黄芪黄酮提取物在制备喉癌化疗药物中的应用的制作方法

本发明涉及黄芪黄酮提取物的新用途，特别涉及黄芪黄酮提取物在制备喉癌化疗药物中的应用。

背景技术：

喉癌是仅次于肺癌的第二大呼吸道高发肿瘤，在中国北方地区高发，喉癌化疗i类推荐药物为顺铂，然而顺铂剂量依赖性的肾毒性作用极大限制了其临床应用。顺铂主要通过氧化应激、线粒体损伤及炎症反应等作用损害近端肾小管上皮细胞而引起急性或慢性肾功能衰竭。

黄芪是常用中药材之一，始载于《神农本草经》，具有补气固表，利尿，托毒排脓，敛疮生肌等功效。文献报道(宋岩等，现代肿瘤医学，2013，21(7):1419-1421)，黄芪可调控喉癌细胞周期，形成g2/m期阻滞，通过抑制增殖和促进凋亡发挥其抗癌作用。

目前尚无黄芪黄酮类成分及其提取物用于喉癌化疗药物的报道，以上述有效成分为主的提取物也未见用于制备喉癌化疗药物的应用。

技术实现要素：

为了克服以上现有技术的不足本发明提供了黄芪黄酮提取物在制备喉癌化疗药物中的应用，不仅抑瘤能力增强，同时黄芪黄酮对顺铂所致肾损伤具有很好的保护作用。

为达到上述目的本发明采用了下列技术方案：

黄芪黄酮提取物在制备喉癌化疗药物中的应用，其特征在于：所述化疗药物由黄芪黄酮提取物与顺铂组成，且黄芪黄酮提取物与顺铂的质量比不低于6：1。

进一步，所述黄芪黄酮提取物是黄芪的乙醇提取物。

再进一步，所述的黄芪黄酮提取物通过以下步骤的方法制备得：

a.取1000g-3000g的黄芪药材，加入6-8l的体积分数为0-95％的乙醇加热回流提取1-3次，每次1-3小时，将所得的提取液合并，减压浓缩得膏状物；

b.将上述膏状物用ab-8大孔吸附树脂柱分离，依次用水、体积分数为10％、体积分数为35％的乙醇洗脱，收集体积分数为35％的乙醇洗脱液，洗脱液减压浓缩至溶剂尽干；

c.取上述体积分数为35％的乙醇洗脱液浓缩物分散于200ml水中，加1-3倍体积的乙酸乙酯萃取1-2次，合并萃取液，减压浓缩得浸膏，60℃真空干燥成干粉。

更进一步，所述的黄芪黄酮提取物中黄酮的质量百分比含量为40-60％，为质量百分比，所含有的主要化学成分包括芒柄花素、芒柄花苷、毛蕊异黄酮、毛蕊异黄酮-7-o-β-d-吡喃葡萄糖、7,2′-二羟基-3′,4′-二甲氧基异黄烷、2′-羟基-3′,4′-二甲氧基异黄烷-7-o-β-d-吡喃葡萄糖、3-羟基-9,10-二甲氧基紫檀烷、9,10-二甲氧基紫檀烷-3-o-β-d-吡喃葡萄糖。

以喉癌皮下荷瘤小鼠为药效学模型，分别给与不同剂量的黄酮提取物与顺铂。具体给药剂量为：

(1)黄芪黄酮提取物与顺铂质量比为6:1的低剂量组：6mg/kg黄酮提取物，1次/d；1mg/kg顺铂，1次/d，连续给药14d；

(2)黄芪黄酮提取物与顺铂质量比为12:1的高剂量组：12mg/kg黄酮提取物，1次/d；1mg/kg顺铂，1次/d，连续给药14d；

具体给药方式为腹腔注射。

动物体内实验研究证明黄芪黄酮提取物与顺铂组成的化疗药物，抑瘤能力增强；同时发现黄芪黄酮提取物能够增加顺铂化疗荷瘤小鼠的有效体质量，改善荷瘤小鼠的生存状态；能够拮抗顺铂化疗引起的肾损伤，对顺铂化疗有减毒作用。

附图说明

图1为实施例4中给药后各组肿瘤生长体积变化；

图2为实施例4中各给药组肿瘤图；

图3为实施例4中给药后各组体重变化；

图4为实施例4中各组肾脏脏器指数；

图5为实施例4中各组肾脏病理图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例作进一步的说明：

实施例1

黄芪黄酮提取物在制备喉癌化疗药物中的应用，所述化疗药物由黄芪黄酮提取物与顺铂组成，且黄芪黄酮提取物与顺铂的质量比不低于6：1。所述黄芪黄酮提取物是黄芪的乙醇提取物。所述的黄芪黄酮提取物中黄酮的质量百分比含量为40％，为质量百分比，所含有的主要化学成分包括芒柄花素、芒柄花苷、毛蕊异黄酮、毛蕊异黄酮-7-o-β-d-吡喃葡萄糖、7,2′-二羟基-3′,4′-二甲氧基异黄烷、2′-羟基-3′,4′-二甲氧基异黄烷-7-o-β-d-吡喃葡萄糖、3-羟基-9,10-二甲氧基紫檀烷、9,10-二甲氧基紫檀烷-3-o-β-d-吡喃葡萄糖。所述的黄芪黄酮提取物通过以下步骤的方法制备得：

a.取3000g黄芪药材，加入8l水加热回流提取3次，每次1小时，将所得的提取液合并，减压浓缩得膏状物；

b.将上述膏状物用ab-8大孔吸附树脂柱分离，依次用水、体积分数为10％、体积分数为35％的乙醇洗脱，收集体积分数为35％的乙醇洗脱液，洗脱液减压浓缩至溶剂尽干；

c.取上述体积分数为35％的乙醇洗脱液浓缩物分散于200ml水中，加1倍体积的乙酸乙酯萃取2次，合并萃取液，减压浓缩得浸膏，60℃真空干燥成干粉。

实施例2

黄芪黄酮提取物在制备喉癌化疗药物中的应用，所述化疗药物由黄芪黄酮提取物与顺铂组成，且黄芪黄酮提取物与顺铂的质量比不低于6：1。所述黄芪黄酮提取物是黄芪的乙醇提取物。所述的黄芪黄酮提取物中黄酮的质量百分比含量为50％，为质量百分比，所含有的主要化学成分包括芒柄花素、芒柄花苷、毛蕊异黄酮、毛蕊异黄酮-7-o-β-d-吡喃葡萄糖、7,2′-二羟基-3′,4′-二甲氧基异黄烷、2′-羟基-3′,4′-二甲氧基异黄烷-7-o-β-d-吡喃葡萄糖、3-羟基-9,10-二甲氧基紫檀烷、9,10-二甲氧基紫檀烷-3-o-β-d-吡喃葡萄糖。所述的黄芪黄酮提取物通过以下步骤的方法制备得：

a.取1000g黄芪药材，加入8l体积分数为20％的乙醇加热回流提取2次，每次2小时，将所得的提取液合并，减压浓缩得膏状物；

b.将上述膏状物用ab-8大孔吸附树脂柱分离，依次用水、体积分数为10％、体积分数为35％的乙醇洗脱，收集体积分数为35％的乙醇洗脱液，洗脱液减压浓缩至溶剂尽干；

c.取上述体积分数为35％的乙醇洗脱液浓缩物分散于200ml水中，加3倍体积的乙酸乙酯萃取1次，合并萃取液，减压浓缩得浸膏，60℃真空干燥成干粉。

实施例3

黄芪黄酮提取物在制备喉癌化疗药物中的应用，所述化疗药物由黄芪黄酮提取物与顺铂组成，且黄芪黄酮提取物与顺铂的质量比不低于6：1。所述黄芪黄酮提取物是黄芪的乙醇提取物。所述的黄芪黄酮提取物中黄酮的质量百分比含量为60％，为质量百分比，所含有的主要化学成分包括芒柄花素、芒柄花苷、毛蕊异黄酮、毛蕊异黄酮-7-o-β-d-吡喃葡萄糖、7,2′-二羟基-3′,4′-二甲氧基异黄烷、2′-羟基-3′,4′-二甲氧基异黄烷-7-o-β-d-吡喃葡萄糖、3-羟基-9,10-二甲氧基紫檀烷、9,10-二甲氧基紫檀烷-3-o-β-d-吡喃葡萄糖。所述的黄芪黄酮提取物通过以下步骤的方法制备得：

a.取1000g的黄芪药材，加入8l的体积分数为95％的乙醇加热回流提取3次，每次1小时，将所得的提取液合并，减压浓缩得膏状物；

b.将上述膏状物用ab-8大孔吸附树脂柱分离，依次用水、体积分数为10％、体积分数为35％的乙醇洗脱，收集体积分数为35％的乙醇洗脱液，洗脱液减压浓缩至溶剂尽干；

c.取上述体积分数为35％的乙醇洗脱液浓缩物分散于200ml水中，加2倍体积的乙酸乙酯萃取2次，合并萃取液，减压浓缩得浸膏，60℃真空干燥成干粉。

实施例4

喉癌皮下荷瘤小鼠药效学研究

1.喉癌裸鼠皮下异种移植瘤模型构建：

(1)细胞来源：hep2细胞系。

(2)动物来源：balb/cnude小鼠(spf级)，4周龄，雌性。购自北京维通利华生物科技股份有限公司。饲养与spf环境，环境温度及湿度适宜。

(3)造模方法：取对数期hep2细胞，pbs洗涤后，加入胰酶消化，1000rpm离心5min，弃上清液，加入无血清培养基重悬细胞，细胞计数仪计数，所需细胞悬浮液浓度约2×10⁷个/ml。吸取100ul细胞悬液，接种于小鼠腋下，每只小鼠接种约2×10⁶个细胞，接种体积需一致。瘤体肉眼可见后，使用数显卡尺对其进行体积测量(v＝1/2ab²)，记录瘤体长径和短径。

(4)实验分组：

分为5组。每组6只。

空白组：不造模，不给药；

模型组：只造模，不给药；

顺铂单独给药组：造模成功给顺铂，1mg/kg，1次/d；

黄芪黄酮提取物与顺铂质量比为6:1的低剂量组：6mg/kg黄芪总黄酮提取物，1次/d；1mg/kg，顺铂，1次/d；

黄芪黄酮提取物与顺铂质量比为12:1的高剂量组：12mg/kg黄芪总黄酮提取物，1次/d；1mg/kg，顺铂，1次/d；

连续给药14d，给药方式为腹腔注射。

停药次日处死动物，先称体重，后完整剖取皮下瘤块，称重，取各组肾组织作石蜡切片进行光镜组织病理学观察。

(5)统计学方法：所有数据以mean±sd表示，组间比较采用t检验，p值＜0.05为差异显著，有统计学意义。

2.结果

(1)给药后各组肿瘤生长体积变化

在各组动物给药期间，每隔一天对肿瘤进行测量，记录瘤体长径和短径。长径记为a，短径记为b，利用肿瘤体积计算公式v＝1/2ab²计算给药后各组肿瘤体积变化，结果如图1。与顺铂单独给药组相比，黄芪黄酮提取物与顺铂组成的化疗药物对裸鼠皮下肿瘤的生长有明显的抑制作用，其中黄芪黄酮提取物与顺铂质量比为12:1的高剂量组效果最好。

(2)疗效评价标准

肿瘤的抑制率＝(1-t/c)×100％

t：给药组平均瘤重；c：对照组平均瘤重

腹腔给药共14天，对人喉癌移植瘤具有较明显抑瘤活性，见图2，表1中为给给药组肿瘤抑制率变化。其中，单独顺铂给药组抑瘤率为42.15％，与模型对照组比较差异显著(p＜0.05)；黄芪黄酮提取物与顺铂质量比为12:1的高剂量联合顺铂组抑瘤率为62.74％，与模型对照组比较差异显著(p＜0.01)；黄芪黄酮提取物与顺铂质量比为6:1的低剂量组抑瘤率为57.82％，与模型对照组比较差异显著(p＜0.05)；

表1各组肿瘤抑制率表(n＝6，mean±sd)

(3)体重变化

在各组动物给药期间，每隔一天对动物的体重进行监测，记录体重数据。绘制体重变化图(图3)。单独顺铂给药组小鼠体重显著降低，与单独顺铂给药组相比，，使用黄芪黄酮提取物与顺铂组成的化疗药物处理裸鼠体重增高。说明黄芪黄酮提取物能够增加顺铂化疗荷瘤小鼠的有效体质量；改善荷瘤小鼠的生存状态。

(4)对肾损伤的保护作用

停药次日处死动物，解剖，取各组肾组织，称重后作石蜡切片进行光镜组织病理学观察。绘制各组肾脏脏器指数柱形图(图4)，发现与模型组相比，顺铂单独给药组的肾脏脏器指数显著升高(p<0.05)，当使用黄芪黄酮提取物与顺铂组成的化疗药物时，脏器指数回调，且黄芪黄酮提取物与顺铂质量比为12:1的高剂量组回调程度显著(p<0.05)。

而各组肾脏病理结果显示：顺铂单独给药组及与空白对照组比较，肾小管上皮细胞中至重度水样变性，小管嗜碱性变及蛋白管型多见，成纤维细胞中至重度成纤维细胞增生，间质重度炎细胞浸润，部分小管上皮细胞萎缩，管腔变大，肾病变程度明显，黄芪黄酮提取物与顺铂组成的化疗药物可改善顺铂单独给药造成的肾病变损伤和一定剂量依赖。