本发明涉及生物医药领域，特别是一种细胞膜仿生二氧化钛纳米粒的药物组合物。
背景技术：
声动力学治疗(sonodynamictherapy，sdt)是声敏剂被超声波激发而产生活性氧(ros)，从而发挥抗肿瘤效应的手段。中空介孔二氧化钛纳米粒(tio2)作为声敏剂具有生物相容性好、化学稳定性高、比表面积大等优点。但声疗是氧气依赖性的，而肿瘤部位乏氧，严重削弱了sdt的效果。血红蛋白(hb)是红细胞中运输氧气的重要蛋白质，具有可逆的氧气结合与解离能力；同时脱氧hb还具有亚硝酸盐还原酶活性，可以将亚硝酸盐还原为no。化疗药rrx-001作为一种抗癌新药，也是一种no供体，可增强脱氧hb的亚硝酸盐还原酶活性，进一步增加肿瘤no的产生，促进细胞凋亡。通过细胞膜包覆纳米粒，可完整保留细胞膜表面的复杂组成成分，不同的细胞膜修饰纳米粒后的功能不同，可提高纳米粒的生物相容性，实现免疫逃逸、长循环、主动靶向等，赋予纳米粒多功能的特征。因此，发明一种细胞膜仿生二氧化钛纳米粒的药物组合物应用在癌症治疗中具有重大意义和价值。
技术实现要素：
针对上述情况，为解决现有技术之缺陷，本发明之目的就是提供一种细胞膜仿生二氧化钛纳米粒的药物组合物，可有效解决免疫逃逸、长循环，通过增强声疗联合no化疗，促进肿瘤细胞凋亡的问题。
本发明解决的技术方案是，中空介孔二氧化钛纳米粒表面通过酰胺化反应共价修饰血红蛋白，然后物理负载no供体型化疗药物rrx-001，最后与细胞经低渗裂解液和裂解处理、匀浆得到的细胞膜囊泡共挤压，即得细胞膜仿生二氧化钛纳米粒的药物组合物，粒径为140-200nm。
具体包括以下步骤：
1)将0.6-1ml的正硅酸四乙酯(teos)加到装有0.3-0.5ml超纯水、15-25ml无水乙醇和0.6-1ml氨水的烧瓶中，强烈搅拌10-14h，10000-15000rpm离心10-20min，用无水乙醇洗至中性，得二氧化硅纳米粒(sio2)；
2)将步骤1)制得的二氧化硅纳米粒分散在10-20ml无水乙醇和0.05-0.15ml超纯水制成的溶液中，然后加入溶于2.5-7.5ml无水乙醇的0.05-0.15g羟丙基纤维素搅拌30min，成混合溶液，将0.5-1.5ml叔丁醇钛溶于2.5-7.5ml无水乙醇后，缓慢滴加到混合溶液中，80-90℃回流90-110min，10000-15000rpm离心10-20min，用无水乙醇洗2-4次，得sio2@tio2复合物；
3)将步骤2)中制得的sio2@tio2复合物分散于15-25ml超纯水中，加0.1-0.3gpvpk30，搅拌10-14h，10000-15000rpm离心5-10min得沉淀，沉淀再分散于15-25ml无水乙醇中，加入0.3-0.5ml超纯水、0.6-1mlteos和0.6-1ml氨水，磁力搅拌3-5h，10000-15000rpm离心5-10min，用无水乙醇洗至中性，得sio2@tio2@sio2复合物；
4)将步骤3)中制得的sio2@tio2@sio2复合物研磨后，于马弗炉中400℃煅烧2-4h，再分散于30-50ml超纯水中，加1.5-2.5ml2.5m的氢氧化钠溶液，80-90℃回流搅拌6-8h，10000-15000rpm离心5-10min，用超纯水洗至中性，得中空介孔二氧化钛纳米粒(tio2)；
5)将步骤4)制得的中空介孔二氧化钛纳米粒(tio2)10-50mg分散于4-20ml无水乙醇，加入80-400μl3-氨丙基三乙氧基硅烷，再加入0.2-1ml超纯水和0.2-1ml氨水，25℃搅拌10-14h，10000-15000rpm离心5-10min，用无水乙醇洗至中性，得氨基化的中空介孔二氧化钛复合物(tio2-nh2)；
6)将5-50mg血红蛋白(hb)溶解于10ml溶剂中，加入10-50mg1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和8-38mgn-羟基琥珀酰亚胺，25℃搅拌30min后，滴入含有步骤(5)制得的5mg氨基化的中空介孔二氧化钛复合物(tio2-nh2)的5ml溶剂分散液中，反应4-12h，5000-10000rpm离心5-10min，用超纯水洗至中性，得血红蛋白修饰的中空介孔二氧化钛(hb-tio2)；所述的血红蛋白为人血红蛋白、牛血红蛋白或重组血红蛋白的一种；所述的溶剂为甲酰胺、pbs、mes的一种；
7)将1mg步骤6)中制得的血红蛋白修饰的中空介孔二氧化钛(hb-tio2)和0.5-4mgrrx-001(no供体型化疗药物)分散于5ml甲醇中，25℃下超声2-4h，随即40-50℃旋蒸，挥干甲醇，再加1-2ml甲醇超声2-4s复溶，10000-15000rpm离心5-10min，得血红蛋白修饰的负载rrx-001的二氧化钛药物复合物(hb-tio2/rrx-001)，rrx-001的载药量为20％～60％；
8)消化收集贴壁细胞，加入低渗裂解液后对细胞进行裂解处理，机械或手动匀浆后，4℃3000-3500g离心5min，收集上清，再于4℃10000-15000g离心20-40min，沉淀加超纯水0.5ml重悬，使用挤压器通过400nm聚碳酸酯膜挤压15-25次，得细胞膜(cm)囊泡溶液；再与步骤7)制得的血红蛋白修饰的负载rrx-001的二氧化钛药物复合物(hb-tio2/rrx-001)通过200nm聚碳酸酯膜共挤压，即得细胞膜仿生二氧化钛纳米粒的药物组合物(cm-hb-tio2/rrx-001)；所述的细胞为乳腺癌细胞、肝癌细胞、胃癌细胞、肺癌细胞、红细胞、单核细胞、巨噬细胞的一种；所述的低渗裂解液为tris-hcl(20mm)、kcl(10mm)、mgcl2(2mm)和苯甲基磺酰氟(pmsf，1mm)的混合液，裂解处理为4℃放置1～3h、液氮和25℃反复冻融2～4次，每次置液氮中3s，25℃融化。
本发明制备方法稳定可靠，生产费用低，制得的细胞膜仿生二氧化钛纳米粒的药物组合物在制备抗肿瘤药物方面可发挥增强声疗联合no化疗的作用，增强抗肿瘤效果，同时具有免疫逃逸、长循环等多功能，生物相容性好，是肿瘤治疗药物上的创新，经济和社会效益巨大。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
实施例1
1)将0.8ml的正硅酸四乙酯(teos)加到装有0.4ml超纯水、20ml无水乙醇和0.8ml氨水的烧瓶中，强烈搅拌12h，12000rpm离心15min，用无水乙醇洗至中性，得二氧化硅纳米粒(sio2)；
2)将步骤1)制得的二氧化硅纳米粒分散在15ml无水乙醇和0.1ml超纯水制成的溶液中，然后加入溶于5ml无水乙醇的0.1g羟丙基纤维素搅拌30min，成混合溶液，将1ml叔丁醇钛溶于5ml无水乙醇后，缓慢滴加到混合溶液中，85℃回流100min，12000rpm离心15min，无水乙醇洗3次，得sio2@tio2复合物；
3)将步骤2)中制得的sio2@tio2复合物分散于20ml超纯水中，加0.2gpvpk30，搅拌12h，12000rpm离心8min得沉淀，再分散于20ml无水乙醇中，加入0.4ml超纯水、0.8mlteos和0.8ml氨水，磁力搅拌4h，12000rpm离心8min，无水乙醇洗至中性，得sio2@tio2@sio2复合物；
4)将步骤3)中制得的sio2@tio2@sio2复合物研磨后，于马弗炉中400℃煅烧3h，再分散于40ml超纯水，加2ml2.5m的氢氧化钠溶液，85℃回流搅拌7h，12000rpm离心8min，用超纯水洗至中性，得中空介孔二氧化钛纳米粒(tio2)；
5)将步骤4)制得的中空介孔tio230mg分散于12ml无水乙醇，加入240μl3-氨丙基三乙氧基硅烷，再加入0.6ml超纯水和0.6ml氨水，25℃搅拌12h，12000rpm离心8min，用无水乙醇洗至中性，烘干，得到氨基化的中空介孔二氧化钛复合物(tio2-nh2)；
6)将30mg血红蛋白(hb)加入10ml50mm2-(n-吗啉)乙磺酸(mes)缓冲液(ph＝6.5)中溶解，加入30mg1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和23mgn-羟基琥珀酰亚胺，25℃搅拌30min后，滴入含有步骤5)制得的5mgtio2-nh2的5mlmes探超分散液中，反应8h，8000rpm离心8min，用超纯水洗至中性，得血红蛋白修饰的中空介孔二氧化钛(hb-tio2)；
7)将1mg步骤6)中制得的血红蛋白修饰的中空介孔二氧化钛和2mgrrx-001分散于5ml甲醇中，在25℃下超声3h，随即45℃旋蒸，挥干甲醇，再加1ml甲醇超声3s复溶，12000rpm离心8min，即得血红蛋白修饰的负载rrx-001的二氧化钛药物复合物(hb-tio2/rrx-001)；
8)收集mcf-7人乳腺癌细胞，用低渗裂解缓冲液重悬，4℃放置2h，匀浆机匀浆后，4℃3200g离心5min，收集上清，再于4℃12000g离心30min，沉淀加超纯水重悬，用avanti挤压器通过400nm聚碳酸酯膜挤压20次，得细胞膜囊泡溶液；再与步骤7)制得的hb-tio2/rrx-001通过200nm聚碳酸酯膜共挤压，即得细胞膜仿生二氧化钛纳米粒的药物组合物(cm-hb-tio2/rrx-001)。
实施例2
1)将0.6ml的正硅酸四乙酯(teos)加到装有0.3ml超纯水、15ml无水乙醇及0.6ml氨水的烧瓶中，强烈搅拌10h，10000rpm离心10min，用无水乙醇洗至中性，得二氧化硅纳米粒(sio2)；
2)将步骤1)制得的sio2分散在10ml无水乙醇及0.05ml超纯水制成的溶液中，然后加入溶于2.5ml无水乙醇的0.05g羟丙基纤维素搅拌30min，制成混合溶液，将0.5ml叔丁醇钛溶于2.5ml无水乙醇后，缓慢滴加到混合溶液中，80℃回流90min，10000rpm离心10min，无水乙醇洗2次，得sio2@tio2复合物；
3)将步骤2)中制得的sio2@tio2复合物分散于15ml超纯水中，加0.1gpvpk30，搅拌10h，10000rpm离心5min得沉淀，再分散于15ml无水乙醇中，加入0.3ml超纯水、0.6mlteos及0.6ml氨水，磁力搅拌3h，10000rpm离心5min，无水乙醇洗至中性，得sio2@tio2@sio2复合物；
4)将步骤3)中制得的sio2@tio2@sio2复合物研磨后，于马弗炉中400℃煅烧2h，再分散于30ml超纯水，加1.5ml2.5m的氢氧化钠溶液，80℃回流搅拌6h，10000rpm离心5min，用超纯水洗至中性，即得中空介孔二氧化钛纳米粒(tio2)；
5)将步骤4)制得的中空介孔tio210mg分散于4ml无水乙醇，加入80μl3-氨丙基三乙氧基硅烷，再加入0.2ml超纯水和0.2ml氨水，25℃搅拌10h，10000rpm离心5min，用无水乙醇洗至中性，得到氨基化的中空介孔二氧化钛复合物(tio2-nh2)；
6)将5mg血红蛋白(hb)加入10ml50mm2-(n-吗啉)乙磺酸(mes)缓冲液(ph＝6.5)中溶解，加入10mg1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和8mgn-羟基琥珀酰亚胺，25℃搅拌30min后，滴入含有步骤(5)制得的5mgtio2-nh2的5mlmes探超分散液中，反应4h，5000rpm离心5min，用超纯水洗至中性，即得血红蛋白修饰的中空介孔二氧化钛(hb-tio2)；
7)将1mg步骤6)中制得的血红蛋白修饰的中空介孔二氧化钛和0.5mgrrx-001分散于5ml甲醇中，在25℃下超声2h，随即40℃旋蒸，挥干甲醇，再加1.5ml甲醇超声2s复溶，10000rpm离心5min，即得血红蛋白修饰的负载rrx-001的二氧化钛药物复合物(hb-tio2/rrx-001)；
8)收集人红细胞，用低渗裂解缓冲液重悬，4℃放置1h，匀浆后，4℃3000g离心5min，收集上清；再于4℃10000g离心20min，沉淀加超纯水重悬，用avanti挤压器通过400nm聚碳酸酯膜挤压15次，得细胞膜囊泡溶液；再与步骤7)制得的hb-tio2/rrx-001通过200nm聚碳酸酯膜共挤压，即得细胞膜仿生二氧化钛纳米粒的药物组合物(cm-hb-tio2/rrx-001)。
实施例3
1)将1ml的正硅酸四乙酯(teos)加到装有0.5ml超纯水、25ml无水乙醇和1ml氨水的烧瓶中，强烈搅拌14h，15000rpm离心20min，用无水乙醇洗至中性，得二氧化硅纳米粒(sio2)；
2)将步骤1)制得的sio2分散在20ml无水乙醇和0.15ml超纯水制成的溶液中，然后加入溶于7.5ml无水乙醇的0.15g羟丙基纤维素搅拌30min，制成混合溶液，将1.5ml叔丁醇钛溶于7.5ml无水乙醇后，缓慢滴加到混合溶液，90℃回流110min，15000rpm离心20min，无水乙醇洗4次，得sio2@tio2复合物；
3)将步骤2)中制得的sio2@tio2复合物分散于25ml超纯水中，加0.3gpvpk30，搅拌14h，15000rpm离心10min得沉淀，再分散于25ml无水乙醇中，加入0.5ml超纯水、1mlteos和1ml氨水，磁力搅拌5h，15000rpm离心10min，无水乙醇洗至中性，得sio2@tio2@sio2复合物；
4)将步骤3)中制得的sio2@tio2@sio2复合物研磨后，于马弗炉中400℃煅烧4h，再分散于50ml超纯水，加2.5ml2.5m的氢氧化钠溶液，90℃回流搅拌8h，15000rpm离心10min，用超纯水洗至中性，即得中空介孔二氧化钛纳米粒(tio2)；
5)将步骤4)制得的中空介孔tio250mg分散于20ml无水乙醇，加入400μl3-氨丙基三乙氧基硅烷，再加入1ml超纯水和1ml氨水，25℃搅拌14h，15000rpm离心10min，用无水乙醇洗至中性，得到氨基化的中空介孔二氧化钛复合物(tio2-nh2)；
6)将50mg血红蛋白(hb)加入10ml50mm2-(n-吗啉)乙磺酸(mes)缓冲液(ph＝6.5)中溶解，加入50mg1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和38mgn-羟基琥珀酰亚胺，25℃搅拌30min后，滴入含有步骤(5)制得的5mgtio2-nh2的5mlmes探超分散液中，反应12h，10000rpm离心10min，用超纯水洗至中性，即得血红蛋白修饰的中空介孔二氧化钛(hb-tio2)；
7)将1mg步骤6)中制得的血红蛋白修饰的中空介孔二氧化钛和4mgrrx-001分散于5ml甲醇中，在25℃下超声4h，随即50℃旋蒸，挥干甲醇，再加2ml甲醇超声4s复溶，15000rpm离心10min，即得血红蛋白修饰的负载rrx-001的二氧化钛药物复合物(hb-tio2/rrx-001)；
8)收集人巨噬细胞，用低渗裂解缓冲液重悬，4℃放置3h，匀浆后，4℃3500g离心5min，收集上清，再于4℃15000g离心40min，沉淀加超纯水重悬，用挤压器通过400nm聚碳酸酯膜挤压25次，得细胞膜囊泡溶液；再与步骤7)制得的0.5mlhb-tio2/rrx-001(1mg/ml)通过200nm聚碳酸酯膜共挤压，即得细胞膜仿生二氧化钛纳米粒的药物组合物(cm-hb-tio2/rrx-001)。
经科学试验，本发明所制得的细胞膜仿生二氧化钛纳米粒的药物组合物的制备方法稳定可靠，hb供氧增强tio2声疗，而rrx-001增强脱氧血红蛋白的亚硝酸盐还原酶活性，显著增加no的产生，极大增强了抗肿瘤效果。所制备的仿生药物组合物具备免疫逃逸、长循环、增强声疗联合no化疗等多重功效，与传统化疗相比具有高效、毒副作用小的优势，有关实验资料如下：
一、细胞膜仿生二氧化钛纳米粒的药物组合物的表征
1、细胞膜仿生二氧化钛纳米粒的药物组合物中rrx-001含量的测定
采用紫外分光光度计，于202nm波长处测定rrx-001的含量。以公式(1)计算样品的载药量，载药率达50％左右。
2、细胞膜仿生二氧化钛纳米粒的药物组合物的粒径和电位的测定
取适量负载rrx-001的细胞膜仿生二氧化钛纳米粒的药物组合物分散于超纯水中，用nano-zs90型激光纳米粒度分析仪测得其粒径和电位分别为145nm和-21.7±1mv。
二、细胞膜仿生二氧化钛纳米粒的药物组合物体外产生ros的检测
mcf-7人乳腺癌细胞贴壁生长24h后加药，依次为空白组、cm-tio2、cm-tio2+us、cm-hb-tio2+us(tio2：10μg/ml，rrx-001：3μm)。4～6h后，避光加入含有dhe活性氧探针的pbs培养30min，超声组超声(1w/cm2，1mhz，30s)后，继续培养30min，收集细胞，用流式细胞仪对各组产生的ros定量，cm-tio2+us、cm-hb-tio2+us活性氧产生量分别为23.8％、58.8％。该结果表明hb供氧可增强tio2声动力学治疗中ros的产生。
三、细胞膜仿生二氧化钛纳米粒的药物组合物体外产生no的检测
mcf-7人乳腺癌细胞贴壁生长24h后加药，依次为空白组、cm-tio2、cm-tio2+us、cm-hb-tio2+us、cm-hb-tio2/rrx-001+us(tio2：10μg/ml，rrx-001：3μm)。4～6h后，避光加入含有daf-fmda探针的稀释液培养30min，超声组超声(1w/cm2，1mhz，30s)后，继续培养30min，收集细胞，用流式细胞仪对各组产生的no定量。最终得到cm-hb-tio2+us、cm-hb-tio2/rrx-001+us的no产生量分别为10.2％、40.0％。该结果表明hb供氧后产生的脱氧血红蛋白其亚硝酸盐还原酶活性可以还原肿瘤富集的亚硝酸盐为no；加rrx-001后产生更多的no，进一步说明了rrx-001与hb的结合可增强hb在乏氧下的亚硝酸盐还原酶活性，从而生成更多的no。
四、细胞膜仿生二氧化钛纳米粒的药物组合物乏氧下的细胞增殖抑制实验
mcf-7人乳腺癌细胞贴壁生长24h后加药，依次为空白组、cm-tio2、cm-hb-tio2、cm-hb-tio2/rrx-001(tio2：10μg/ml，rrx-001：3μm)，并分超声组(1w/cm2，1mhz，30s)和非超声组。在乏氧环境(po2：2％)孵育24h后，采用srb法检测，计算细胞生长抑制率(％)＝(1-实验组od值/对照组od值)×100％，得到cm-tio2、cm-tio2+us、cm-hb-tio2、cm-hb-tio2+us、cm-hb-tio2/rrx-001+us各组的细胞生长抑制率分别为：1.7％，19％，3％，28％，81％。结果表明，载体cm-tio2和cm-hb-tio2在实验剂量下对细胞无明显毒性，但在超声下毒性较明显；rrx-001的加入在制剂超声后导致更强的细胞毒性，应是氧供增强声疗和no化疗协同治疗的结果。
五、细胞膜仿生二氧化钛纳米粒的药物组合物的药效学研究
购买裸鼠(雌性，3～4周龄)，右上肢皮下接种mcf-7人乳腺癌细胞，取肿瘤体积≥100mm3的小鼠，分为：生理盐水组、cm-tio2、cm-tio2+us、cm-hb-tio2+us、cm-hb-tio2/rrx-001+us(tio2：20mg/kg，rrx-001：5mg/kg)，尾静脉给药6h后超声肿瘤部位(1w/cm2，1mhz，30s)。每两天给药一次，共7次。使用数显游标卡尺测量瘤的长径(a)与短径(b)，按公式v＝a×b2/2计算肿瘤体积。结果显示，cm-tio2、cm-tio2+us、cm-hb-tio2+us、cm-hb-tio2/rrx-001+us的抑瘤率分别为4.59％，17.57％，33.92％，84.19％，说明该肿瘤特异靶向给药系统的氧供增强声疗协同no化疗可显著增强抗肿瘤效果。
实验表明，本发明与现有技术相比，具有以下突出的有益技术效果：
(1)本发明提供的细胞膜仿生二氧化钛纳米粒的药物组合物，选择细胞膜包裹纳米粒，有利于开发多功能递药系统。
(2)本发明提供的细胞膜仿生二氧化钛纳米粒的药物组合物，血红蛋白可以为乏氧肿瘤提供氧气，增强tio2声疗。
(3)本发明提供的细胞膜仿生二氧化钛纳米粒的药物组合物，rrx-001可增强血红蛋白供氧后产生的脱氧血红蛋白的亚硝酸盐还原酶活性，将肿瘤富集的亚硝酸盐还原为no，显著增强抗瘤效应。