela细胞中具有相似的剂量响应曲线。在hela细胞活力测定中测试化合物1，并确定其ec50为1.1nm。化合物1以5nm的ic50抑制pde3a，且化合物1以12nm的ic50抑制pde3b。

在hela细胞活力测定中测试化合物2，并确定其ec50为1.9nm。化合物2以4nm的ic50抑制pde3a，且化合物2以11nm的ic50抑制pde3b。

图2显示化合物1和化合物2在hut78细胞中的剂量响应曲线，该hut78细胞缺乏pde3a表达，但表达升高水平的pde3b和slfn12。

hela细胞中的胱天蛋白酶活性

将1000个hela细胞接种在384孔板中的40μl补充有10％胎牛血清的相应生长培养基中。接种后24小时，以指定浓度加入指定的化合物并孵育48小时。根据制造商的建议添加来自promega的胱天蛋白酶-glo并读取发光。

敏感度测量与基础基因表达的相关性

从癌细胞系百科全书(ccle，一大组人类癌细胞系的详细遗传特征；barretina等人，nature483,603-607,2012)下载了在affymetrixgenechiphumangenomeu133plus2.0阵列上测量的以基因为中心的稳健多芯片平均(rma)-标准化的基础mrna基因表达数据。在760个重叠ccl上计算基因表达(18,988个转录物)和曲线下面积(auc)之间的皮尔森相关系数。为了比较暴露于不同数量ccl的小分子，使用fisher变换来转换相关系数。

实施例3

免疫印迹

通过标准sds-page分离全细胞裂解物。用来自bethyllaboratories的抗pde3aa302-740a检测pde3a蛋白。用来自bethyllaboratories的抗pde3ba303-743a检测pde3b蛋白。

图3显示了hut78、rvh42和hela细胞系中内源性pde3a蛋白表达的免疫印迹。可以看出，与hut78和rvh42细胞相比，hela细胞具有高表达的pde3a。粘着斑蛋白在免疫印迹中作为负载对照检测。

实施例4

pde3a酶抑制的方法

可商购的³h-camp闪烁亲近测定法(spa，perkinelmer)系统用于酶抑制研究。为了测定测试物质对pde3a反应的体外作用，将2μl在dmso中的相应测试化合物溶液(连续稀释)置于微量滴定板(isoplate-96/200w；perkinelmer)的孔中。添加在缓冲液a(50mmtris/hclph7.5，8.3mmmgcl2，1.7mmedta，0.2％bsa)中的源自过表达人全长pde3a(sbdrugdiscovery，uk)的sf9细胞的50μl稀释的pde3a细胞提取物。选择pde3a细胞提取物的稀释度使得反应动力学是线性的并且消耗少于70％的底物(典型稀释度1:5000)。通过添加缓冲液a中的50μl(0.025μci)1:2000w/obsa稀释的底物[8-³h]3'，5'-环磷酸腺苷(1μci/μl；perkinelmer)开始反应。在室温下孵育60分钟后，通过加入25μl含有18mg/ml钇闪烁邻近珠(perkinelmer)的水悬浮液终止反应。将微量滴定板密封并在microbeta闪烁计数器(perkinelmerwallac)中测量。通过绘制百分比pde3a活性对log化合物浓度，从s形曲线确定ic50值。

pde3b酶抑制

市售的³h-camp闪烁亲近测定(spa，perkinelmer)系统用于酶抑制研究。为了测定测试物质对pde3b反应的体外作用，将2μl在dmso中的相应测试化合物溶液(连续稀释)置于微量滴定板(isoplate-96/200w；perkinelmer)的孔中。添加在缓冲液a(50mmtris/hclph7.5，8.3mmmgcl2，1.7mmedta，0.2％bsa)中的源自过表达人全长pde3b(sbdrugdiscovery，uk)的sf9细胞的50μl稀释的pde3b细胞提取物。选择pde3b细胞提取物的稀释度使得反应动力学是线性的并且消耗少于70％的底物(典型的稀释度1：6000)。通过添加缓冲液a中的50μl(0.025μci)1:2000w/obsa稀释的底物[8-³h]3',5'-环磷酸腺苷(1μci/μl；perkinelmer)开始反应。在室温下孵育60分钟后，通过加入25μl含有18mg/ml钇闪烁邻近珠(perkinelmer)的水悬浮液终止反应。将微量滴定板密封并在microbeta闪烁计数器(perkinelmerwallac)中测量。通过绘制百分比pde3b活性对log化合物浓度，从s形曲线确定ic50值。

对于化合物1，ic50值分别为4.6nm(pde3aic50)和5.6nm(pde3bic50)。

实施例5

用于人冷冻肝细胞的方法:

冷冻保存的人肝细胞的体外代谢稳定性研究(包括肝脏体内血液清除率(cl)和最大口服生物利用度(fmax)的计算)

将冷冻保存的肝细胞(例如购自celsisinvitrotechnologies)简单解冻，用45ml预热的体外groht培养基洗涤，并以50×g离心5分钟。将细胞沉淀重悬于5mlkrebs-henseleitbutter(khb)中。通过台盼蓝排除法测定细胞活力。

对于代谢稳定性测定，在玻璃小瓶中将肝细胞以1.0×10⁶活细胞/ml的密度分布在含有5％fcs的wme中。加入测试化合物至终浓度为1μm。在温育期间，以580rpm连续摇动肝细胞悬浮液，并在2、8、16、30、45和90分钟取出等分试样，立即加入等体积的冷甲醇。将样品在-20℃下冷冻过夜，随后在3000rpm下离心15分钟，并用具有lcms/ms检测的agilent1290hplc系统分析上清液。

从浓度-时间图确定测试化合物的半衰期。从半衰期计算出内在清除率。与肝脏血流量、体内和体外肝细胞量的附加参数一起。计算肝脏体内血液清除率(cl)和最大口服生物利用度(fmax)。使用下式计算肝脏体内血液清除率(cl血液)和最大口服生物利用度(fmax)：cl'内在[ml/(min*kg)]＝kel[1/min]/((cellno/培养的体积[ml])*fu,inc)*(cellno/肝重量[g])*(具体肝重量[g肝/kg体重])；cl血液孔-搅拌[l/(h*kg)]＝(qh[l/(h*kg)]*fu,血液*cl'内在[l/(h*kg)])/(qh[l/(h*kg)]+fu,血液*cl'内在[l/(h*kg)])；fmax＝1-cl血液/qh且使用以下参数值:肝血流量–1.32l/h/kg人；具体肝重量–21g/kg体重；体内肝细胞-1.1x108细胞/g肝,体外肝细胞–1.0x106/ml.；fu,inc和fu,血液取1。

相比于(5r)-6-[3-氟-4-(吗啉-4-基)苯基]-5-甲基-4,5-二氢哒嗪-3(2h)-酮(平均代谢稳定性(fmax)＝49％)，(5r)-6-[3,5-二氟-4-(吗啉-4-基)苯基]-5-甲基-4,5-二氢哒嗪-3(2h)-酮在人肝细胞中显示增加的稳定性(平均代谢稳定性(fmax)＝66％)。

实施例6

在非啮齿类(例如狗)中的体内药代动力学

对于体内药代动力学实验，将测试化合物以0.1至1mg/kg的剂量静脉内施用于非啮齿动物(例如雌性beagle犬)，并且以0.3至3mg/kg的剂量胃内施用于非啮齿动物(例如雌性beagle犬)，该测试化合物使用增溶剂如peg400配制成溶液，以良好耐受的量，且通常以短期输注(15分钟)给药。

血样例如从隐静脉给药后2分钟、8分钟、15分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、8小时和24小时采集。取决于预期的半衰期，在稍后的时间点(例如48小时，72小时)采集另外的样品。

对于胃内给药后的药代动力学，将测试化合物胃内给予禁食的非啮齿动物(例如狗)。例如在给药后5分钟、15分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、8小时和24小时采集血样。取决于预期的半衰期，在稍后的时间点(例如48小时，72小时)采集另外的样品。将血液收集到锂-肝素管(monovetten，sarstedt)中并以3000rpm离心15分钟。取上清液(血浆)的小等分试样(例如100μl)并通过加入等分试样冰冷的乙腈(例如400μl)沉淀并在-20℃下冷冻过夜。随后将样品解冻并在3000rpm、4℃下离心20分钟。取上清液的等分试样，使用具有lcms/ms检测的agilenthplc系统进行分析测试。使用pk计算软件通过非隔室分析计算pk参数。

静脉内给药后衍生自浓度-时间曲线的pk参数：cl血浆：测试化合物的总血浆清除率(l/kg/h)；cl血液：测试化合物的总血液清除率：cl血浆*cp/cb(缩写：clp；)，以l/kg/h)，其中cp/cb为血浆和血液中的浓度比。

胃内给药后从浓度时间曲线计算的pk参数：cmax：最大血浆浓度(以mg/l)；cmaxnorm：cmax除以给药剂量(以kg/l)；tmax：观察到cmax的时间点(h)。参数从静脉内和胃内浓度-时间曲线二者计算：aucnorm：从t＝0h至无穷大(外推)的浓度-时间曲线下面积除以给药剂量(以kg*h/l)；auc(0-tlast)norm：从t＝0h至血浆浓度可测量的最后时间点的浓度-时间曲线下面积除以给药剂量(以kg*h/l)；t1/2：终末半衰期(h)；f：口服生物利用度：胃内给药后的aucnorm除以静脉内给药后的aucnorm(％)。

相比于(5r)-6-[3-氟-4-(吗啉-4-基)苯基]-5-甲基-4,5-二氢哒嗪-3(2h)-酮(clp＝1.7l/h/kg)，(5r)-6-[3,5-二氟-4-(吗啉-4-基)苯基]-5-甲基-4,5-二氢哒嗪-3(2h)-酮显示在狗中减少的清除率(clp＝0.77l/h/kg)。

使用crispr靶向pde3a基因座

使用mitcrispr设计工具(在线mitcrispr设计入口)确定crispr靶标位点。为了克隆sgrna，将正向和反向寡核苷酸(oligos)退火，磷酸化并连接到bsmbi消化的pxpr_brd001中。寡核苷酸序列如下：

为了产生慢病毒，使用磷酸钙将293t细胞与pxpr_brd001、pspax2和pmd2.g共转染。用2ug/ml嘌呤霉素选择感染的a2058和hela细胞。

图4显示具有和不具有crispr敲除pde3a的敏感性a2058细胞系的免疫印迹。用抗pde3a免疫印迹显示pde3a-crispra2058细胞中pde3a蛋白的表达大大降低。如在图5中所示的剂量响应曲线中可以看到的那样。pde3b的异位表达在具有很少或没有pde3a表达的细胞中恢复对化合物1的敏感性。

表1显示了表达升高的pde3a的敏感细胞系a2058、表达少量pde3a但pde3b水平升高的敏感细胞系hut78、和仅表达低水平的slfn12的不敏感细胞系a549的pde3a、pde3b和slfn12rna表达值。

可以看出，pde3a和slfn12都在细胞系a2058中升高，该细胞系a2058显示对化合物的敏感性。此外，不敏感细胞系a549仅表达中等水平的pde3a且几乎不表达slfn12。敏感细胞系hut78具有升高的slfn12表达，但没有升高的pde3a表达。相反，细胞系hut78具有升高的slfn12表达和pde3b表达。

表1

实施例7

体内异种移植模型

在人癌症的鼠异种移植模型中检查化合物1的抗肿瘤活性。为此目的，将小鼠皮下植入肿瘤细胞。在平均肿瘤大小为20-40mm²时，将动物随机分入治疗组和对照组(至少n＝10只动物/组)，并且仅用媒介物或化合物1(制剂：90％peg400/10％乙醇；施用途径：经口(“p.o.”)，口服)。口服施用体积为10ml/kg。在每日两次治疗的情况下，每天两次施用之间的时间间隔为6-7小时。至少每周测定肿瘤大小和体重。通过电子卡尺[长度(mm)x宽度(mm)]检测肿瘤面积。基于德国和欧洲动物福利法规，当媒介物对照的肿瘤达到预定的伦理终点时，实验结束。体内抗肿瘤效力以表7中的研究结束时的t/c比率表示(治疗/对照；治疗组的平均肿瘤面积或重量/对照组的平均肿瘤面积或重量)。将t/c低于0.5的化合物定义为活性的(即有效的)。使用sigmastat软件评估统计分析。进行单因素方差分析，并通过成对比较程序(dunn方法)比较与对照的差异。

结果(表7):

化合物1在单一疗法治疗后在人肿瘤的不同异种移植模型中显示出有效的抗肿瘤功效。具体地，化合物1有效减少宫颈癌和黑素瘤中的肿瘤面积。

表7:

化合物1在小鼠中的不同人癌症异种移植模型中的抗肿瘤活性。

*在研究结束时治疗相比对照，p<0.05

a)t/c＝治疗组的平均肿瘤面积与对照组的平均肿瘤面积的比率。

b)t/c＝治疗组的平均最终肿瘤重量与对照组的平均最终肿瘤重量的比率

缩写2qd表示每天两次，p.o.是指经口或口服。

其它实施方案

从前面的描述中，显而易见的是，可以对本文描述的发明进行变化和修改，以将其用于各种用法和条件。这些实施例也在以下权利要求的范围内。

本文的变量的任何定义中的元素列表的叙述包括将该变量定义为所列元素的任何单个元素或组合(或子组合)。本文中的实施方案的叙述包括作为任何单个实施方案的实施方案或与任何其他实施方案或其部分的组合。

通过引用合并

本说明书中提及的所有专利和出版物均以引用的方式并入本文，其程度如同每个独立专利和出版物被明确且单独地指出通过引用并入。

序列表

<110>拜耳股份有限公司

拜耳医药股份公司

布罗德研究所股份有限公司

达纳-法伯癌症研究所股份有限公司

<120>用于癌症治疗的化合物、组合物和方法

<130>bhc173005

<160>10

<170>bissap1.3.6

<210>1

<211>519

<212>prt

<213>dh10b-r

<220>

<223>lab宿主:dh10b-r

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151015

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<210>3

<211>1141

<212>prt

<213>智人

<220>

<223>人全长pde3a氨基酸序列

<400>3

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151015

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1140

<210>4

<211>7319

<212>rna

<213>智人

<220>

<223>转录变体1

<400>4

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cgccgtcatgggcgaggcccacggcctcattaccgacctcctggcagacccttctcttcc1140

accaaacgtgtgcacatccttgagagccgtgagcaacttgctcagcacacagctcacctt1200

ccaggccattcacaagcccagagtgaatcccgtcacttcgctcagtgaaaactatacctg1260

ttctgactctgaagagagctctgaaaaagacaagcttgctattccaaagcgcctgagaag1320

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actgcaggaagcaccttcatccagtcctgattcttggaataatccagtgatgatgaccct1500

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<213>人工序列

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<223>pde3a_sg2反向寡核苷酸

<400>10

aaacttggaatagcaagcttgtctc25