基于干细胞的色斑修复方法及应用与流程

本发明涉及医美领域，特别涉及一种基于干细胞的色斑修复方法及其在医美领域的应用。
背景技术：
：色斑是皮肤色素代谢病变的结果，是人体色素(尤其是黑色素)在皮肤表皮中的非正常沉积造成，形成原因主要与紫外线照射、自由基损伤、内分泌紊乱等因素紧密相关，也与化妆品使用不当及破坏皮肤表皮的美白有关，常见类型主要有：雀斑、黑斑、黄褐斑、妊娠色斑、老年斑等。色斑是一种皮肤代谢障碍疾病，不仅仅关乎美丑，更是皮肤代谢活力下降的表征，是机体健康需要调整的信号。祛除色斑的方法主要有物理法与化学法两大类，包括：激光灼伤、液氮冷冻、机械波破碎、物理削磨、化学漂白、服用祛斑药物或保健品等，还有很多人沉迷于偏方治疗。当前这些祛斑方法，都只是解决心理层面与生理层面问题，但都没有遵循皮肤自身的生理规律解决色斑问题，没有从解决机体系统问题的角度考虑，不是从调整机体代谢状态的根本层面解决色斑问题。技术实现要素：本发明为解决现有技术不足，提供了一种基于干细胞的色斑修复方法，从机体的系统调整与局部色斑消除两方面配合，从增强机体健康角度彻底解决色斑问题。本发明的构思是：先确定患者色斑的分布特点与形成原因，然后利用多种色斑破碎方法将沉积色素打碎，再利用干细胞分化吞噬细胞加速色素排除并修复受损皮肤，辅助配合患者的代谢状况调整，从肠道菌群、血液生化、基因表达多方面进行调理着手解决色斑问题。为解决现有技术中存在的问题，本发明提供一种基于干细胞的色斑修复方法，按照先后顺序包括以下步骤：s1检测患者的身体系统状态并确定患者皮肤上色斑的分布特点，基于患者肠道菌群、血液生化和基因表达数据形成系统治疗方案；s2根据肠道菌群、血液生化和基因表达数据形成的治疗方案，利用多种理化措施打散皮肤色斑中的沉积色素；s3将干细胞和辅助调控因子一同注射到患者处理后皮肤的相应部位，利用间充质干细胞分化形成吞噬细胞快速代谢沉积色素，利用间充质细胞唤醒皮肤中原有干细胞协同修补皮肤组织结构，去除皮肤色斑。本发明充分利用干细胞的再生功能与多向分化潜能修复皮肤生理活性，从机体系统调理与局部色斑消除两方面配合解决色斑问题。步骤s1的详细步骤为：通过影像技术确定患者皮肤色斑的类型与分布特点，患者皮肤的生理活性特点，同时检测患者机体的色素合成代谢状态：包括mitf信号通路与et1/etbr信号通路的表达状况、酪氨酸酶tyr活性、酪氨酸酶相关蛋白tyrp1表达情况、多巴色素互变异构酶dct的活性，相关信号通路见图1，利用生命大数据进行分析处理，确定适宜的色斑处理方案。优选的是，步骤s1中，形成的针对患者的生理状态与色斑分布特点的治疗方案是基于生命大数据的数据的个性化医疗和精准医疗。在上述任一方案中优选的是，步骤s2中，打散皮肤色斑中的沉积色素时需要根据患者的个体特点确定沉积色素的破碎方式。在上述任一方案中优选的是，沉积色素的破碎方式优选冲击波破碎，但不局限于冲击波破碎，冲击波法对皮肤组织损伤小，破碎处理后沉积色素易于被吞噬细胞代谢去除。在上述任一方案中优选的是，步骤s3中，利用间充质干细胞分化形成吞噬细胞加速对破碎色素的降解，同时唤醒皮肤内原有干细胞修复受损皮肤，恢复正常组织结构。在上述任一方案中优选的是，使用的干细胞的来源不局限于间充质干细胞，还包括脂肪组织干细胞、脐带血干细胞、ips细胞。在上述任一方案中优选的是，将沉积色素破碎与干细胞修复高效结合，注重修复由于破碎沉积色素而造成的皮肤损伤。与现有技术相比，本发明提供的一种基于干细胞的色斑修复方法，从消除局部色素和调整皮肤色素代谢两方面着手，遵循皮肤色素代谢规律解决皮肤代谢障碍造成的色斑问题，注重色斑的破碎及破碎后吞噬消化，注重处理后皮肤组织结构的恢复，克服片面的物理或化学法在破坏沉积色素过程对皮肤造成的伤害。附图说明图1：黑色素代谢相关信号通路图；图2：实施例1色素沉积区干细胞移植前后皮肤生理结构对比；图3：实施例1干细胞移植前后色素沉积分布特征；图4：实施例2色素沉积区干细胞移植前后皮肤生理结构对比；图5：实施例2干细胞移植前后色素沉积分布特征；图6：实施例3色素沉积区干细胞移植前后皮肤生理结构对比；图7：实施例3干细胞移植前后色素沉积分布特征。具体实施方式为了更进一步了解本发明的
发明内容，下面将结合具体实施例详细阐述本发明。实施例1一种基于干细胞的色斑修复方法，在具体实施过程需要：首先对患者身体进行肠道菌群与生化指标调理，然后确定患者色斑的分布特点与形成原因，然后利用冲击波破碎方法将沉积色素打碎，再利用干细胞分化吞噬细胞加速色素排除并修复受损皮肤，辅助配合患者的代谢状况调整，从机体系统调理与局部恢复两方面着手解决皮肤色素沉积问题。第一阶段：系统检测与系统调理48岁女性一名，对祛斑者进行肠道菌群、血液生化指标检测、色素代谢相关基因表达、面部皮肤色素沉积与分布进行检测。其中，肠道菌群检测使用二代测序方法进行检测，样品为祛斑对象新鲜大便样品收集5g，具体内容参考(胡海兵等，2016)，同时采集患者外周血30ml，进行生化指标检测。通过visia皮肤检测仪确定患者皮肤色斑的类型与分布特点，患者皮肤的生理活性特点，根据visa皮肤检测仪检测的色素分布结果再利用dermascanc型皮肤扫描仪对色素沉积区进行成像以检测皮肤生理结构特征，同时检测患者机体的色素代谢相关基因表达状态：包括mitf信号通路与edn1(et1)/etbr(ednrb)信号通路的表达状况、酪氨酸酶tyr活性、酪氨酸酶相关蛋白tyrp1表达情况、多巴色素互变异构酶dct的活性。检测后令其服用河北中佳本草生物技术有限公司昶佳胃肠道调节酵素一个周期共25天，同时每天服用阿尔法亚麻酸1500mg两个月，之后用二代测序方法对其肠道菌群16srna进行检测与生物信息学分析，其优势菌群种类与丰度结果如表1所示，生化指标调控前后结果如表2所示。表1：服用胃肠道调节酵素及亚麻酸前后肠道优势菌群变化注：表中↓表示下调，↑表示上调由表1可知，经过胃肠道调节酵素与亚麻酸的调理后，该患者的肠道优势菌群发生了明显变化，其中拟杆菌属呈明显下降，有益菌如双歧杆菌丰度增加。表2：生化指标对照表生化指标调控前调控后生长激素0.81μg/l1.89μg/l促甲状腺激素1.04μm/l2.72μm/l促肾上腺皮质激素18.92ng/l28.79ng/l同型半胱氨酸23.34μmol/l10.73μmol/l血清甘油三酯5.71mmol/l2.26mmol/l高密度脂蛋白0.59mmol/l1.08mmol/l血糖9.25mmol/l6.93mmol/l血清胰岛素25.16pmol/l36.15pmol/l由表2可以看出该患者血清生化指标发生了明显变化，血脂和血糖都发生了下降，其中同型半胱氨酸属于能够破坏血管的因子，调控后同样发生了下降。选择edn1信号通路、tyr信号通路中部分基因表达值作为检查对象，详情见表4。用荧光定量pcr的方法对患者色素沉积部位皮肤组织与正常皮肤基因表达水平进行检测，采用目的基因与内参基因之间ct值之间的差异来确定目的基因的表达量，本发明中，以gapdh作为内参基因，每个rna样品的定量pcr进行三个重复以消除系统误差。具体操作如下：用highpurernaisolationkit提取总rna，采用taqmanreversetran-scriptionrengents试剂盒将总rna反转录为cdna(25μl体系)，取反转录产物cdna模板2.5μl，按照taqmangeneexpressionmastermix说明书进行定量pcr检测，引物信息如表1所示。扩增程序为：95℃10min，95℃30s，55℃30s，72℃延伸30s共40个循环，定量pcr仪为roche480ⅱ，引物信息如表1所示。表3：定量pcr检测相关基因引物序列表4：色素沉积区区与干细胞相关基因表达差异基因表达倍数变化p值edn116.872.65×10-4ednrb26.885.29×10-5tyrp112.671.92×10-4mitf23.123.23×10-4tyr24.573.65×10-5dct32.194.43×10-5gapdh0.013.34×10-4由表4中的黑色素代谢信号通路可以看出色素沉积区基因表达特征符合色素沉积的分子机制。复检结果表明，患者身体生理指标达到可以进行脂肪间充质干细胞移植所需要条件，可以进行第二阶段的治疗。第二阶段：脂肪间充质干细胞分离培养与移植优选利用冲击波法破碎色斑中的沉积色素，冲击波处理对皮肤损伤小，破碎后沉积色素易于吞噬细胞处理水解。使用瑞士ems超声波仪进行皮肤处理，把冲击波探头进行消毒处理，设定参数为2.0bar、8hz，对面部皮肤色素沉积处处理2分钟，处理次数为150次。抽取祛斑者臀部脂肪2ml，将获得脂肪用0.1mol/l磷酸盐缓冲液反复冲洗后，去除麻醉药品及血细胞，获得纯度较高的脂肪颗粒。用0.3％ⅰ型胶原酶37℃恒温摇床震荡消化1h。过滤去除未消化组织，800r/min离心10min(离心半径15cm)，以8mlα-mem培养液(含10％fbs)悬浮细胞，接种于培养瓶中，5％co2、37℃标准环境下培养。3d后首次换液，除去未贴壁细胞，随后每2～3d换液1次，当细胞接近80％融合时，及时进行传代。(3)移植前将脂肪间充质干细胞经胰蛋白酶消化(0.25％胰蛋白酶/edta，paa)10min，并离心12min，1200rpm/min，沉淀的细胞加生理盐水5ml制成干细胞悬液，子代干细胞密度约6×103个/ml。用专用微针注射器，将脂肪间充质干细胞和将桂木黄素(13.5μmol/l)，槲皮素(10μmol/l)和10ng/ml表皮生长因子与脂肪充质干细胞一同注射到皮肤的相应部位。利用间充质干细胞分化形成吞噬细胞快速代谢沉积色素，同时利用间充质细胞唤醒皮肤中原有干细胞协同修补皮肤组织结构；均匀的注射入祛斑者面部皮肤，每周注射一次，4次为一个疗程。(4)通过患者机体系统功能的调整恢复，从消除局部色素和调整皮肤色素代谢两方面着手，遵循皮肤色素代谢规律解决皮肤代谢障碍造成的色斑问题，有效解决皮肤健康问题，彻底消除皮肤色斑。移植干细胞一个月后利用dermascanc型皮肤扫描仪对原色素沉积区进行成像，祛斑者进行系统调理前面部皮素色素沉积区与干细胞移植后皮肤生理结构成像对比见图2，其干细胞移植前色素沉积区皮肤的厚度值为895μm，紧实度分值为56，干细胞移植后原色素沉积区皮肤厚度为1056μm，紧实度分值为89；干细胞移植后一个月再用visia皮肤检测仪对原色素沉积区进行成像，前后对比结果见图3，从图中可以发现由绿色标记的色素沉积区分布明显减少。实施例2一种基于干细胞的色斑修复方法，在具体实施过程需要：首先对患者身体进行肠道菌群与生化指标调理，然后确定患者色斑的分布特点与形成原因，然后利用冲击波破碎方法将沉积色素打碎，再利用干细胞分化吞噬细胞加速色素排除并修复受损皮肤，辅助配合患者的代谢状况调整，从机体系统调理与局部恢复两方面着手解决色斑问题。第一阶段：系统检测与系统调理57岁男性一名，对祛斑者进行肠道菌群、血液生化指标检测、色素代谢相关基因表达、面部皮肤色素沉积与分布进行检测。其中，肠道菌群检测使用二代测序方法进行检测，样品为祛斑对象新鲜大便样品收集5g，具体内容参考(胡海兵等，2016)，同时采集患者外周血30ml，进行生化指标检测。通过visia皮肤检测仪确定患者皮肤色斑的类型与分布特点，患者皮肤的生理活性特点，根据visa皮肤检测仪检测的色素分布结果再利用dermascanc型皮肤扫描仪对色素沉积区进行成像以检测皮肤生理结构特征，同时检测患者机体的色素代谢相关基因表达状态：包括mitf信号通路与edn1(et1)/etbr(ednrb)信号通路的表达状况、酪氨酸酶tyr活性、酪氨酸酶相关蛋白tyrp1表达情况、多巴色素互变异构酶dct的活性。检测后令其服用河北中佳本草生物技术有限公司昶佳胃肠道调节酵素一个周期共25天，同时每天服用阿尔法亚麻酸1500mg两个月，之后用二代测序方法对其肠道菌群16srna进行检测与生物信息学分析，其优势菌群种类与丰度结果如表5所示，生化指标调控前后结果如表6所示。表5：祛斑者服用胃肠道调节酵素及亚麻酸前后肠道优势菌群变化由表5可知，经过胃肠道调节酵素与亚麻酸的调理后，该患者的肠道优势菌群发生了明显变化，其中拟杆菌属呈明显下降，有益菌如双歧杆菌丰度增加。表6：祛斑者生化指标对照表由表6可以看出该患者血清生化指标发生了明显变化，血脂和血糖都发生了下降，其中同型半胱氨酸属于能够破坏血管的因子，调控后同样发生了下降，血清生长激素水平明显提高。选择edn1信号通路、tyr信号通路中部分基因表达值作为检查对象，详情见表8。用荧光定量pcr的方法对患者色素沉积部位皮肤组织与正常皮肤基因表达水平进行检测，采用目的基因与内参基因之间ct值之间的差异来确定目的基因的表达量，本发明中，以gapdh作为内参基因，每个rna样品的定量pcr进行三个重复以消除系统误差。具体操作如下：用highpurernaisolationkit提取总rna，采用taqmanreversetran-scriptionrengents试剂盒将总rna反转录为cdna(25μl体系)，取反转录产物cdna模板2.5μl，按照taqmangeneexpressionmastermix说明书进行定量pcr检测，引物信息如表1所示。扩增程序为：95℃10min，95℃30s，55℃30s，72℃延伸30s共40个循环，定量pcr仪为roche480ⅱ，引物信息如表7所示。表7：定量pcr检测相关基因引物序列表8：色素沉积区区与干细胞相关基因表达差异由表8中的黑色素代谢信号通路可以看出色素沉积区基因表达特征符合色素沉积的分子机制。复检结果表明，患者身体生理指标达到可以进行骨髓间充质干细胞移植所需要条件，可以进行第二阶段的治疗。第二阶段：间充质干细胞的获取、培养与移植(1)优选利用冲击波法破碎色斑中的沉积色素，冲击波处理对皮肤损伤小破碎后沉积色素易于吞噬细胞处理水解。使用瑞士ems超声波仪进行皮肤处理，把冲击波探头进行消毒处理，设定参数为2.0bar、8hz，对面部皮肤色素沉积区处理2分钟，处理次数为150次。(2)人骨髓间充质干细胞的分离：在无菌条件下，采集祛斑者本人骨髓液2ml，等体积pbs缓冲液混匀，以1：1的比例轻轻滴加到淋巴细胞分离液，先在2200r/mint条件下进行离心，然后吸取靠近表面的薄膜层，再次滴加pbs进行混匀并以1200r/min进行离心，洗涤，计数，并接种于100ml的培养瓶中。待培养的细胞铺满瓶底约80％时，用胰蛋白酶消化分离，按1：3传代培养。(3)移植前将脂肪间充质干细胞经胰蛋白酶消化(0.25％胰蛋白酶/edta，paa)10min，并离心12min，1200rpm/min，沉淀的细胞加生理盐水5ml制成干细胞悬液，子代干细胞密度约6×103个/ml。用专用微针注射器，将脂肪间充质干细胞和将桂木黄素(13.5μmol/l)，槲皮素(10μmol/l)和10ng/ml表皮生长因子与脂肪充质干细胞一同注射到皮肤的相应部位。利用间充质干细胞分化形成吞噬细胞快速代谢沉积色素，同时利用间充质细胞唤醒皮肤中原有干细胞协同修补皮肤组织结构；均匀的注射入祛斑者面部皮肤，每周注射一次，4次为一个疗程。(4)通过患者机体系统功能的调整恢复，从消除局部色素和调整皮肤色素代谢两方面着手，遵循皮肤色素代谢规律解决皮肤代谢障碍造成的色斑问题，有效解决皮肤健康问题，彻底消除皮肤色斑。移植干细胞一个月后利用dermascanc型皮肤扫描仪对原色素沉积区进行成像，祛斑者进行系统调理前面部皮素色素沉积区与干细胞移植后皮肤生理结构成像对比见图4，其干细胞移植前色素沉积区皮肤的厚度值为825μm，紧实度分值为60，干细胞移植后原色素沉积区皮肤厚度为1132μm，紧实度分值为83；干细胞移植后一个月再用visia皮肤检测仪对原色素沉积区进行成像，前后对比结果见图5，从图中可以发现由绿色标记的色素沉积区分布明显减少。实施例340岁女性一名，对祛斑者进行肠道菌群、血液生化指标检测、色素代谢相关基因表达、面部皮肤色素沉积与分布进行检测。其中，肠道菌群检测使用二代测序方法进行检测，样品为祛斑对象新鲜大便样品收集5g，具体内容参考(胡海兵等，2016)，同时采集患者外周血30ml，进行生化指标检测。通过visia皮肤检测仪确定患者皮肤色斑的类型与分布特点，患者皮肤的生理活性特点，根据visa皮肤检测仪检测的色素分布结果再利用dermascanc型皮肤扫描仪对色素沉积区进行成像以检测皮肤生理结构特征，同时检测患者机体的色素代谢相关基因表达状态：包括mitf信号通路与edn1(et1)/etbr(ednrb)信号通路的表达状况、酪氨酸酶tyr活性、酪氨酸酶相关蛋白tyrp1表达情况、多巴色素互变异构酶dct的活性。检测后令其服用河北中佳本草生物技术有限公司昶佳胃肠道调节酵素一个周期共25天，同时每天服用阿尔法亚麻酸1500mg两个月，之后用二代测序方法对其肠道菌群16srna进行检测与生物信息学分析，其优势菌群种类与丰度结果如表9所示，生化指标调控前后结果如表10所示。复检结果表明，患者身体生理指标达到可以进行干细胞移植所需要条件，可以进行第二阶段的治疗。表9：祛斑患者服用胃肠道调节酵素及亚麻酸前后肠道优势菌群变化由表9可知，经过胃肠道调节酵素与亚麻酸的调理后，该患者的肠道优势菌群发生了明显变化，其中拟杆菌属呈明显下降，有益菌如双歧杆菌丰度增加。表10：祛斑患者生化指标对照表由表10可以看出该患者血清生化指标发生了明显变化，血脂和血糖都发生了下降，其中同型半胱氨酸属于能够破坏血管的因子，调控后同样发生了下降，血清生长激素水平明显提高。表11：定量pcr检测相关基因引物序列表12：色素沉积区区与干细胞相关基因表达差异基因表达倍数变化p值et117.872.41×10-2etbr26.791.23×10-4tyrp122.542.59×10-4mitf12.124.23×10-4tyr23.031.65×10-3dct15.083.43×10-2gapdh0.023.73×10-4由表12中的黑色素代谢信号通路可以看出色素沉积区基因表达特征符合色素沉积的分子机制。复检结果表明，患者身体生理指标达到可以进行干细胞移植所需要条件，可以进行第二阶段的治疗。第二阶段：毛囊干细胞的获取、培养与移植(1)优选利用冲击波法破碎色斑中的沉积色素，冲击波处理对皮肤损伤小破碎后沉积色素易于吞噬细胞处理水解。使用瑞士ems超声波仪进行皮肤处理，把冲击波探头进行消毒处理，设定参数为2.0bar、8hz，对面部皮肤色素沉积区处理2分钟，处理次数为180次。(2)用皮肤专用钻孔器取下祛斑者头部皮肤组织。首先用复方氯化钠对头部皮肤组织润洗，去除多余脂肪，再用显微剪分离毛囊峡部和毛球上部之间的隆突区组织，其深度起始位距表皮1.00mm，延伸深度1.80mm，将分离的少量隆突区组织行免疫荧光染色hfscs表面标记物鉴定后，将大批量隆突区组织用10ng/ml中性蛋白酶37℃下消化40min后接种。将组织直接接种于matrigel包被的培养板中，在37℃、5％的co2的孵箱中培养。细胞迁出后融合度达70％～80％时，再用0.25％胰酶37℃条件下振荡消化10min，收集细胞传代培养。每3天换1次液，观察细胞形态变化与增殖情况，优化培养条件，完成毛囊干细胞的扩增。(3)移植前将毛囊干细胞经胰蛋白酶消化(0.25％胰蛋白酶/edta，paa)10min，并离心12min，1200rpm/min，沉淀的细胞加生理盐水5ml制成干细胞悬液，子代干细胞密度约6×103个/ml。用专用微针注射器，将毛囊干细胞和将桂木黄素(13.5μmol/l)，槲皮素(10μmol/l)和10ng/ml表皮生长因子与干细胞一同注射到皮肤的相应部位。利用干细胞分化形成吞噬细胞快速代谢沉积色素，同时利用细胞唤醒皮肤中原有干细胞协同修补皮肤组织结构；均匀的注射入祛斑者面部皮肤，每周注射一次，4次为一个疗程。(4)通过患者机体系统功能的调整恢复，从消除局部色素和调整皮肤色素代谢两方面着手，遵循皮肤色素代谢规律解决皮肤代谢障碍造成的色斑问题，有效解决皮肤健康问题，彻底消除皮肤色斑。移植干细胞一个月后利用dermascanc型皮肤扫描仪对原色素沉积区进行成像，祛斑者进行系统调理前面部皮素色素沉积区与干细胞移植后皮肤生理结构成像对比见图6，其干细胞移植前色素沉积区皮肤的厚度值为879μm，紧实度分值为68，干细胞移植后原色素沉积区皮肤厚度为1193μm，紧实度分值为89；干细胞移植后一个月再用visia皮肤检测仪对原色素沉积区进行成像，前后对比结果见图7，从图中可以发现由绿色标记的色素沉积区分布明显减少。本领域技术人员不难理解，本发明的基于干细胞的色斑修复方法及应用包括上述本发明说明书的
发明内容和具体实施方式部分以及附图所示出的各部分的任意组合，限于篇幅并为使说明书简明而没有将这些组合构成的各方案一一描述。凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。当前第1页12