一种磷酸钙纳米簇及其制备方法和应用与流程

本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种磷酸钙纳米簇及其制备方法和应用。

背景技术：

骨是由定向结晶的羟基磷灰石(hap)插入到网状结构的胶原纤维中，通过长时间的演化而形成的一种多级结构。自然界中的骨中，hap会逐渐沿着胶原的长轴方向生长以形成连续的胶原纤维内矿化，这种通过多级层层组装的方法得到的具有多级结构的骨可以具有强大的硬度和韧性，并用来支撑生物体的各项生化功能。

正常的骨中有30％左右的有机物，70％左右的无机物，这些有机-无机复合结构为骨骼提供了重要的生理功能。当骨中缺少hap矿物后会导致骨质疏松症，它将会成为世界上最普遍、发病率最高的疾病之一。

由于缺乏hap矿物，骨质疏松症可以导致骨机械性能降低，甚至会引起骨折等。骨的微观结构破坏是由于骨的吸收与骨的形成之间的平衡被破坏，导致骨的形成能力小于吸收能力，从而破坏松质骨的骨小梁，使皮质骨变薄，这一系列变化导致骨的抗压能力下降而易于发生骨折。

骨质疏松症可以发生在不同性别和任何年龄的人群，但是在老年男性和绝经后的女性中尤为常见。按照不同的发病原因，可以将骨质疏松症分为以下两大类型。

一是原发性骨质疏松症，原发性骨质疏松症包括老年性骨质疏松症、绝经性骨质疏松症和特发性骨质疏松症三种类型。老年性骨质疏松症主要是大于70岁的老年人罹患的症状。绝经性骨质疏松症往往发生于绝经后5～10年的妇女，这是由于绝经后的女性体内雌激素水平降低，导致骨的吸收大于骨的形成。特发性骨质疏松症大部分发生在青少年，病因目前尚不明确。

二是继发性骨质疏松症，继发性骨质疏松症主要指由于骨正常代谢或服用药物而产生的疾病。它主要分为营养性骨质疏松症，药物性骨质疏松症和内分泌性骨质疏松症。

目前临床上主要通过直接观测法、x射线法和定量ct测试法来诊断骨质疏松症。骨质疏松症的临床表现为脊柱疼痛、变形以及骨折等等。临床上用于预防和治疗骨质疏松的药物主要有维生素d、双磷酸盐、阿仑膦酸钠以及钙片等等。但是这些药物往往治标不治本，不能从根本上治愈骨质疏松症。究其原因主要是骨质疏松症是由骨中hap矿物减少而引起的，要想从根本上治疗骨质疏松症，还是要致力于提高骨中的矿物含量入手。

已有文献报道，骨的多级结构是从小粒径的无定形态开始形成的，然后这种无定形态转化为直径为3～10nm的结晶态hap，再通过层层组装而得到了具有良好机械性能的骨骼结构。因此，小尺寸的无定形态以及结晶态hap在骨的形成过程中起着至关重要的作用。

技术实现要素：

针对本领域存在的不足之处，本发明提供了一种磷酸钙纳米簇的制备方法，以水溶性钙盐和水溶性磷酸盐为原料，聚丙烯酸和聚天冬氨酸为稳定剂，可制备得到小粒径的磷酸钙纳米簇。该制备方法操作简单、原料易得、成本低廉、易于重复。得到的磷酸钙纳米簇可转化为结晶态hap，可用于制备修复骨质疏松的药物。

一种磷酸钙纳米簇的制备方法，包括：

(1)将水溶性钙盐和聚天冬氨酸溶于水中，得到溶液a，水溶性钙盐和聚天冬氨酸的质量比为1：(0.1～15)；

(2)将水溶性磷酸盐和聚丙烯酸溶于水中，得到溶液b，水溶性磷酸盐和聚丙烯酸的质量比为1：(0.1～15)；

(3)将溶液a与溶液b缓慢混合并调节ph＝7～8，得到磷酸钙纳米簇。

聚天冬氨酸用于和钙离子形成螯合物，稳定钙离子。聚丙烯酸和水溶性磷酸盐形成凝胶溶液，使最终形成的磷酸钙纳米簇具有凝胶性质。

由于水溶性钙盐和水溶性磷盐分别先被聚天冬氨酸和聚丙烯酸所稳定起来，并且是将水溶性磷盐逐滴加入到水溶性钙盐中，滴加过程中ca²⁺和含磷的酸根离子逐步释放，相互结合成磷酸钙纳米簇。由于聚天冬氨酸和聚丙烯酸的稳定作用，上述方法制备的磷酸钙纳米簇相对其它无定形磷酸钙更加稳定，并且粒径较小。

步骤(1)中，优选地，所述的水溶性钙盐中的ca和水溶性磷酸盐中的p的摩尔比为(0.5～1.5)：1。

优选地，所述的水溶性钙盐为氯化钙。氯化钙不会引入氧化性酸或有毒物质，所以不会导致杂质出现，且得到的产物也不会因有毒而无法用于制备修复骨质疏松的药物。

优选地，所述的溶液a中水溶性钙盐的浓度不大于0.1mol/l，钙离子浓度过高会在后续反应中引发沉淀。

优选地，所述的聚天冬氨酸的相对分子质量为9～11kda。

加入的聚天冬氨酸过少会引起ca²⁺沉淀，过多会导致有机物过量，影响后续实验。优选地，所述的水溶性钙盐和聚天冬氨酸的质量比为1：(1～10)。

优选地，将水溶性钙盐和聚天冬氨酸分别配成水溶液后再混合均匀得到溶液a。

步骤(2)中，所述的水溶性磷酸盐包括正磷酸盐、磷酸一氢盐或磷酸二氢盐中的一种或多种。

优选地，所述的水溶性磷酸盐为磷酸一氢盐，因为磷酸一氢盐为弱碱性，可以起到酸碱缓冲作用，且不会对纳米簇的形成产生干扰作用。

优选地，所述的溶液b中水溶性磷酸盐的浓度不大于0.1mol/l，浓度过高会引起后续的磷酸钙沉淀。

优选地，所述的聚丙烯酸的相对分子质量为10～500kda。低分子量的聚丙烯酸，如相对分子质量为1800da或5100da的聚丙烯酸，不能形成纳米簇。

加入的聚丙烯酸过少会引起后续的磷酸钙沉淀，过多会导致有机物过量，影响后续实验。优选地，所述的水溶性磷酸盐和聚丙烯酸的质量比为1：(1～10)。

所述的聚丙烯酸和聚天冬氨酸的浓度过高会导致有机物的比例增加，对终产物的有机-无机比例产生影响。

步骤(3)中，优选地，所述的将溶液a与溶液b缓慢混合为将溶液b逐滴加入到溶液a中，或将溶液a逐滴加入到溶液b中。

优选地，溶液a与溶液b混合后调节ph为中性，可用盐酸或氢氧化钠等常用的酸或碱来调节。

本发明又提供了一种所述的磷酸钙纳米簇的制备方法制备得到的磷酸钙纳米簇。

得到的磷酸钙纳米簇为透明的、无定形态的凝胶状物质，具有良好的流动性、注射性、生物相容性和成骨诱导性等，相对其它无定形磷酸钙更加稳定，并且粒径小，约为1nm。

得到的磷酸钙纳米簇在室温放置七天以后，可以转变为结晶态的羟基磷灰石。正是由于其前期的稳定性以及后期的转变性，才使得该磷酸钙纳米簇可以用于胶原矿化、细胞分化等应用，用于制备修复骨质疏松的药物。

通过所述的磷酸钙纳米簇修复的骨质疏松骨，与天然骨骼的结构相同，且取向与修复前的骨骼胶原一致，能与基底骨骼紧密结合，恢复骨质疏松前的力学性能。

本发明还提供了一种所述的磷酸钙纳米簇在制备修复骨质疏松的药物中的应用。

本发明与现有技术相比，主要优点包括：

(1)所述的制备方法操作简单，原料易得，无污染，易于重复和工业化应用。

(2)制备得到的磷酸钙纳米簇粒径小，约为1nm，具有良好的流动性、注射性、生物相容性和成骨诱导性等，可转化为结晶态hap，可用于制备修复骨质疏松的药物。

附图说明

图1为实施例1的新合成的磷酸钙纳米簇的外观照片、电镜照片，以及室温放置不同天数后的磷酸钙纳米簇的外观照片和xrd图，图中标尺：a：1cm，b：5nm，c：1cm；

图2为应用例1的磷酸钙纳米簇促进细胞分化的照片，图中标尺：200μm；

图3为应用例2的磷酸钙纳米簇促进胶原矿化的照片，图中标尺：a：200nm，b～d：600nm；

图4为应用例3的磷酸钙纳米簇促进骨质疏松骨修复的照片，图中标尺：b～e：100nm，f～i：300nm，j～m：200nm；

图5为对比例1和对比例2的磷酸钙沉淀的外观照片，图中标尺：1cm。

具体实施方式

下面结合附图及具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。

本发明使用的磷酸钙纳米簇为现制现用，多余的磷酸钙纳米簇于4℃保存。

实施例1

(1)分别配制0.1mol/l的氯化钙溶液、0.1mol/l的磷酸氢二钠溶液、0.3g/ml的聚天冬氨酸溶液以及0.3g/ml的聚丙烯酸溶液；

所用的聚丙烯酸的相对分子质量为450kda，聚天冬氨酸的相对分子质量为9～11kda。

(2)取2ml氯化钙溶液与0.2ml聚天冬氨酸溶液混合均匀，作为溶液a。

(3)取2ml磷酸氢二钠溶液与0.4ml聚丙烯酸溶液混合均匀，作为溶液b。

(4)将溶液b逐滴缓慢加入到溶液a中形成混合溶液，并用氢氧化钠溶液将混合溶液的ph调节至中性，得到磷酸钙纳米簇。

如图1a所示，新合成的磷酸钙纳米簇为透明凝胶，具有流动性，可以用注射器注射，且有一定的粘性。

如图1b所示，新合成的磷酸钙纳米簇为无定形态，粒径约为1纳米。

图1c为室温放置7天以后的磷酸钙纳米簇，可以看到新合成的磷酸钙纳米簇在7天后变成固态结构，具有良好的可塑性，可以塑造成各种形状。

图1d为新合成的磷酸钙纳米簇在室温放置0、1、3、5、7天后的x射线衍射图，结果显示，无定形的新合成的磷酸钙纳米簇在7天后完全转变为结晶态的羟基磷灰石。

应用例1磷酸钙纳米簇对骨髓基质干细胞的成骨分化情况

(1)将50μg实施例1的磷酸钙纳米簇铺到24孔板底部作为实验组，空白的24孔板作为对照组。将实验组和对照组分别在紫外灯照射杀菌之后，加入成骨分化诱导液，成骨分化诱导液的成分为包含10^-8m地塞米松、50μg/ml抗坏血酸、10mmβ-甘油磷酸和10％小牛血清的培养基。

(2)以10⁴个细胞/孔的密度将小鼠骨髓基质干细胞种于24孔板中，培养板放置于37℃包含5％二氧化碳的加湿空气中培养，培养基每隔一天换一次。培养一星期以后，观察细胞的生长和分化情况，结果如图2所示。

图2a为对照组培养7天以后的细胞图，图2b为实验组培养7天以后的细胞图。可以看出，实验组的细胞数明显多于对照组的细胞数，表明实施例1的磷酸钙纳米簇可以促进小鼠骨髓基质干细胞的分化。

应用例2磷酸钙纳米簇的胶原矿化效果

磷酸钙纳米簇还可以用于胶原矿化。由于磷酸钙纳米簇的粒径很小，它可以进入胶原内部，逐步促进胶原纤维的矿化。具体实验过程包括：取实施例1的磷酸钙纳米簇配置成溶液，将组装好胶原的镍网置于溶液中，放于37℃培养箱中培养，分别观察培养0、1、3、7天后的胶原矿化情况。

观察步骤包括：取出镍网，用去离子水冲洗数次，并在室温干燥之后，用透射电子显微镜观察胶原矿化情况，结果如图3所示。

图3a为第0天未被矿化的胶原，图3b为矿化1天的胶原，图3c为矿化3天的胶原，图3d为矿化7天的胶原。可以看出，随着时间的增加，胶原的矿化情况会逐步增加，7天以后可以达到完全矿化。

应用例3磷酸钙纳米簇对骨质疏松骨的修复情况

如图4a所示，准备8周大的骨质疏松小鼠数只，然后将30μl实施例1的磷酸钙纳米簇注射入小鼠的胫骨平台。空白的小鼠作为对照组。将磷酸钙纳米簇注射入小鼠胫骨平台以后，将小鼠放回细胞房无菌培养，保持小鼠正常饮食。实验过程中，小鼠健康状况良好。分别在实验进行4、8、12周后将小鼠猝死取出胫骨，并用二维和三维显微ct和茜素红苏木精染色，对修复骨进行表征，观察骨的修复情况。

0周、4周、8周和12周时，修复骨的二维和三维的骨密度分析结果如图4b～4i所示。如图4b、4f所示，0周时，骨密度和骨小梁量很少；如图4c、4g所示，4周时开始有少量骨密度和骨小梁的增加；如图4d、4h所示，8周时骨密度和骨小梁有明显增加；如图4e、4i所示，12周时的骨小梁和骨密度基本保持稳定，与8周比没有很大程度的增加或减少。

修复骨的苏木精伊红染色结果如图4j～4m所示，进一步验证了骨密度分析的结果。0周的新骨量较少，4周时已有少量新骨生成，8周和12周的新骨量有比较明显的增加，并且苏木精伊红染色结果显示各时间阶段都有大量骨髓细胞存在。

因此，磷酸钙纳米簇可以明显促进骨质疏松骨的修复，4周开始有少量的骨量增加，8周之后骨量有明显的增加并达到一个稳定值，12周以后骨量保持稳定，没有明显增加，说明8周是疏松骨修复的最长时间，8周以后骨量不会再有增加。

实施例2

(1)分别配制0.05mol/l的氯化钙溶液、0.06mol/l的磷酸二氢钾溶液、0.3g/ml的聚天冬氨酸溶液以及0.3g/ml的聚丙烯酸溶液；

所用的聚丙烯酸的相对分子质量为50kda，聚天冬氨酸的相对分子质量为9～11kda。

(2)取2ml氯化钙溶液与0.15ml聚天冬氨酸溶液混合均匀，作为溶液a。

(3)取2ml磷酸二氢钾溶液与0.3ml聚丙烯酸溶液混合均匀，作为溶液b。

(4)将溶液a逐滴缓慢加入到溶液b中形成混合溶液，并用氢氧化钠溶液将混合溶液的ph调节至中性，得到磷酸钙纳米簇。

对比例1

(1)分别配制0.1mol/l的氯化钙溶液、0.1mol/l的磷酸氢二钠溶液和0.3g/ml的聚天冬氨酸溶液，所用的聚天冬氨酸的相对分子质量为9～11kda。

(2)取2ml氯化钙溶液与0.2ml聚天冬氨酸溶液混合均匀，作为溶液a。

(3)取2ml磷酸氢二钠溶液逐滴缓慢加入到溶液a中形成混合溶液，并用氢氧化钠溶液将混合溶液的ph调节至中性，得到磷酸钙沉淀，如图5a所示。

对比例2

与实施例1的区别仅在于步骤(4)中溶液a与溶液b直接快速混合，得到磷酸钙沉淀，如图5b所示。

此外应理解，在阅读了本发明的上述描述内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。