预防、缓解或治疗阿尔茨海默病的肽及其应用的制作方法

本申请大体上涉及医学领域，具体而言，本申请提供了预防、缓解或治疗阿尔茨海默病的肽及其应用。
背景技术：
：阿尔茨海默病(alzheimer’sdisease,ad)是中老年较常见的疾病，是仅次于心脑血管疾病、肿瘤之后的严重威胁老年人生命健康的疾病。临床表现为进行性认知功能障碍和行为损害。阿尔茨海默病的发病机制与突变基因、内外环境及能量代谢有关。正常生理状态下，树突中tau蛋白的水平比轴突低得多。在一些疾病状态下，tau蛋白会在树突中中异常富集，特别是在aβ淀粉样蛋白介导的阿尔茨海默病早期阶段。tau蛋白需要与fyn协同发挥作用，因此在δtau74和tau-/-小鼠中，fyn的树突靶向显着降低。在δtau74小鼠中，这是由于δtau与内源性tau竞争与fyn的结合位点，起到竞争性抑制的作用。在tau蛋白-/-小体内中，fyn的积累出现类似现象，表明突触后fyn靶向需要内源tau介导。δtau74小鼠和tau-/-小鼠突触后fyn水平降低均能导致fyn-底物nr2b的y1472磷酸化程度降低。nmdar2b的y1472磷酸化是促进nmdar与psd-95的相互作用的关键条件。fyn和tau蛋白介导的nmdar/psd-95复合物形成是大鼠卒中模型中的确切机制，有针对性地阻断nmdar/psd-95相互作用阻止了兴奋性毒性损伤并减少病灶大小。与此一致，aβ淀粉样蛋白介导的ad早期阶段，该理论同样适用。对δtau74和tau-/-小鼠，采用tat-nr2b9c治疗后，nmdar介导的突触活性并无差异。兴奋毒性逐渐被认为是aβ淀粉样蛋白引起阿尔茨海默病的机制之一。δtau74和tau-/-小鼠与野生型相比，对兴奋性毒性并不敏感。类似地，tau缺陷或表达δtau的原代神经元也能免疫aβ淀粉样蛋白诱导的毒性。然而，aβ淀粉样蛋白水平和斑块形成，以及app23小鼠的内源性tau磷酸化(app23中δtau74)与app小鼠相比表明保护的另一种机制。app23小鼠中发现nr2b的y1472磷酸化和突触后fyn上调在app23.δtau74和app23.tau-/-小鼠中完全复原。app23.δtau74和app.tau-/-小鼠突触后fyn的下调可得出树突状fyn定位还涉及其他tau机制，即部分δtau竞争性抑制fyn定位。除了参与aβ淀粉样蛋白引起的阿尔茨海默病病理机制外，fyn转基因小鼠存在癫痫发作过早死亡。损伤途径中均涉及神经元细胞凋亡和小胶质细胞引起的炎症，神经元凋亡通路中谷氨酸受体和突触后致密蛋白。此外，app相关死亡率在fyn-/-个体上明显降低。app23.δtau74和app23.tau-/-小鼠的一致表现，说明常规tau蛋白缺失，有效抑制aβ淀粉样蛋白导致的相关缺陷。nmdar/psd-95复合物在app23小鼠中aβ淀粉样蛋白毒性机制中，起到关键作用，作为阿尔茨海默病病理中tau蛋白的下游分子，该复合物可能与tau机制和非tau机制均有关联。给年幼的app23小鼠施用tatnr2b9c，tau蛋白和fyn引起的aβ淀粉样蛋白毒性均能得到有效抑制。tatnr2b9c在体外和体内神经保护作用，主要依靠抑制nmdar/psd-95复合物的形成，同样也能提高app23小鼠的记忆功能和存活率。值得注意的是，tat-nr2b9治疗的app23小鼠能长期存活，这表明短期治疗足以预防aβ淀粉样蛋白毒性。阿尔茨海默病治疗领域中，发病机理研究不断进展，阿尔茨海默病治疗领域仍然需要依据新的研究开发治疗药物来满足治疗市场的需求。发明概述第一方面，本申请提供了含有氨基酸序列yeklldtei(seqidno:1)或其功能性变体的肽或包含所述肽的药物组合物在制备预防、缓解或治疗个体的阿尔茨海默病的药物中的用途。第二方面，本申请提供了预防、缓解或治疗阿尔茨海默病的方法，所述方法包括：向有需要的个体施用含有氨基酸序列yeklldtei或其功能性变体的肽或者包含所述肽的药物组合物。第三方面，本申请提供了含有氨基酸序列yeklldtei(seqidno:1)或其功能性变体的肽或包含所述肽的药物组合物，其用于治疗、改善或预防个体的阿尔茨海默病。在上述任一方面的一些实施方案中，功能性变体为yeklldtei中的ldtei部分发生一处或多处保守型取代后产生的变体，优选地，所述保守型取代选自d和e之间的取代，l、v和i之间的取代以及t和s之间的取代。在上述任一方面的一些实施方案中，功能性变体为yeklldtei中的ldtei部分被替换为下述任一序列后产生的变体：ldtel、ldtev、ldtdi、ldtdl、ldtdv、ldsei、ldsel、ldsev、ldsdi、ldsdl、ldsdv、letei、letel、letev、letdi、letdl、letdv、vdtei、vdtel、vdtev、vdtdi、vdtdl、vdtdv、idtei、idtel、idtev、idtdi、idtdl、idtdv、ietei、ietel、ietev、ietdi、ietdl、ietdv。在上述任一方面的一些实施方案中，肽为包含氨基酸序列yeklldtei或其功能性变体以及内化肽的嵌合肽，优选地所述内化肽包含氨基酸序列ygrkkrrqrrr(seqidno:2)。在上述任一方面的一些实施方案中，嵌合肽包含氨基酸序列ygrkkrrqrrryeklldtei(seqidno:3)。在上述任一方面的一些实施方案中，肽、药物组合物或药物能够改善阿尔茨海默病患病个体的学习能力、记忆能力(例如短期记忆能力)和/或空间认知能力。在上述任一方面的一些实施方案中，个体为哺乳动物。在上述任一方面的一些实施方案中，个体为人类。附图说明图1显示了pull-down实验检测p5与pdz1/2结构域的相互作用。m代表蛋白质分子量标识；泳道1为his+pdz1/2+p5；泳道2为单独的p5；泳道3为his+p5；泳道4为his+pdz1/2。泳道1所示的洗脱条带包含p5与pdz1/2两者，证实p5能够结合pdz1/2结构域。图2显示了不同治疗方案对阿尔茨海默病模型大鼠逃避潜伏期的测试结果，其中“★”表示p<0.05。图3显示了不同治疗方案对阿尔茨海默病模型大鼠穿越平台次数的测试结果，其中“★”表示p<0.05，“★★”表示p<0.01。发明详细描述本申请的发明人对能降低至少部分由nmdar兴奋性神经毒性介导的神经学病症的损伤效应的肽进行了深入研究，并开发出一类新的具有该效应的肽。不希望受任何理论的束缚，据信这类肽至少部分通过抑制nmdar与突触后密度95蛋白(psd-95)之间的相互作用来发挥作用(即psd-95抑制剂)。在此基础上，本申请的发明人以阿尔茨海默病为靶点对此类肽进行了测试并得到了理想的结果。本领域对于阿尔茨海默病的发病机制不断进行探索，并建立了多种理论，例如，神经元炎症过程在病理中的作用，以及淀粉样蛋白的形成原因及作用。但无论淀粉样蛋白是阿尔茨海默病病理启动的原因还是结果，从淀粉样蛋白到炎症反应，中间都要经历神经元凋亡过程。不希望受任何理论的束缚，申请人认为谷氨酸损伤途径是其中重要途径，nmdar-psd95是该通路的重要复合物，抑制该复合物形成，能一定程度抑制神经元凋亡并可能成为影响阿尔茨海默病病理进程的手段。因此，本申请提供了能有效用于预防、缓解和治疗阿尔茨海默病的药物和方法，为阿尔茨海默病患者症状改善和提高生存质量提供了新的选择。定义除非另外指明，本申请中所用的术语具有本领域技术人员通常理解的含义。本申请中对于氨基酸使用的单字母或三字母缩写遵循国际惯例。术语“嵌合肽”表示具有两个天然不彼此结合的组件肽的肽，所述两个组件肽可以作为融合蛋白或通过化学键彼此结合。术语“pdz结构域”是指约90个氨基酸的模块蛋白质结构域，其特征是对脑突触蛋白psd-95、果蝇(drosophila)分隔连接蛋白discs-large(dlg)和上皮紧密连接蛋白z01(z01)具有显著(例如至少60％)的序列同一性。pdz结构域也称作discs-large同源性重复(“dhrs”)和glgf重复。pdz结构域通常显示保留核心共有序列(doyle，d.a.，1996，cell85：1067-76)。示例性的含pdz结构域的蛋白质和pdz结构域序列在美国申请no.10/714，537中公开。术语“nmda受体”或“nmdar”是指已知与nmda相互作用的膜关联蛋白。这些受体可以是人或非人的(例如小鼠、大鼠、兔子和猴子等)。术语“特异性结合”是指两个分子(例如配体和受体)之间的结合，其特征是甚至在存在许多其他不同分子时，一种分子(配体)与另一种特异分子(受体)结合的能力，即在分子的异质混合物中显示一种分子对另一分子的优先结合的能力。配体与受体的特异性结合也如下被证明：存在过量未标记的配体时，经可检测标记的配体与受体的结合降低(即结合竞争实验)。统计学显著的是指p值<0.05，优选地<0.01，最优选地<0.001。术语“功能性变体”是指与母体具有相同或相近的生物学功能和性质的变体。作为非限制性的实例，“功能性变体”可以通过在母体中进行一处或多处保守型取代获得。术语“内化肽”也可称为穿膜肽，在蛋白质药物领域被广泛使用，其功能是促进与其结合的活性肽被细胞摄取和吸收。作为非限制性的一个实例，内化肽可以为tat肽，其中tat肽的一个非限制性实例为ygrkkrrqrrr(seqidno:2)。第一方面，本申请提供了含有氨基酸序列yeklldtei(seqidno:1)或其功能性变体的肽或包含所述肽的药物组合物在制备预防、缓解或治疗个体的阿尔茨海默病的药物中的用途。第二方面，本申请提供了预防、缓解或治疗阿尔茨海默病的方法，所述方法包括：向有需要的个体施用含有氨基酸序列yeklldtei或其功能性变体的肽或者包含所述肽的药物组合物。第三方面，本申请提供了含有氨基酸序列yeklldtei(seqidno:1)或其功能性变体的肽或包含所述肽的药物组合物，其用于治疗、改善或预防个体的阿尔茨海默病。所述肽在本申请中也被称为“活性肽”，其在本申请的嵌合肽中作为治疗活性部分。根据已有的研究，一些抑制nmdar与psd-95之间的相互作用的活性肽是基于nmdar的结构。例如，nmdar2b具有genbankid4099612，c末端20个氨基酸为fngssnghvyeklsslesdv和pl基序esdv。已有的一些活性肽选取了nmdar2b的c末端的部分氨基酸序列，从而与nmdar2b产生对psd-95的竞争性抑制。有研究认为上述肽中的esdv或lesdv区段在抑制nmdar与psd-95蛋白之间的相互作用中发挥重要作用。在不受任何理论束缚的情况下，本申请的发明人出人意料地发现，本文公开的活性肽yeklldtei(seqidno:1)中，其相对于上述nmdar2b的c末端氨基酸组成，不含有kl之后的ss两个残基，同时相对于pl基序增加了n端方向的yekl氨基酸序列，本申请证实这样的改变能够增强活性肽与pdz1/2结构域的相互作用。同时相对于yekl基序，其c端的ldtei可以进行变化，预期不影响活性肽的活性或有可能增加其活性。因此，在一些实施方案中，本申请提供的功能性变体为seqidno:1中的ldtei部分发生一处或多处保守型取代后产生的变体。在一些实施方案中，保守型取代选自d和e之间的取代，l、v和i之间的取代以及t和s之间的取代。在更具体的一些实施方案中，功能性变体为seqidno:1中的ldtei部分被替换为下述任一序列后产生的变体：ldtel、ldtev、ldtdi、ldtdl、ldtdv、ldsei、ldsel、ldsev、ldsdi、ldsdl、ldsdv、letei、letel、letev、letdi、letdl、letdv、vdtei、vdtel、vdtev、vdtdi、vdtdl、vdtdv、idtei、idtel、idtev、idtdi、idtdl、idtdv、ietei、ietel、ietev、ietdi、ietdl、ietdv。在一些实施方案中，本文所公开的功能性变体还包括与以上提到的肽具有至少60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、甚至更高的同一性的氨基酸序列。本领域已知，两种蛋白之间的“同一性”通过将一种蛋白的氨基酸序列和它的保守氨基酸取代的第二种蛋白的序列进行比对来确定。使用本领域技术人员公知的计算机算法和方法确定两种蛋白之间的同一性程度。两个氨基酸序列之间的同一性优选地通过利用blastp算法确定。在一些实施方案中，本文所公开的功能性变体包括与以上提到的肽相比，具有1、2、3、4、5或更多处的氨基酸残基的取代、缺失、添加和/或插入区别于上述公开的具体的肽。如上所述，功能性变体可以通过一个或多个取代、缺失、添加和/或插入区别于上述公开的具体的肽。这些变体可以是天然存在的或可以是合成产生的，例如，通过修饰一个或多个本文公开的上述肽序列并按照本文所述用本领域内公知的多种技术中的任何一种评估其生物活性。在一些实施方案中，肽为包含氨基酸序列yeklldtei(seqidno:1)或其功能性变体和内化肽的嵌合肽，所述内化肽能促进所述嵌合肽被细胞摄取。本领域技术人员应当理解，将活性肽和内化肽嵌合的目的主要在于使活性肽更好地到达作用靶点，因此，适用于本申请的内化肽并不局限于特定种类，只要能实现穿膜、内化的目的即可。本领域技术人员还应当理解，由于活性肽的作用靶点主要位于神经元细胞内部，因此能特异性地适合于神经元细胞的内化肽是优选的。在一些实施方案中，内化肽可以为tat肽。在一些实施方案中，tat肽的氨基酸序列为ygrkkrrqrrr(seqidno:2)。在一些实施方案中，嵌合肽包含氨基酸序列ygrkkrrqrrryeklldtei(seqidno:3)。应当理解，内化肽可以与活性肽通过酰胺键连接而作为融合肽，但是也可以通过其他合适的方式进行接合，例如化学键接合。两种组分的偶联可以通过偶联剂或缀合剂实现。大量这类试剂是可商业获得的，并可以参见s.s.wong，chemistryofproteinconjugationandcross-linking，crcpress(1991)。交联试剂的一些例子包括j-琥珀酰亚胺-3-(2-吡啶二硫代)丙酸盐(spop)或n，n'-(1，3-亚苯基)双马来酰亚胺；n，n’-亚乙基-双-(碘乙酰胺)或具有6到11个碳亚甲基桥的其他这类试剂(其它巯基相对特异)；和1，5-二氟-2，4-二硝基苯(其与氨基和酪氨酸基形成不可逆的连接)。其他交联试剂包括p，p’-二氟-m，m’-二硝基二苯砜(其与氨基和酚基形成不可逆的交联)；二乙胺代己酸二甲酯(其对氨基是特异的)；苯酚-1，4-二磺酰氯(其主要与氨基反应)；1，6-己二异氰酸酯或二异硫氰酸酯，或苯基偶氮-对-二异氰酸酯(其主要与氨基反应)；戊二醛(其与若干不同的侧链反应)和双重氮基联苯胺(其主要与酪氨酸和组氨酸反应)。此外，前文所述的肽能够任选地被衍生化(例如乙酰化、磷酸化和/或糖基化)以促进与抑制剂的亲合力，促进抑制剂跨越细胞膜被转运的能力，或促进稳定性。可通过固相合成或重组方法合成本申请的活性肽以及与内化肽融合的融合肽。可使用科学文献和专利文献中所述的多种方案和方法合成拟肽，所述科学文献和专利文献例如为organicsynthesescollectivevolumes，gilman等(编)johnwiley&sons，inc.，ny，al-obeidi(1998)mol.biotechnol.9:205-223；hruby(1997)curr.opin.chem.biol.1：114-119；0stergaard(1997)mol.divers.3:17-27；0stresh(1996)methodsenzymol.267:220-234。在一些实施方案中，本文公开的活性肽或嵌合肽可以以药物组合物的形式被施用。药物组合物可以通过常规的混合、溶解、制粒、制锭、研磨、乳化、包封、捕获或冻干方法制造。可以使用一种或多种生理学可接受的便于将活性肽或嵌合肽加工成可药用制剂的载体、稀释剂、赋形剂或辅料，以常规方式配制药物组合物。适当的配制依赖于选择的施用途径。在一些实施方案中，施用可以是肠胃外、静脉内、经口、皮下、动脉内、颅内、鞘内、腹膜内、局部、鼻内或肌内的。优选静脉内施用。在一些实施方案中，用于肠胃外施用的药物组合物优选地是无菌和基本等渗的。对注射而言，可以将活性肽或嵌合肽配制进水溶液中，优选地配制进生理学兼容的缓冲液例如hank’s溶液、ringer’s溶液，或生理盐水或乙酸缓冲液中(以减轻注射位点处的不适)。溶液可以含有配制剂例如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。或者，活性肽或嵌合肽可以是用于在使用前用合适的运载体(例如无菌无热源水)构建的粉末形式。对跨粘膜施用而言，在配制物中使用适合要穿透的屏障的穿透剂。该施用途径可被用于将化合物递送至鼻腔或用于舌下施用。在一些实施方案中，对经口施用而言，可以将活性肽或嵌合肽与可药用的载体一起配制为片剂、丸剂、锭剂、胶囊、液体、凝胶、糖浆、浆体、悬浮液等，用于由被治疗的患者经口摄入。对于口服固体配制物例如粉末、胶囊和片剂而言，合适的赋形剂包括填充剂例如糖，如乳糖、蔗糖、甘露醇和山梨糖醇；纤维素制剂例如玉米淀粉、小麦淀粉、稻淀粉、马铃薯淀粉、明胶、西黄蓍胶、甲基纤维素、羧丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和/或聚维酮(pvp)；制粒剂和粘合剂。如果需要，可以添加崩解剂，例如交联的聚乙烯吡咯烷酮、琼脂，或海藻酸或其盐，例如海藻酸钠。如果需要，可以使用标准技术对固体剂型进行糖包裹或肠溶衣包裹。对于口服液体制剂例如悬浮液、酏剂和溶液而言，合适的载体、赋形剂或稀释剂包括水、甘油、油、醇。另外，可以添加调味剂、防腐剂、着色剂等。除了先前所述的配制物以外，也可以将活性肽或嵌合肽配制成储存制剂。可以通过植入(例如皮下或肌内)或通过肌内注射来施用这类长效配制物。因此，例如可将化合物与合适的多聚体材料或疏水材料(例如配制为可接受的油中的乳剂)或离子交换树脂配制在一起，或配制为略溶的衍生物，例如配制为略溶的盐。或者，可以使用其他药物递送系统。可使用脂质体和乳剂递送嵌合肽。也可以使用某些有机溶剂例如二甲基亚砜。另外，可以使用持续释放的系统(例如含有治疗剂的固体聚合物的半渗透性基质)递送化合物。根据其化学性质，持续释放胶囊可释放嵌合肽数周直至超过100天。根据治疗试剂的化学性质和生物稳定性，可以使用用于蛋白质稳定的其他策略。在一些实施方案中，因为本文公开的活性肽或嵌合肽可含有带电的侧链或末端，所以它们可以作为游离酸或碱或作为可药用的盐包含在任何上述配制物中。可药用的盐是基本保留游离碱的生物活性并通过与无机酸反应而制备的盐。药物盐倾向于比相应的游离碱形式更易溶于水和其它质子溶剂。在一些实施方案中，剂量范围包括每kg患者体重0.001到20μmol活性肽或嵌合肽，任选地每kg患者体重0.03到3μmol活性肽或嵌合肽。在一些方法中，施用每kg患者体重0.1-20μmol活性肽或嵌合肽。在一些方法中，施用每kg患者体重0.1-10μmol活性肽或嵌合肽，更优选施用每kg患者体重约0.3μmol活性肽或嵌合肽。在其他情况下，剂量范围是每kg患者体重0.005到0.5μmol活性肽或嵌合肽。可以通过除以6.2来补偿不同的表面积：质量比，将每kg体重的剂量从大鼠转化为人。以克计，用于人的活性肽或嵌合肽的合适剂量可包括0.01到100mg/kg患者体重，或更优选0.1到30mg/kg患者体重或1到10mg/kg(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10mg/kg)。在一些实施方案中，施用的活性肽或嵌合肽的量取决于被治疗的受试者、受试者的体重、疾病的严重性、施用方式和开处方的医师的调节。在症状可检测时或甚至不可检测时可重复治疗。治疗可单独提供或者与其他药物组合提供。在一些实施方案中，本文公开的活性肽或嵌合肽的治疗上有效的剂量能够提供治疗益处而不引起重大的毒性。可以通过标准药物步骤在细胞培养物或实验动物中测定嵌合肽的毒性，例如通过测定ld50(使50％群体致死的剂量)或ld100(使100％群体致死的剂量)来实现。毒性效应和治疗效应的剂量比例是治疗指数。优选显示高治疗指数的嵌合肽或拟肽(见例如fingl等人，1975，在thepharmacologicalbasisoftherapeutics，第1章，第1页)。在一些实施方案中，药物组合物是预冻干制剂的形式，或冻干制剂的形式，或冻干制剂与水溶液相结合而获得的复原制剂的形式。应当理解，以上详细描述仅为了使本领域技术人员更清楚地了解本申请的内容，而并非意图在任何方面加以限制。本领域技术人员能够对所述实施方案进行各种改动和变化。实施例提供以下实施例是仅仅是对本申请的一些实施方案进行举例说明，没有任何限制的目的或性质。实施例1：活性肽分子的筛选根据已报道的研究结果，选取tat穿膜肽ygrkkrrqrrr(seqidno:2)，并将其与不同数目的氨基酸相连接，形成肽库。将肽库中的嵌合肽分子，分别与体外表达并纯化的pdz1/2结构域相互作用，根据相互作用力的强弱，对多肽进行初步筛选。固定的分子(配体)为pdz1/2蛋白，分子量：～20kd，浓度：2mg/ml；流动相的分子(分析物)：待筛选多肽，分子量：～2kd，浓度：10mg/ml。使用biacore3000仪器，cm5芯片进行固定。电泳缓冲液为pbs+0.005％吐温20。使用氨基偶联方法进行固定。配体的浓度为10μg/ml。固定缓冲液为10mm醋酸钠，ph4.0。固定量：1400ru，固定至流动细胞2。使用的流速为10μl/ml，配体进样1分钟。使用ph2.0+2.5的10mmgly作为再生液，以30μl/分钟的流速进行再生。进样时间为30s。使用下述条件进行动力学分析：对照通道：流动细胞1；电泳缓冲液为pbs；使用kineticanalysiswizard模式，浓度梯度为6.25n、12.5n、25n、50n、100n、200n、400nm；进样时间为1分钟；解离时间为2min；流速为30μl/分钟。用拟和软件biaevaluation4.1软件对数据进行拟合。拟和模型为1：1结合模型。解离常数kd值与作用力呈反比。通过筛选，获得了与pdz1/2结构域具有较强相互作用能力的嵌合肽，将其命名为p5，序列如下：p5:ygrkkrrqrrryeklldtei(seqidno:3)为了直接与已报道的研究中的类似嵌合肽进行比较，引入了对照嵌合肽na-1，序列如下：na-1：ygrkkrrqrrrklssiesdv此外，通过比较p5与na-1的结构差异，另外引入了在嵌合肽na-1的活性肽的n端加入ye两个残基的嵌合肽ye-na-1，序列如下：ye-na-1：ygrkkrrqrrryeklssiesdv将嵌合肽na-1、ye-na-1和p5同时进行上文所述的与pdz1/2结构域相互作用的测试，结果如下文表1所示：表1.三种嵌合肽与pdz1/2结构域相互作用力检测嵌合肽na-1ye-na-1p5kd(m)7.53e-085.44e-082.99e-08如表1所示，相比于对照嵌合肽na-1，嵌合肽ye-na-1及p5与pdz1/2结构域相互作用力更强，并且p5的作用性质更佳。因此，据发明人的推测，活性肽的n端额外的ye两个氨基酸残基对多肽与pdz1/2结构域的相互作用有一定的增强作用。此外，p5相对于ye-na-1的羧基端减少了两个疏水性较弱的丝氨酸(ss)，据发明人的推测，这可能因此进一步增加了多肽与pdz1/2结构域的相互作用。以下实验中对嵌合肽p5进行进一步地测试，并在部分实验中将na-1和ye-na-1作为对照。实施例2：pull-down实验检测p5与pdz1/2结构域的相互作用为证明p5能与pdz1/2结构域相互作用，进行pull-down实验。用100μl的his珠子和1ml的mcac-0缓冲液将柱子平衡5min。在4℃震荡。将混合物在4℃，以5000g离心1分钟，弃上清。向混合物中加入1mgpdz1/2蛋白，并用缓冲液补齐至1ml。在4℃，将所述混合物旋转结合1小时。将所述混合物在4℃，以5000g离心1分钟，弃上清。用1ml的mcac-0缓冲液清洗3次，每次5分钟(在4℃，震荡洗涤)。向混合物中加入1mgp5蛋白，并用缓冲液补齐至1ml。在4℃，将所述混合物旋转结合2小时。将所述混合物在4℃，以5000g离心1分钟，弃上清。用1ml裂解液进行清洗3次，每次5分钟(在4℃，震荡洗涤)。清洗之后加入20μlmcac-300。离心，取洗脱液进行sds-page检测。实验结果显示于图1。如图1所证实，嵌合肽p5的洗脱条带中同时包含p5和pdz1/2结构域两者，由此证实嵌合肽p5能够结合pdz1/2结构域。实施例3：急性毒性试验用大鼠进行急性毒性试验。结果表明：在200mg/kg体重的给药剂量下，p5对大鼠无致死作用和其它明显的毒副作用。实施例4：p5肽对治疗阿尔茨海默病的效果i.仪器本实施例所使用的仪器如下：1056189双头冷光源(北京众实迪创科技发展有限责任公司)。tj-4a微量注射泵(北京众实迪创科技发展有限责任公司)zs-001morris水迷宫视频分析系统(北京众实迪创科技发展有限责任公司)zs-gsz颅骨钻孔仪(北京众实迪创科技发展有限责任公司)ii.材料本实施例所使用的材料如下：生理盐水(石家庄四药有限公司，国药准字h13023200)；多肽(p5、na-1，由杭州中肽有限公司制备)；水合氯醛(国药集团化学试剂有限公司，批号20150303)；庆大霉素(华中药业股份有限公司，国药准字h42021503)；aβ淀粉样蛋白(货号a1075，购自sigma(中国))；牙科水泥(北京众实迪创科技发展有限责任公司)；盐酸美金刚(北京索来宝生物科技有限公司)。iii.实验动物本实施例使用的实验动物为240g～280gsd大鼠，购自化阜康成有限公司。iv.方法和步骤1.大鼠筛选和分组挑选80只240～280克雄性sd大鼠作为实验鼠，分成7组，每组9至11只，7组分别为：正常组、模型组(ad组)、p5三个剂量组(尾静脉注射1mg/kg、3mg/kg、10mg/kg)、na-1(尾静脉注射3mg/kg，肽药物对照)、美金刚组(灌胃2mg/kg，化学药对照)。2.造模1)sd大鼠腹腔注射10％水合氯醛溶液麻醉，用量为4.5ml/kg。2)将大鼠头部固定于脑立体定位仪，手术部位碘酒+酒精棉球常规消毒，备皮。3)弯头剪刀剪开表皮，钝器分离皮肤，皮下组织和骨膜，暴露颅骨，找到前囟位置。4)标记前囟后3mm，左右2mm位置各标记一个位置，用zs-gsz颅骨钻孔仪打磨标记处颅骨至足够薄，共两处，尽量不要击穿，使用10μl微量注射器点破，然后继续向下进针3.5μm。5)注射aβ淀粉样蛋白，注射参数2.5μl/5min，注射后留针5分钟，然后缓慢退针，aβ淀粉样蛋白为1mg/ml。6)牙科水泥封闭颅骨钻孔处，皮针+4.0手术缝合线缝合伤口，大腿肌肉注射庆大霉素1mg/kg，商品化原液稀释三倍。7)以手术当天为第一天，第10天开展连续给药处理。3.给药与测试本研究中采用morris水迷宫(morriswatermaze)实验。该测试是强迫实验动物游泳，学习寻找隐藏在水中平台的实验，主要用于测试实验动物对空间位置感和方向感(空间定位)的学习记忆能力，被广泛应用于阿尔茨海默病的药物评价研究中。每组建模10天后，开始连续给药14天，每天一次，给药结束后立即开展水迷宫测试，连续4天测试上台潜伏期，入水象限为4213、1234、2413、2143，第5天撤去平台开展穿台实验，入水象限为4321。4.潜伏期实验不同分组的每只大鼠每次测试从同一个位置入水，入水象限如“3.给药与测试”中所述。大鼠入水时，操作人提大鼠尾巴，鼠头朝壁缓慢放入水中，大鼠入水后找到平台并停留2秒，实验停止，所耗费时间为潜伏期，超过120秒仍未找到平台也记作120秒。定期补充水，保持平台距离水面2cm，每次测试开始时间点距下次测试开始时间点1分钟。5.穿台实验大鼠按照“3.给药与测试”中所示象限连续4天水迷宫潜伏期测试后，开始撤去水迷宫中的平台，记录大鼠入水后的运动轨迹，与平台位置相交一次记为一次穿台，记录每只大鼠120秒内穿台总次数，入水象限4321。v.统计学分析每只大鼠每天在4个象限入水4次，连续4天测试，最终将得到的16个数字取平均值，为该只大鼠的最终潜伏期，第5天每只大鼠在4个象限入水4次，仅测试一天，最终将得到的4个数字取平均值，为该只大鼠的穿台次数。使用excel自带的t-test函数(尾数为2，类型为3)分别比较模型组与正常组的上台潜伏期和穿台次数。p<0.05认为有统计学差异，p<0.01则认为有显著统计学差异。如果正常组和模型组(ad组)在潜伏期和穿台次数均有统计学差异，认定造模成功。再分别比较模型组与各给药分组上台潜伏期和穿台次数。p<0.05认为有统计学差异，p<0.01则认为有显著统计学差异。如果处理组和模型组(ad组)在潜伏期或穿台次数存在统计学差异，认定处理组具有治疗效果。vi.实验结果1.不同给药组对模型大鼠逃避潜伏期的作用各组大鼠的逃避潜伏期统计结果参见表1和图2。结果显示：正常组和ad组之间p<0.05(图中未标记)，说明造模成功。p5的三个剂量组(1mg/kg、3mg/kg、10mg/kg)和na-1组与ad组比较，p<0.05，说明在本项测试中展现了功效，并且这四组的逃避潜伏期基本与正常组相当。化学药对照美金刚组在本项测试中未表现出功效。2.各处理组对大鼠穿越平台测试的作用各组大鼠的穿越平台次数统计参见表2和图3。结果显示：正常组和ad组之间p<0.05(图中未标记)，说明造模成功。p5的两个剂量组(3mg/kg、10mg/kg)与ad组比较，p<0.05，说明在本项测试中产生治疗功效，并且这两组的穿越平台次数基本与正常组相当。化学药对照美金刚组与ad组比较，p<0.01，说明也产生治疗功效。p5的两个有效剂量组(3mg/kg和10mg/kg)与美金刚组之间无统计学差异。肽对照na-1组在本项测试中未表现出功效。vii.讨论p5的两个剂量组(3mg/kg和10mg/kg)在潜伏期和穿台次数两项测试均与ad组有统计学差异(p<0.05)，并且实际结果与正常组相当，表现出治疗功效。但是同样为3mg/kg的肽对照na-1组，仅在潜伏期测试上表现出功效，而在穿台次数测试中没有效果。盐酸美金刚是市售的一款治疗阿尔茨海默病的药物，其仅在穿台次数测试上表现出功效，而在潜伏期测试中没有效果。综合本研究的结果，本申请的示例性肽p5在治疗阿尔茨海默病中具有良好的应用前景。本说明书中引用的所有出版物和专利文献引入本文作为参考，如同每个出版物或专利被分别明确指明引入本文作为参考。在不偏离本申请公开的实质和范围的情况下，可对本申请公开的各实施方案进行多种改变和用等同物替换。除非上下文中另有说明，否则本公开的实施方案的任何特征、步骤或实施方案都可以与任何其他特征、步骤或实施方案组合使用。序列表<110>拜西欧斯（北京）生物技术有限公司<120>预防、缓解或治疗阿尔茨海默病的肽及其应用<130>17c13031cn<160>3<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>9<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<400>1tyrglulysleuleuaspthrgluile15<210>2<211>11<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<400>2tyrglyarglyslysargargglnargargarg1510<210>3<211>20<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<400>3tyrglyarglyslysargargglnargargargtyrglulysleuleu151015aspthrgluile20当前第1页12