CD47-CAR-T细胞的制作方法

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发明领域

本发明涉及人源化的cd47-car-t细胞，其有效攻击过表达cd47肿瘤抗原的肿瘤细胞。

背景技术：

免疫疗法正在成为一种非常有前景的癌症治疗方法。t细胞或t淋巴细胞是我们免疫系统的武装力量，其不断寻找外来抗原并区分异常(癌症或感染细胞)与正常细胞。用car遗传修饰t细胞是设计肿瘤特异性t细胞的常用方法。靶向肿瘤相关抗原的car-t细胞可以输注到患者体内(称为过继性t细胞疗法)，代表了一种有效的免疫治疗方法。与化学疗法或抗体相比，car-t技术的优势在于重编程的工程化t细胞可以增殖并持续存在于患者体内，像活的药物一样起作用。

通常，car(嵌合抗原受体)包括单克隆抗体衍生的单链可变片段(scfv)，其通过铰链和跨膜结构域连接至可变数量的胞内信号传导结构域和单个胞内激活cd3-ζ结构域。

图1显示了car从第一代(左侧，没有共刺激结构域)到第二代(中间，具有一个共刺激结构域cd28或4-bb)至第三代(具有两个或多个共刺激结构域)的进化，参见golubovskaya，wu，癌症，2016年3月15日；8(3)。产生的具有多个共刺激结构域的car(第三代car)会引起增加的细胞溶解活性，并显著改善car-t细胞的持续性，表现出增强的抗肿瘤活性。

cd47是免疫球蛋白超家族的细胞表面糖蛋白，其经常过表达于血液肿瘤(白血病、淋巴瘤，参见chao等，细胞，2010,142,699–713和多发性骨髓瘤)和实体肿瘤，如卵巢癌、小细胞肺癌、胰腺腺、胶质瘤、成胶质细胞瘤、小儿脑肿瘤，和其他类型的肿瘤(chao，同上，和weiskopf，j.clin。invest.2016,126,2610–2620)。cd47也被认为是“不要吃我的信号”，通过结合sirp-α(信号传导调节蛋白α)并阻断由sirp介导的肿瘤细胞的吞噬作用(weiskopf，同上)。研究显示，cd47高表达与一些肿瘤患者的不良临床结果相关，并被认为是临床预后因子。这样的肿瘤包括血液肿瘤，例如非霍奇金淋巴瘤(chao，同上)或急性髓性白血病(majeti等，细胞，2009,138,286-299)，以及实体肿瘤，例如卵巢癌、成胶质细胞瘤、胶质瘤等(willingham等，proc.natl.acad.sci.usa2012,109,6662–6667)。此外，研究显示，cd47信号传导在维持肿瘤起始细胞或癌症干细胞中起关键作用(kaur等，oncotarget，2016,7,10133-10152)。cd47在癌症干细胞中高度表达，癌症干细胞是最具攻击性的肿瘤细胞类型(cioffi等，临床癌症研究，2015,21,2325-2337)。利用cd47，阻断cd47和巨噬细胞上的sirpα的相互作用，诱导cd47阳性肿瘤的吞噬作用(kim等，白血病，2012,26,2538-2545)。

需要一种改进的疗效改善且毒性降低的过继性t细胞免疫疗法。

附图的简要说明

图1显示了第一代至第三代car的结构。

图2显示了cd47car构建体的结构。

图3a显示了cd47-car-t细胞相对t细胞和mock-car-t细胞的细胞毒性。显示了来自三次独立实验的rtca的定量。*p<0.0001cd47-car-t细胞相对t细胞和mockcar-t细胞的双因素方差分析(2-wayanova)与tukey’s后期测试(tukey’spost-test)。

图3b显示了cd47-car-t细胞以cd47依赖性方式产生il-2；在cd47阳性细胞中高，在cd47阴性细胞中较低。效靶比e：t为1：1。条形图显示了两次独立实验中cd47car-t细胞il-2分泌的平均值。*p<0.05，skov-3和a375细胞相对t细胞、mockcar-t细胞、a549细胞和hep3b细胞的学生t检验。

图4a显示bxpc3胰腺癌细胞中cd47表达显著高于cd24表达。条形图显示了bxpc3细胞表达的cd24和cd47与同种型对照igg1的mfi的平均比值±来自两次独立实验的标准差。*p＝0.029.

图4b显示rtca测定中cd47-car-t细胞有效杀伤bxpc3癌细胞系。

图4c显示，在体外，cd47-car-t细胞针对bxpc3细胞分泌高水平的细胞因子：ifn-γ、il-2和il-6，这与图4b中所示的cd47-car-t细胞对bxpcr3细胞的高细胞毒性一致。来自rtca测定的上清液用于细胞因子ilisa的测定。e：t＝10：1。*p<0.05。

图4d显示cd47-car-t细胞显著降低bxpc3的肿瘤生长，*p＝0.006，cd47-car-t细胞相比于1xpbs对照。n＝4-5只小鼠，分别是cd47/cd24-car-t细胞和1xpbs组。

图4e显示,在cd47-car-t细胞、cd24-car-t细胞和1xpbs对照组中，car-t细胞不影响小鼠体重。以克为单位测量小鼠体重，每周两次。

图4f和图4g分别显示cd47car-t细胞显著降低肿瘤大小和重量。p<0.05，cd47-car-t细胞相比于cd24-car-t细胞对照和1xpbs组。成像分析小鼠肿瘤(4f)并以克为单位测量重量(4g)。

图5a显示了人源化cd47scfv的氨基酸序列。上图：小鼠b6h12抗体的cd47scfv。下图：人源化的cd47。

图5b显示elisa证明了人源化cd47scfv与cd47抗原的高结合活性。人pdl-1抗原为阴性对照。结合活性显著高于小鼠cd47scfv。条形图显示了来自两次独立实验的平均结合活性。*p＝0.0025，小鼠cd47相比于pdl-1对照；**p＝0.0025，人源化cd47相比于pdl-1对照；和p＝0.0028，人源化cd47相比于小鼠cd47。

图5c显示用人源化cd47scfv和小鼠cd47scfv对肿瘤和正常样品进行的ihc染色。观察到类似的染色情况。人源化cd47scfv的ihc在肿瘤样品中显示高度染色，在正常组织中显示低度染色。

图6a显示了用人源化cd47-car-t细胞，以及cd47阳性或cd47阴性hela-cd19肿瘤靶细胞进行的rtca细胞毒性测定。cd47-car-t细胞对cd47阳性hela-cd19细胞具有细胞毒性，但对cd47阴性hela-cd19细胞不具细胞毒性。阳性对照cd19-car-t细胞有效杀伤cd19阳性hela-cd19细胞。

图6b说明了rtca测定的定量结果，其显示cd47-car-t细胞对cd47阳性癌细胞系具有显著增强的细胞毒性，但对cd47阴性hela-cd19细胞没有。*p<0.001，cd47-car-t细胞相比于mock-car-t细胞。

图6c显示了人源化cd47-car-t细胞针对cd47阳性skov-3细胞的il-2分泌。e：t比＝1：1。p<0.05，cd47-car-t细胞相比于对照，n＝3。

图6d显示cd47-car-t细胞针对cd47-阴性hela-cd19细胞不分泌il-2。mock-car-t细胞是阴性对照细胞。cd19-car-t细胞是针对hela-cd19靶细胞的阳性对照细胞。e：t比＝10：1。p<0.05，cd19-car-t细胞相比于对照，n＝3。

图7显示双特异性egfr-cd47car-t细胞杀伤egfr阴性mcf-7细胞。

图8a和8b显示双特异性egfr-cd47car-t细胞有效杀伤egfr阳性和cd47阳性bxpc3胰腺癌细胞(图8a)和skov卵巢癌细胞(图8b)。

具体实施方式

定义

如本文所用，“过继性细胞疗法”(act)是使用癌症患者自身具有抗肿瘤活性的t淋巴细胞的治疗，这些t淋巴细胞在体外扩增并重新注入患有癌症的患者体内。

如本文所用，“亲和力”是单个分子与其配体结合的强度。通常通过平衡解离常数(kd或kd)测量和报告亲和力，其用于评估和排序双分子相互作用的强度。

如本文所用，“嵌合抗原受体(car)”是一种融合蛋白，其包含能够结合抗原的胞外结构域，与胞外结构域衍生自不同多肽的跨膜结构域，以及至少一个胞内结构域。“嵌合抗原受体(car)”也称为“嵌合受体”、“t-体”或“嵌合免疫受体(cir)”。所述的“能够结合抗原的胞外结构域”是指能够结合某一抗原的任何寡肽或多肽。“胞内结构域”是指已知的作为传递信号以激活或抑制细胞内生物过程的结构域起作用的任何寡肽或多肽。

如本文所用，“域”或“结构域”是指多肽中独立于其它区域且折叠成特异结构的区域。

如本文所用，flag标签，或flag八肽，或flag表位是指可以利用重组dna技术添加到某一蛋白中的多肽蛋白标签，具有序列为dykdddd(seqidno.:1)的基序。其可以融合到蛋白的c端或n端，或插入蛋白内。

如本文所用，术语“人源化”通常是指利用基因工程技术，使得衍生自非人物种(例如小鼠或大鼠)的抗体或免疫球蛋白结合蛋白和多肽，在仍保留原始抗体的抗原结合性的同时，对人具有更低免疫原性的过程。在一些实施方式中，结合蛋白或多肽的抗体或免疫球蛋白(例如，轻链和重链可变区、fab、scfv)的结合结构域是人源化的。可以使用称为cdr移植的技术将非人结合结构域人源化，包括重塑、超嵌合和镶饰。如果衍生自非人源，则结合蛋白和多肽的抗体或免疫球蛋白的其他区域，例如铰链区和恒定区结构域，也可以是人源化的。

如本文所用，“单链可变区片段(scfv)”是指源自抗体的单链多肽，其保留了结合抗原的能力。scfv的实例包括通过重组dna技术形成的抗体多肽，其中免疫球蛋白重链(h链)和轻链(l链)片段的fv区经由间隔序列连接。制备scfv的各种方法是本领域技术人员所熟知的。

如本文所用，“肿瘤抗原”是指具有抗原性的生物分子，其表达导致癌症。

说明

本发明提供了靶向cd47肿瘤抗原的cd47-car和cd47-car-t细胞，cd47在许多类型的癌症例如卵巢癌、膀胱癌、白血病和淋巴瘤中高度过表达。本发明设计了与cd47抗原结合的car(嵌合抗原受体)-t细胞。本发明利用来自小鼠cd47抗体和人源化cd47抗体的scfv(单链可变片段)，制备用于靶向不同癌细胞系的cd47-car-t细胞。本发明的cd47-car-t细胞对几种癌细胞(胰腺癌、卵巢癌细胞系)具有高度的细胞毒性。人源化scfv的优点在于它降低了患者对小鼠序列的潜在免疫应答。

本发明涉及一种嵌合抗原受体(car)融合蛋白，其从n端到c端包含：(i)包含vh和vl的单链可变区片段(scfv)，其中scfv对cd47具有高亲和力，(ii)跨膜结构域，(iii)cd28共刺激结构域，和(iv)激活域。该car的(i)中可进一步包含第二scfv，其中第二scfv针对另一种肿瘤抗原，例如表皮生长因子受体(egfr)；此类car被称为双特异性car。

car构建体(图2)包含cd8信号肽、cd47scfv、cd8铰链、cd28跨膜结构域和cd3ζ激活结构域。

本发明的car包含与人cd47特异性结合的单链可变区片段(scfv)。抗cd47抗体的重链(h链)和轻链(l链)片段通过接头序列连接。例如，接头可以是5-20个氨基酸。scfv结构可以是从n-端到c-端的vl-接头-vh或vh-接头-vl。

本发明的car包含跨膜的跨膜结构域。所述的跨膜结构域可以衍生自天然多肽，也可以是人工设计的。衍生自天然多肽的跨膜结构域可以从任何膜结合蛋白或跨膜蛋白中获得。例如，可以使用t细胞受体α或β链、cd3ζ链、cd28、cd3-ε、cd45、cd4、cd5、cd8、cd9、cd16、cd22、cd33、cd37、cd64、cd80、cd86、cd134、cd137、icos、cd154、或gitr的跨膜结构域。人工设计的跨膜结构域是主要包含疏水残基如亮氨酸和缬氨酸的多肽。优选地，在合成跨膜结构域的各末端包含苯丙氨酸、色氨酸和缬氨酸的三联体。在优选的实施方式中，跨膜结构域衍生自cd28或cd8，其提供良好的受体稳定性。

在本发明中，共刺激结构域选自下组：人cd28、4-1bb(cd137)、icos-1、cd27、ox40(cd137)、dap10、和gitr(aitr)。

胞内结构域(激活域)是car的信号传输部分。识别抗原后，受体聚集并将信号传递给细胞。最常用的胞内结构域组件是cd3-zeta(cd3z或cd3ζ)，其含有3个itam。其在抗原结合后将激活信号传递给t细胞。cd3-ζ不能提供完全有效的激活信号，需要额外的共刺激信号传递。例如，一个或多个共刺激结构域可与cd3-ζ一起使用，以传递增殖/存活信号。

任选地，car融合蛋白包含在scfv的n端、或scfv的c端、或vh和vl之间的flag标签。flag标签需要位于胞外结构域，而不是胞内结构域。除了flag标签之外，可以在构建体中使用其他标签。flag标签是优选的标签，因为它不会引起免疫原性并可降低细胞因子分泌水平。

本发明的car可以包含与scfvn-末端连接的信号肽，使得当car在细胞内，例如t细胞内表达时，新生蛋白表达后会被导向内质网，随后导向细胞表面。信号肽的核心可包含一长段疏水性氨基酸，其倾向于形成单个α-螺旋。信号肽可以始于短的带正电荷的氨基酸段，这有助于在易位期间实施多肽的适当拓扑。在信号肽的末端，通常存在一段被信号肽酶识别和切割的氨基酸。信号肽酶可以在易位完成期间或之后切割，以产生游离信号肽和成熟蛋白质。随后，游离信号肽被特异性蛋白酶消化。例如，信号肽可以衍生自人cd8或gm-csf，或其具有1或2个氨基酸突变的突变体，条件是信号肽仍然发挥引导car的细胞表面表达的作用。

本发明的car可包含用作铰链的间隔序列，以连接scfv与跨膜结构域，并在空间上分离抗原结合结构域与胞内结构域。柔性间隔允许结合结构域在不同方向上定向，以使其能够与肿瘤抗原结合。间隔序列可以包含，例如igg1fc区、igg1铰链或cd8茎环，或其组合。人cd28或cd8茎环是优选的。

本发明提供了编码上述car的核酸。通过常规方法，利用特定car的氨基酸序列，可以制备编码car的核酸。利用前述各结构域的氨基酸序列的ncbirefseqid或genbenk登录号，可以获得编码氨基酸序列的核苷酸序列。本发明的核酸可以使用标准分子生物学和/或化学方法制备。例如，可以基于碱基序列合成核酸，并且可以通过使用聚合酶链反应(pcr)将从cdna文库获得的dna片段融合来制备本发明的核酸。

编码本发明的car的核酸可以插入载体中，并且可以将载体导入细胞。例如，可以使用病毒载体如逆转录病毒载体(包括致癌反转录病毒载体、慢病毒载体和假型载体)、腺病毒载体、腺相关病毒(aav)载体、猿病毒载体、牛痘病毒载体或仙台病毒载体、爱泼斯坦-巴尔病毒(ebv)载体和hsv载体。作为病毒载体，优选使用缺乏复制能力的病毒载体，以免在感染细胞中自复制。

例如，当使用逆转录病毒载体时，本发明的方法可以是通过基于载体所具有的ltr序列和包装信号序列，选择合适的包装细胞，并使用包装细胞制备逆转录病毒颗粒。包装细胞的实例包括pg13(atcccrl-10686)、pa317(atcccrl-9078)、gp+e-86、gp+envam-12和psi-crip。还可以使用具有高转染效率的293细胞或293t细胞来制备逆转录病毒颗粒。基于逆转录病毒和包装细胞产生的多种逆转录病毒载体可广泛地从许多公司获得。

本发明提供了经修饰以表达如上所述的嵌合抗原受体融合蛋白的t细胞。本发明的car-t细胞通过car与人cd47结合，从而将信号传递到细胞中，进而活化细胞。表达car的细胞的活化，可以根据宿主细胞的种类和car的胞内结构域而变化，并且可以基于例如细胞因子的释放、细胞增殖率的提高、细胞表面分子的改变等作为指标被确认。

经修饰以表达car的t细胞可用作疾病的治疗剂。该治疗剂包含表达car的t细胞作为活性成分，并且还可以包含合适的赋形剂。赋形剂的实例包括本领域技术人员已知的药学上可接受的赋形剂。

本发明证明，cd47-car-t细胞对cd47高表达的癌细胞系的有高活性。本发明的cd47-car-t细胞有效地杀伤卵巢癌、胰腺癌和其他癌细胞，并产生与cd47抗原表达相关的高水平细胞因子。本发明证明，与两个对照(1xpbs和cd24-car-t细胞)相比，肿瘤内注射cd47-car-t细胞显著降低胰腺bxpc3异种移植的肿瘤生长；同时，与对照肿瘤相比，cd47-car-t细胞处理的肿瘤中有增加的人cd3ζihc染色。

本发明人设计了结合人cd47抗原的人源化cd47scfv，通过人肿瘤样品的elisa和ihc染色验证。在小鼠cdr的侧翼，人源化cd47scfv用人框架序列代替小鼠框架序列，因此降低了针对小鼠scfv的潜在免疫应答。人源化cd47抗体在小鼠cdr内具有一些突变，其增加了与cd47抗原的结合。

本发明的人源化cd47-car-t细胞有效杀伤cd47高表达的癌细胞系，不杀伤cd47阴性癌细胞且不产生细胞因子。因此，小鼠cd47-car-t细胞和人源化cd47-car-t细胞为实体瘤和血液癌症提供了一种细胞疗法。

本申请显示，cd47-car-t细胞对cd47高表达的cd47阳性癌细胞有高度特异性，而在cd47低表达的靶细胞，例如hela-cd19细胞中缺乏car-t活性。因此，存在cd47-car-t细胞仅影响cd47高表达细胞的治疗窗。此外，cd47-car-t细胞不会降低小鼠体重，表明car-t细胞没有毒性作用。可以应用调控car-t细胞的不同方法，如开启-关闭机制；双特异性car；涉及细胞因子释放综合征的细胞因子的调节，以及其他方法，以增加安全性并克服car-t细胞治疗的主要挑战。

cd47-car-t细胞的瘤内注射增加了这些细胞的安全性。大多数cd47-car-t细胞定位于肿瘤内而不是血液中。因此，cd47-car-t细胞的区域性肿瘤内递送是临床上可行的方法。相比将car-t直接递送至肿瘤，cd47-car-t细胞的区域性递送可能有利于提高安全性，对微环境和其他机制的抑制作用更小。

cd47也在癌症干细胞中高度表达，癌症干细胞是最具攻击性的肿瘤细胞类型。因此，cd47-car-t细胞可用于靶向癌症干细胞。

本发明证明了用cd47-car-t细胞靶向癌细胞的方法。证明了cd47-car-t细胞在体外和体内对抗癌细胞的高效率，并提供了抗癌细胞疗法。

靶向cd47和另一肿瘤抗原(egfr、her-2、vegfr等)的双特异性car-t细胞可用于免疫疗法。双特异性car-t细胞构建体含有针对cd47的第一scfv和针对第二肿瘤抗原的第二scfv。与具有单一抗体的car-t细胞相比，具有双特异性抗体的car-t细胞可更有效和特异性地靶向过表达两种肿瘤抗原的癌细胞。当一种肿瘤抗原下调时，双特异性car-t细胞可能是有利的，因为双特异性car-t细胞可以靶向另一肿瘤抗原。egfrscfv在本申请的实施例14中说明。sadelain等报道了her-2scfv(j.immunol.2009,183:5563-5574)，chinnasamy等报道了vegfrscfv(j.clin.invest.2010,120(11):3953–3968)；其全部内容通过引用并入本文。

cd47-car-t与靶向其他肿瘤抗原或肿瘤微环境抗原(vegfr-1-3)的car-t的组合(双car-t)，可用于增强cd47-car单药治疗的活性。

cd47car-t可与不同的化学疗法联合使用：检查点抑制剂；靶向治疗，小分子抑制剂和抗体。

标签(flag标签或其他标签)偶联的cd47scfv可用于car构建体。

对于car内部相同的cd47-scfv，可以使用第三代car-t或其他共激活信号传导结构域。

cd47-car-t细胞可用于激活吞噬作用并阻断“不要吃我”的信号。

以下实施例进一步说明本发明。下述实施例只是为了说明本发明，而不应被解释为是限制性的。

实施例

材料和方法

实施例1细胞系

hela细胞购自atcc(马纳萨斯，va)，并在含有10％fbs和1％青霉素/链霉素的dmem中培养。将稳定表达cd19的hela-cd19细胞维持在含有10％fbs、嘌呤霉素和青霉素/链霉素的dmem中，如berahovich等，front.biosci.(landmark编辑)2017,22,1644–1654中所述。使用ficoll-paque溶液(ge医疗保健，芝加哥，il)，根据irb批准的方案，从斯坦福医院血液中心(斯坦福，ca，usa)获得的全血中分离人外周血单核细胞(pbmc)。将来自alstem(里士满，ca，usa)的hek293ft细胞在含有10％fbs和青霉素/链霉素的dmem中培养。从atcc获得skov-3细胞系，并在添加10％fbs和青霉素/链霉素的rpmi中培养。从lonza公司获得正常人角质形成细胞，并根据制造商的方案在角质形成细胞培养基(隆萨，阿纳海姆，ca)中培养。从atcc获得bxpc3、panc-1、a1847、a375、a549和hep-3b，并在含有10％fbs和青霉素/链霉素的dmem中培养。细胞系在我们的实验室中使用细胞特异性表面标志物进行流式细胞术验证，或通过atcc验证。

实施例2car构建物

使用nhei和xhoi在cd8-α信号肽和cd8-α铰链之间插入来自b6h12抗体的cd47scfv，其下游融合至cd28跨膜结构域、cd28共激活结构域和cd3激活结构域。该cd47-car构建体侧翼为pcd510慢病毒载体(系统生物科学，帕洛阿尔托，ca)中的xbai和ecori位点。用人源化cd47scfv和模拟对照scfv(胞内蛋白)进行相同的构建，分别称为人源化cd47和mock-car。如上所述,将来自promab生物技术(里士满，ca)的cd24scfv，cd24(克隆4f4e10)抗体用于cd24-car构建体。通过syno生物科学(中国北京)合成car，并在两个方向上测序。

实施例3car编码慢病毒的产生

如berahovich等人所述，使用293ft细胞、慢病毒包装混合物和转染剂(alstem，里士满，ca),将慢病毒car用于产生慢病毒。根据制造商的方案,使用lenti-xqrt-pcr试剂盒(takara生物,山景城,ca)和7900ht热循环仪(赛默飞世尔科技,南旧金山,ca)，通过定量rt-pcr测定病毒的滴度。慢病毒滴度以pfu/ml表示，范围为1-10×10⁸pfu/ml。

实施例4car-t细胞的产生和扩增

将pbmc以1×10⁶细胞/ml悬浮于含有10％fbs和300u/mlil-2(赛默飞世尔)的aimv-albumax培养基(赛默飞世尔)中。用相同数量的cd3/cd28免疫磁珠(赛默飞世尔)活化pbmc，并在未处理的24孔板中培养。在24和48小时，将感染复数(moi)为5的慢病毒与1μltransplus转导增强子(alstem)加入培养物中。每2-3天计数car-t细胞，向培养物中加入含有300u/mlil-2的新鲜培养基，使细胞密度保持在1×10⁶细胞/ml。

实施例5流式细胞术

为了检测car的表达，将5×10⁵细胞悬浮于100μl缓冲液(含有0.5％bsa的1×pbs)中，并在冰上与1μl人血清(jackson免疫研究，西格罗夫，pa，usa)共同孵育10分钟。随后加入1μl别藻蓝蛋白(apc)标记的抗cd3(ebioscience，圣地亚哥，ca，usa)、2μl7-氨基放线菌素d(7-aad，biolegend，圣地亚哥，ca，usa)和2μl抗-f(ab)2或其同种型对照，并将细胞在冰上孵育30分钟。用缓冲液冲洗细胞，并在facscalibur(bd生物科学，圣何塞，ca)上获得细胞。首先分析细胞对7-aad染色的光散射，然后标出(plotted)7-aad^-活门控细胞(livegatedcells)，用于cd3染色与f(ab)2染色或同种型对照染色。在一些实验中，仅进行抗f(ab)2染色。对于小鼠肿瘤研究，用1μlapc抗cd3、2μl异硫氰酸荧光素(fitc)标记的抗cd8a(ebioscience)、2μl7-aad，将100μl血液在室温下染色30分钟。用3.5mlrbc裂解液(150mmnh4cl，10mmnahco3，1mmedtaph8)裂解红细胞，然后通过离心收集白细胞，并在收获前用2ml冷缓冲液冲洗。为了表达cd47，根据制造商的方案以10μg/ml浓度使用来自biolegend的小鼠b6h12抗体。为了表达cd24，以10μg/ml使用小鼠cd24克隆4f4e10(promab生物技术，里士满，ca，usa)。以10μg/ml使用来自biolegend的同种型igg1同种型抗体。

实施例6实时细胞毒性测定(rtca)

将贴壁靶细胞以每孔1×10⁴细胞接种到96孔e-板(acea生物科学，圣地亚哥，ca，usa)中，并使用基于阻抗的实时细胞分析(rtca)icelligence系统(acea生物科学)在培养物中监测过夜。第二天，除去培养基并用含有10％fbs±1×10⁵效应细胞(car-t细胞或未转导的t细胞)的aimv-albumax培养基替换，一式三份。用rtca系统再监测细胞2天，并随时间绘制阻抗。计算细胞溶解为：(无效应细胞的靶细胞阻抗-有效应细胞的靶细胞阻抗)×100/无效应细胞的靶细胞阻抗。

实施例7细胞因子elisa测定

在u形底96孔板中，用200μl含有10％fbs的aimv-albumax培养基，将靶细胞与效应细胞(car-t细胞或未转导的t细胞)以1：1的比例(各1×10⁴个细胞)进行培养，一式三份。16小时后，将顶部的150μl培养基转移至v-底96孔板，并以300g离心5分钟以沉淀任何残留的细胞。在一些实验中，在e：t＝10：1的rtca测定后，将上清液用于细胞因子elisa测定。将上清液转移到新的96孔板中，并使用来自赛默飞世尔(南旧金山，ca)的试剂盒，根据制造商的方案，通过elisa分析人细胞因子水平(ifn-γ、il-2、il-6)。

实施例8小鼠异种移植肿瘤的生长

严格按照动物保护和使用委员会的制度(iacuc)，对6周龄雄性nsg小鼠(杰克逊实验室，巴尔港，me)进行饲养和操作。每只小鼠皮下注射100μl无菌pbs中的2×10⁶bxpc3细胞，然后肿瘤内注射car-t细胞三次：分别在第20、27和34天，给予2×10⁵细胞/小鼠、2×10⁶细胞/小鼠、2.8×10⁶细胞/小鼠的剂量，并分析异种移植肿瘤的生长。用卡尺每周两次测量肿瘤大小，并使用公式w²l/2测定肿瘤体积(mm³)，其中w是肿瘤宽度，l是肿瘤长度。切除肿瘤并在4％多聚甲醛中固定，然后包埋在石蜡中并通过免疫组织化学染色。在静脉内car-t细胞研究结束时，收集100μl血液并通过如上所述的流式细胞术用不同抗体染色。

实施例9免疫组织化学(ihc)染色

将肿瘤组织切片(4μm)在二甲苯中孵育两次，持续10分钟，然后在梯度醇中水合，并在pbs中漂洗。使用10mm柠檬酸盐缓冲液(ph6.0)在高压锅中进行抗原修复20分钟。将切片冷却，用pbs漂洗，在3％h2o2溶液中孵育10分钟，并用pbs漂洗。将组织切片在山羊血清中孵育20分钟，然后与0.2μg/ml的兔抗裂解半胱天冬酶-3(asp175，细胞信号传导技术，丹佛斯，ma,us)或兔igg(杰克逊免疫研究,西格罗夫,pa,usa)4℃孵育过夜。将切片用pbs漂洗，与生物素缀合的山羊抗兔igg孵育10分钟，用pbs漂洗，与链霉亲和素缀合的过氧化物酶孵育10分钟，并用pbs漂洗。最后，将切片在dab基质溶液中孵育2-5分钟，浸入自来水中，用苏木精复染，用水冲洗，并在梯度醇和二甲苯中脱水。用甘油安装盖玻片。使用imagesplus2.0软件，在dmb5-2231pl显微镜(motic，厦门，中国)上获得图像。

实施例10cd47抗体的人源化

根据almagro等人(front.biosci.,2008,13,1619–1633)描述的方法，使用igblast(ncbi)软件将小鼠b6h12cdr人源化。具有最高同源性的人克隆的人框架用于人源化配对。将小鼠cdr插入这些克隆中，产生四种不同的变体,用elisa进行测试。

实施例11人源化的和小鼠的cd47scfv的结合分析

小鼠或人源化cd47scfv含有同g4sx3接头连接的vl和vh序列。将scfv与用于重组cd47scfv蛋白表达的pyd11载体内的人fc通过c末端框内融合。将等量的包含表达scfv蛋白的哺乳动物细胞的上清液用于结合测定。通过western印迹，利用抗人fc抗体检查所有scfv的表达。人cd47蛋白的人胞外结构域(19-41个氨基酸)(genbankid：nm_001777.3)与小鼠fc融合，并用于cd47scfv的elisa测定。450nm处的od读数用于检测结合。基于小鼠序列，为人源化vh和vl序列产生计算机模拟模型。

结果

统计分析

用prism软件(graphpad，圣地亚哥，ca)分析数据并绘图。通过非配对学生t检验进行两组之间的比较，并且通过单因素方差分析和tukey's事后检验进行三组之间的比较，除非另有说明。p值<0.05时,差异被认为是显著的。

实施例12小鼠cd47scfvcar构建体的序列

实验中使用的cd47car构建体的所有区段的氨基酸序列如下所示。每个区段可以用具有至少95％同一性的氨基酸序列替换。

<人cd8信号肽>seqidno：2

malpvtalllplalllhaarp

<nhei位点>如果需要，该位点可任选地用于切除scfv，并且可以被其他限制酶位点替换。

as

小鼠抗cd47scfv(vh-接头-vl)

<vh>seqidno:3

evqlvesggdlvkpggslklscaasgftfsgygmswvrqtpdkrlewvatitsggtytyypdsvkgrftisrdnakntlylqidslksedtaiyfcarslagnamdywgqgtsvtvss

<接头>seqidno:4

ggggsggggsggggs

<vl>seqidno:5

divmtqspatlsvtpgdrvslscrasqtisdylhwyqqkshesprllikfasqsisgipsrfsgsgsgsdftlsinsvepedvgvyycqnghgfprtfgggtkleik

<xhoi位点>如果需要，该位点可任选地用于切除scfv，并且可以被其他限制酶位点替换。

le

<cd8铰链>seqidno：6

kptttpaprpptpaptiasqplslrpeasrpaaggavhtrgldfasdkp

<跨膜结构域tm28>seqidno：7

fwvlvvvggvlacysllvtvafiifwv

<共刺激结构域cd28>seqidno：8

rskrsrllhsdymnmtprrpgptrkhyqpyapprdfaayrs

<激活域cd3-ζ>seqidno：9

rvkfsrsadapayqqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr

小鼠cd47scfvcar序列如seqidno：10所示:

malpvtalllplalllhaarpasevqlvesggdlvkpggslklscaasgftfsgygmswvrqtpdkrlewvatitsggtytyypdsvkgrftisrdnakntlylqidslksedtaiyfcarslagnamdywgqgtsvtvssggggsggggsggggsdivmtqspatlsvtpgdrvslscrasqtisdylhwyqqkshesprllikfasqsisgipsrfsgsgsgsdftlsinsvepedvgvyycqnghgfprtfgggtkleiklekptttpaprpptpaptiasqplslrpeasrpaaggavhtrgldfasdkpfwvlvvvggvlacysllvtvafiifwvrskrsrllhsdymnmtprrpgptrkhyqpyapprdfaayrsrvkfsrsadapayqqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkpqrrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr

可以以相同的方式构建“模拟”car，其包含对胞内蛋白有特异性的scfv，因此不与完整细胞反应-。

实施例13人源化cd47scfvcar构建体的序列

根据almagro等人(front.biosci.2008,13,1619–1633)和gilliland等人(methodsmol.biol.,2012,841,321–349)描述的方法，用生物信息学方法，使得小鼠cd47抗体b6h12的vh和vl人源化。

在我们的实验中，使用的人源化cd47scfvcar构建体的所有区段的氨基酸序列与实施例12中所示的相同，除了小鼠抗cd47scfv的序列被如下所示的人源化抗cd47序列替换。每个区段可以用具有至少95％序列同一性的氨基酸序列替换。

人源化抗cd47scfv(vh-接头-vl)

<vh>seqidno:11

evqlvesggglvqpggslrlscaasgftfsgygmswvrqapgkglewvatitsggtytyypdsvkgrftisrdnaknslylqmnslraedtavyycarslagnamdywgqgtlvtvss

<接头>seqidno:4

ggggsggggsggggs

<vl>seqidno:12

eivltqspatlslspgeratlscrasqsisdylhwyqqkpgqaprlliyfasqratgiparfsgsgsgtdftltisslepedfavyycqqghgfprtfgggtkveik

人源化的cd47scfv如seqidno:13所示:

evqlvesggglvqpggslrlscaasgftfsgygmswvrqapgkglewvatitsggtytyypdsvkgrftisrdnaknslylqmnslraedtavyycarslagnamdywgqgtlvtvssggggsggggsggggseivltqspatlslspgeratlscrasqsisdylhwyqqkpgqaprlliyfasqratgiparfsgsgsgtdftltisslepedfavyycqqghgfprtfgggtkveik

人源化的cd47scfvcar如seqidno：14所示:

malpvtalllplalllhaarpasevqlvesggglvqpggslrlscaasgftfsgygmswvrqapgkglewvatitsggtytyypdsvkgrftisrdnaknslylqmnslraedtavyycarslagnamdywgqgtlvtvssggggsggggsggggseivltqspatlslspgeratlscrasqsisdylhwyqqkpgqaprlliyfasqratgiparfsgsgsgtdftltisslepedfavyycqqghgfprtfgggtkveiklekptttpaprpptpaptiasqplslrpeasrpaaggavhtrgldfasdkpfwvlvvvggvlacysllvtvafiifwvrskrsrllhsdymnmtprrpgptrkhyqpyapprdfaayrsrvkfsrsadapayqqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkpqrrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr

实施例14双特异性egfr-flag-cd47-cd28-cd3car构建体

在我们的实验中，使用的egfr-flag-cd47scfvcar构建体的每个区段的氨基酸序列与实施例12中所示的相同，除了在小鼠抗cd47序列的n末端添加如下所示的egfrscfv、flag和接头序列。每个区段可以用具有至少95％序列同一性的氨基酸序列替换。

人抗egfrscfv(vh-接头-vl-flag-接头)

<vh>seqidno:15

evqlvqsgaevkkpgssvkvsckasggtfssyaiswvrqapgqglewmggiipifgtanyaqkfqgrvtitadeststaymelsslrsedtavyycareegpycsstscygafdiwgqgtlvtvss

<接头>seqidno:4

ggggsggggsggggs

<vl>seqidno:16

qsvltqdpavsvalgqtvkitcqgdslrsyfaswyqqkpgqaptlvmyarndrpagvpdrfsgsksgtsaslaisglqsedeadyycaawddslngylfgagtkltvl

<flag>seqidno：1，flag标签是可选的，用于检测表达。

<接头>seqidno:4

双特异性egfr-cd47scfvcar的序列如seqidno：17所示：

malpvtalllplalllhaarpasevqlvqsgaevkkpgssvkvsckasggtfssyaiswvrqapgqglewmggiipifgtanyaqkfqgrvtitadeststaymelsslrsedtavyycareegpycsstscygafdiwgqgtlvtvssggggsggggsggggsqsvltqdpavsvalgqtvkitcqgdslrsyfaswyqqkpgqaptlvmyarndrpagvpdrfsgsksgtsaslaisglqsedeadyycaawddslngylfgagtkltvldykddddkggggsggggsggggsdivmtqspatlsvtpgdrvslscrasqtisdylhwyqqkshesprllikfasqsisgipsrfsgsgsgsdftlsinsvepedvgvyycqnghgfprtfgggtkleikggggsggggsggggsevqlvesggdlvkpggslklscaasgftfsgygmswvrqtpdkrlewvatitsggtytyypdsvkgrftisrdnakntlylqidslksedtaiyfcarslagnamdywgqgtsvtvsslekptttpaprpptpaptiasqplslrpeasrpaaggavhtrgldfasdkpfwvlvvvggvlacysllvtvafiifwvrskrsrllhsdymnmtprrpgptrkhyqpyapprdfaayrsrvkfsrsadapayqqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkpqrrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr

实施例15小鼠cd47-car-t细胞杀伤cd47阳性癌细胞

cd47scfv用于产生具有cd28共刺激结构域和cdζ激活结构域的cd47-car-t细胞(第二代car-t细胞)(图2b)。在第14天，cd47-car-t细胞体外扩增>150倍，并通过f(ab)2抗体facs证实car的表达。为了检测体外杀伤活性，通过rtca实验(实时细胞毒性测定)，利用表达高水平cd47抗原的cd47阳性细胞：卵巢癌细胞、a1847和skov-3，以及表达低水平cd47的癌细胞:a549细胞和hep3b细胞，测试cd47car-t细胞。cd47-car-t细胞有效杀伤高表达的癌细胞系如a1847、skov-3，且与t细胞或mock-car-t细胞相比，car-t细胞杀伤更少的a549、hep3b以及低水平cd47的细胞。癌细胞的细胞毒性作用显著高于t细胞和mock-car-t细胞，p<0.0001(图3a)。这证明了cd47-car-t细胞的取决于cd47抗原表达的cd47依赖性活性。

与cd47低表达的a549和hep3b细胞相比，在cd47高度阳性的skov3细胞中，cd47-car-t细胞产生的针对癌细胞的il-2细胞因子显著更高(图3b)。因此，基于癌细胞表面的cd47表达，cd-47-car-t细胞以cd47依赖性方式杀伤和分泌il-2细胞因子，这与细胞毒性数据一致。

实施例16cd47-car-t细胞显著减少bxpc3胰腺癌异种移植肿瘤生长

为了检测cd47-car-t细胞的体内功效，我们使用bxpc3胰腺癌细胞。比较了cd47-car-t细胞与mockcar-t对照细胞和cd24-car-t细胞的细胞毒性。图4a-4g显示，cd47-car-t细胞显著抑制bxpc3胰腺癌异种移植肿瘤的生长。基于与cd47相比具有显著更低的cd24表达的bxpc3细胞，将具有cd24-carscfv的cd24-car-t细胞用作非cd47对照car-t细胞(图4a)。与mock对照car-t细胞和cd24-car-t细胞相比，cd47-car-t细胞表现出对bxpc3细胞的高细胞毒性(图4b)。

此外，与mock和cd24-car-t细胞相比，cd47-car-t细胞表达显著更高水平的细胞因子：ifn-γ、il-2(图4c)；并且，与mock对照和cd24-car-t细胞相比，表达高水平的针对靶bxpc3细胞的il-6(图4c)。将bxpc3癌细胞皮下注射到nsg小鼠中,以产生构建异种移植肿瘤(图4d)。随后，在第20、27和34天，肿瘤内施用三种注射剂，cd47-car-t细胞、对照1×pbs和cd24-car-t细胞。与对照相比，cd47-car-t细胞显著抑制bxpc3异种移植肿瘤的生长，p<0.05(图4d)。cd47-car-t细胞不影响小鼠体重(图4e)。来自cd47-car-t细胞处理组的肿瘤大小(图4f)和重量(图4g)显著低于(p<0.05)对照1×pbs和cd24-car-t细胞组。

实施例17人源化cd47scfv有效结合cd47抗原并检测肿瘤样品中的cd47

图5a中显示了对cd47抗原具有高亲和力的人源化形式的cd47scfv。人源化vh和小鼠b6h12vh具有相同的cdr1,2,3区域(cdr区域以斜体和下划线表示)。人源化vh和小鼠b6h12vh具有相似的人框架区域，在较大字体下划线的框架区域中存在差异。(图5a)

至于vl，与小鼠b6h12相比，人源化形式的cd47抗体的vl在cdr2中有三个氨基酸变化，且cdr3区域中有一个氨基酸变化(cdr全部加下划线并且以斜体显示，cdr中的变化以更大的字体和粗体显示；cdr3区对于抗原结合是重要的)(图5a)。

通过elisa测试了人源化cd47scfv的结合(图5b)。其具有比小鼠cd47scfv显著更高的结合，并且具有比阴性对照pdl-1更高的结合(图5b)。对于cd47抗原的检测，人源化cd47scfv在淋巴瘤样品中可以更好地检测，在其他肿瘤样品(卵巢癌、胃癌(未显示))中类似，且在正常组织例如扁桃体中更少或类似地检测(图5c)。

实施例18人源化cd47-car-t细胞以cd47依赖性方式有效杀伤癌细胞

针对cd47高表达卵巢癌细胞系：skov-3、a1847和胰腺癌细胞系bxpc3，以及低表达的hela-cd19癌细胞系，检测了人源化cd47-cart细胞(图6a)。人源化cd47-car-t细胞有效杀伤cd47阳性癌细胞，对cd47表达极低的hela-cd19癌细胞无杀伤活性，而阳性对照cd19-car-t细胞有效杀伤hela-cd19细胞(图6a，右下图)。与cd47阴性细胞和对照mockcar-t细胞相比，cd47-car-t细胞对cd47阳性细胞的细胞毒性显著增加(p<0.05)(图6b)。与mock-car-t细胞相比，在skov-3-cd47阳性细胞系中，cd47-car-t细胞分泌的il-2细胞因子水平也显著增加(p<0.05)(图6c)，但在cd47阴性的hela-cd19细胞中不存在(图6d)。相反，与mock-car-t细胞相比，在hela-cd19阳性细胞中，对照cd19-car-t细胞产生的il-2水平显著增加(p<0.05)(图6d)。因此，人源化cd47-car-t细胞以cd47依赖性方式有效且特异性地杀伤癌细胞系并产生细胞因子。

实施例19双特异性egfr-cd47car-t细胞杀伤癌细胞

通过使用g4sx3接头将egfr(c10)人抗体scfv-flag与cd47scfv连接，以产生双特异性car。(参见实施例14)。

双特异性egfr-cd47car-t细胞杀伤egfr阴性mcf-7细胞，表现出cd47特异性活性(图7)。此外，egfr-cd47car-t细胞有效杀伤egfr阳性和cd47阳性的bxpc3胰腺癌细胞(图8a)和skov卵巢癌细胞(图8b)。这些数据证明了双特异性egfr-cd47car的应用。

应该理解的是，前面描述了本发明的优选实施例，并且可以在其中进行修改而不偏离如权利要求书中所阐述的本发明的范围。

序列表

<110>普曼生物技术有限公司

湖南远泰生物技术有限公司

<120>cd47-car-t细胞

<130>p2018-1564

<150>us62/458,773

<151>2017-02-14

<150>us62/518,767

<151>2017-06-13

<150>us62/546,790

<151>2017-08-17

<160>17

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>8

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

asptyrlysaspaspaspasplys

15

<210>2

<211>21

<212>prt

<213>智人(homosapiens)

<400>2

metalaleuprovalthralaleuleuleuproleualaleuleuleu

151015

hisalaalaargpro

20

<210>3

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<212>prt

<213>小鼠(musmusculus)

<400>3

gluvalglnleuvalgluserglyglyaspleuvallysproglygly

151015

serleulysleusercysalaalaserglyphethrpheserglytyr

202530

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354045

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505560

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65707580

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859095

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100105110

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115

<210>4

<211>15

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<213>人工序列(artificialsequence)

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<211>107

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<213>小鼠(musmusculus)

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151015

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202530

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<213>智人(homosapiens)

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ilealaserglnproleuserleuargproglualaserargproala

202530

alaglyglyalavalhisthrargglyleuaspphealaserasplys

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<210>7

<211>27

<212>prt

<213>智人(homosapiens)

<400>7

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151015

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<213>智人(homosapiens)

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202530

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<213>小鼠(musmusculus)

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180185190

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245250255

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260265270

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275280285

leuargproglualaserargproalaalaglyglyalavalhisthr

290295300

argglyleuaspphealaserasplysprophetrpvalleuvalval

305310315320

valglyglyvalleualacystyrserleuleuvalthrvalalaphe

325330335

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370375380

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385390395400

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<210>11

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<210>13

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