本发明涉及一种鸭呼肠孤病毒疫苗及其制备方法。
背景技术：
我国自1997年起，在两广、浙、闽、豫和鄂等省爆发了以鸭肝脏上有白色坏死点为特征的病。本病在遇到混合感染或应激时死亡率非常高。通常，此病主要发生于7～45日龄番鸭，致病率高达20％～90％，死亡率为10～50％。感染鸭多表现为腹海，软脚，附关节或趾关节不同程度肿胀，耐过鸭变为僵鸭；剖检可见肝、脾、胰、肾和肠的坏死。此以肝脏不规则坏死、出血斑/点和心肌、腔上囊出血为主要特征的新疫病，俗称"鸭新肝病"、"鸭坏死性肝炎病"等，经分离鉴定其病原为呼肠孤病毒科正呼肠孤病毒属鸭呼肠孤病毒。
目前尚没有鸭呼肠孤病毒疫苗上市，也没有相关的药物控制该病毒导致的疾病，鸭呼肠孤病毒感染疾病的发生常给养鸭业造成重大经济损失。
技术实现要素：
本发明要解决的技术问题是有效预防鸭呼肠孤病毒。
为解决上述技术问题，本发明公开一种鸭呼肠孤病毒疫苗，其是在传代细胞系bhk-21细胞上接种鸭呼肠孤病毒毒种得到的灭活疫苗。
所述鸭呼肠孤病毒疫苗的制备方法，其包括如下步骤：
(1)bhk-21细胞的传代与培养：bhk-21细胞经edta-胰酶细胞分散液消化传代，以细胞生长液继续培养，形成细胞单层时，用于继续传代或接种病毒；
(2)病毒的接种和培养：取已形成单层的上述细胞，弃去细胞生长液，接种细胞维持液，将呼肠孤病毒毒种按终体积1:100～1:1000接种到制备的细胞，吸附后吸弃病毒液，在用培养液培养至细胞出现病变时收获；
(3)病毒的收集、浓缩、纯化：将上述接种的病变细胞冻融，离心后收集上清液得到病毒原液；通过超滤浓缩上述病毒液即为制苗病毒液；
(4)病毒灭活：采用0.1％福尔马林灭活病毒，即为疫苗抗原；
(5)使用疫苗抗原配置疫苗制剂。
优选所述步骤(1)中的细胞生长液为含5～10％新生牛血清的dmem培养液,所述细胞生长液中可含双抗。所述步骤(2)所述细胞维持液为无血清的dmem培养液，毒种接种到细胞后在37℃吸附30～60分钟后吸弃病毒液，接毒后在培养液中培养条件为37℃、5％co2，所述培养液为含1～2％新生牛血清的dmem培养液，细胞维持液中可含有2mm的谷氨酰胺，更优选含有0.2mm的n-n-二乙基-1-4-苯二胺。所述步骤(3)中所述制苗病毒液每0.1ml病毒大于含量107.0tcid50。所述步骤(1)中bhk-21细胞在转瓶内或在微载体反应器中培养。
所述步骤(5)配置疫苗制剂包括如下步骤：
a)水相制备：取检验合格的疫苗抗原96份加入灭菌后的吐温-804份，开始搅拌，使吐温-80完全溶解为止，制成水相；
b)油相制备：取优质注射用白油94份，硬脂酸铝2份，司班-804份，先将白油缓慢加温，按4％和2％加入司班-80和硬脂酸铝，边搅边加温，直到硬脂酸铝充分溶解至透明为止，高压灭菌备用；
c)乳化：利用ika乳化机进行乳化，16000rpm，乳化5分钟即可；
d)分装：将制备的疫苗按照每瓶250ml进行分装。
本发明所公开鸭呼肠孤病毒疫苗采用病毒高适应性的传代细胞系bhk-21细胞进行疫苗生产,该工艺具备以下优势：
1.细胞背景清楚，无外源病原，易增殖性，非常适用生物反应器进行大规模培养，这符合未来疫苗生产趋势，因此本发明具备高度的工艺前瞻性。
2.使用bhk-21传代细胞系制备疫苗，半抗原高度澄清，容易进行浓缩处理，非常适合进行高抗原滴度的优质灭活疫苗生产。
用bhk-21传代细胞进行鸭呼肠孤病毒增殖，利用reed-muench方法测定其病毒滴度可以稳定达到107.0-107.5tcid50/0.1ml。抗原的稳定生产和高滴度是制备疫苗最关键因素,用bhk-21细胞进行鸭呼肠孤病毒增殖其病毒滴度是常规鸭胚法及原代细胞法的10倍以上，如采用生物反应器进行病毒增殖，其病毒滴度可以达到100倍水平。本专利公开的鸭呼肠孤病毒灭活疫苗，产量高，品质稳定，免疫鸭能产生高水平血清中和抗体，免疫效果好，具有巨大的应用前景。
具体实施方式
以下通过具体实施例再对本发明的上述内容作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅局限于以下的实施例。在不脱离本发明上述技术思想的情况下，根据本领域普通技术知识和惯用手段做出的各种替换或变更，均应包括在本发明的范围内。
以下实施例所使用的鸭呼肠孤病毒为自行分离鉴定：采用rt-pcr扩增，测序进行序列比，同时进行动物回归和鸭胚适应性试验进行进一步确定为鸭呼肠孤病毒。
实施例1
制备方法：
(1)将bhk-21细胞，用胰酶消化分散，加入5％新生牛血清的dmem培养液在转瓶内37℃、5％co2培养至细胞单层后，弃去原培养液，用无血清dmem培养液清洗细胞3次，用于鸭呼肠孤病毒接种。
(2)病毒的接种和培养：将鸭呼肠孤病毒毒种按终体积1:100接种到步骤①制备的细胞，并在37℃吸附30分钟后吸弃病毒液，在用含1％新生牛血清的dmem培养液于37℃、5％co2培养至细胞，出现病变时终止。
(3)病毒收集、浓缩和纯化及病毒含量测定：将收集的细胞病毒液于-20℃反复冻融两次后，于4℃、5000rpm离心10min，取离心后上清液用于超滤浓缩。将上述离心后的上清液用30k中空纤维柱将其浓缩10倍后，取浓缩后的病毒液用dmem细胞培养液做10倍系列稀释，取10-5、10-6、10-7、10-8、10-95个稀释度接种48孔铺满单层bhk-21细胞培养板，每个稀释度重复5孔，同时设立阴性对照细胞；每孔0.2ml，5％co2、37℃培养120小时，观察细胞病变(cpe)，计算tcid50，每0.1ml病毒含量107.0tcid50，可用于制苗。
(4)病毒灭活：采用0.1％福尔马林灭活病毒，即为疫苗抗原。
实施例2
制备方法：
(1)将bhk-21细胞，用胰酶消化分散，加入10％新生牛血清的dmem培养液在微载体反应器中37℃、5％co2培养至细胞单层后，弃去原培养液，用无血清dmem培养液清洗细胞3次，用于鸭呼肠孤病毒接种。
(2)病毒的接种和培养：将鸭呼肠孤病毒毒种按终体积1:1000接种到步骤①制备的细胞，并在37℃吸附60分钟后吸弃病毒液，在用2％新生牛血清的dmem培养液于37℃、5％co2培养至细胞，出现病变时终止。
(3)病毒收集、浓缩和纯化：将上述接种的病变细胞冻融，离心后收集上清液得到病毒原液；通过超滤浓缩上述病毒液即为制苗病毒液。方法同实施例1并进行病毒含量测定：每0.1ml病毒含量107.5tcid50，可用于制苗。
(4)病毒灭活：采用0.1％福尔马林灭活病毒，即为疫苗抗原。
实施例3
制备方法：
(1)将bhk-21细胞，用胰酶消化分散，加入7％新生牛血清的dmem培养液在微载体反应器中37℃、5％co2培养至细胞单层后，弃去原培养液，再用含有2mm的谷氨酰胺的无血清dmem培养液清洗细胞3次，用于鸭呼肠孤病毒接种。
(2)病毒的接种和培养：将鸭呼肠孤病毒毒种按终体积1:500接种到步骤①制备的细胞，并在37℃吸附45分钟后吸弃病毒液，在用1.5％新生牛血清的dmem培养液于37℃、5％co2培养至细胞，出现病变时终止。
(3)病毒收集、浓缩和纯化：将上述接种的病变细胞冻融，离心后收集上清液得到病毒原液；通过超滤浓缩上述病毒液即为制苗病毒液。方法同实施例1并进行病毒含量测定：每0.1ml病毒含量108.0tcid50，可用于制苗。
(4)病毒灭活：采用0.1％福尔马林灭活病毒，即为疫苗抗原。
实施例4
制备方法：
(1)将bhk-21细胞，用胰酶消化分散，加入含双抗的6％新生牛血清的dmem培养液在微载体反应器中37℃、5％co2培养至细胞单层后，弃去原培养液，再用含有2mm的谷氨酰胺、0.2mm的n-n-二乙基-1-4-苯二胺的无血清dmem培养液清洗细胞3次，用于鸭呼肠孤病毒接种。
(2)病毒的接种和培养：将鸭呼肠孤病毒毒种按终体积1:500接种到步骤①制备的细胞，并在37℃吸附45分钟后吸弃病毒液，在用1.5％新生牛血清的dmem培养液于37℃、5％co2培养至细胞，出现病变时终止。
(3)病毒收集、浓缩和纯化：将上述接种的病变细胞冻融，离心后收集上清液得到病毒原液；通过超滤浓缩上述病毒液即为制苗病毒液。方法同实施例1并进行病毒含量测定：每0.1ml病毒含量107.0tcid50，可用于制苗。
(4)病毒灭活：采用0.1％福尔马林灭活病毒，即为疫苗抗原。
以上实施例的疫苗抗原都通过以下步骤配制为疫苗制剂：
a)水相制备：取检验合格的疫苗抗原96份加入灭菌后的吐温-804份，开始搅拌，使吐温-80完全溶解为止，制成水相；
b)油相制备：取优质注射用白油94份，硬脂酸铝2份，司班-804份，先将白油缓慢加温，按4％和2％加入司班-80和硬脂酸铝，边搅边加温，直到硬脂酸铝充分溶解至透明为止，高压灭菌备用；
c)乳化：利用ika乳化机进行乳化，16000rpm，乳化5分钟即可；
d)分装：将制备的疫苗按照每瓶250ml进行分装。
本发明以上实施例所制备的鸭呼肠孤病毒的试验测试结果如下：
1)以上实施例所制备的鸭呼肠孤病毒的质量控制：根据现行《中国兽药典》对其进行稳定性、粘度、无菌检验、甲醛含量测定,结果均符合国家标准，检验合格。
2)以上实施例所制备的鸭呼肠孤病毒的灭活检验：取实施例1-4、分别用dmem营养液以10-1、10-2、10-3三个比例稀释待检样品，同时设立同样稀释比例的灭活前病毒样品用于阳性对照，分别接种于48孔bhk-21细胞单层细胞，每组重复接种5孔，每孔0.4ml37℃、5％co2培养96小时。结果显示，灭活样品各组稀释度孔中均没有出现细胞病变，阳性对照组各稀释度孔中细胞病变均明显，达80％以上。实施例1-4灭活检验合格。
3)以上实施例所制备的鸭呼肠孤病毒疫苗的安全性试验：选用7日龄健康易感鸭将其分为5组，每组10只，分别每只肌肉或颈部皮下注射实施例1-4疫苗1ml，剩余一组作为空白对照组，观察14日，结果试验鸭均健活，无任何局部和全身不良反应；在第15天进行解剖观察，内脏组织无明显的病变。表明本发明实施例1-4制备的鸭呼肠孤病毒疫苗安全。
4)以上实施例所制备的鸭呼肠孤病毒疫苗的疫苗效力试验：取7日龄健康易感鸭50只，每组10只，将实施例1-4制备的鸭呼肠孤病毒疫苗分别以0.3ml/只胸肌注射，剩余一组作为空白对照组，免疫后14、28、42和56天，分别采血，测定其血清中和抗体效价。结果显示，实施例1-4制备的鸭呼肠孤病毒疫苗均能产生高水平血清中和抗体，具体见表1。
表1
5)以上实施例所制备的鸭呼肠孤病毒疫苗的免疫保护试验：取7日龄健康易感鸭100只，分为5组，每组20只。各组同步进行强毒攻击，攻毒株为鸭呼肠孤病毒，攻毒剂量各为60cfu/只，分两次肌肉注射，间隔1天，间隔日胸肌注射给药实施例1-40.3ml/只，对照组1注射同体积生理盐水。连续观察50天，统计各组鸭呼肠孤病毒疫苗的保护率，结果显示实施例样品免疫保护效果好，具体见表2：
表2