本发明涉及生物医药
技术领域：
，尤其涉及一种纳豆激酶和纳豆抗菌肽混合制剂及其制备方法和应用。
背景技术：
：纳豆由黄豆通过纳豆菌(枯草杆菌)发酵制成豆制品，具有黏性，气味较臭，味道微甜，不仅保有黄豆的营养价值、富含维生素k2、提高蛋白质的消化吸收率，更重要的是发酵过程产生了多种生理活性物质，具有溶解体内纤维蛋白及其他调节生理机能的保健作用。纳豆提取物，指的是从纳豆中提取出的有效物质，包括纳豆激酶、纳豆异黄酮、皂青素和维生素k2等；其中皂青素，能改善便秘，降低血脂，预防大肠癌、降低胆固醇、软化血管、预防高血压和动脉硬化，抑制艾滋病病毒等功能；纳豆异黄酮可清除体内致癌物质、提高记忆力、护肝美容、延缓衰老等有明显效果，并可提高食物的消化率；纳豆激酶具有溶解血栓，降低血粘度，改善血液循环，软化和增加血管弹性等作用。但是，现有技术中对纳豆提取物的开发通常是对纳豆提取物中单一成分的提取与利用，而缺少对纳豆提取物的综合利用。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种纳豆激酶和纳豆抗菌肽混合制剂及其制备方法和应用，该混合制剂能够提高兽用疫苗的免疫效果。为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：本发明提供了一种纳豆激酶和纳豆抗菌肽混合制剂的制备方法，包括以下步骤：1)将纳豆和水混合，进行研磨，过滤，得到研磨滤液；2)在步骤1)所述研磨滤液中加入固体硫酸铵，静置，取第一上清液，灭菌，得到纳豆抗菌肽溶液；3)将纳豆和磷酸盐缓冲液混合，进行研磨，得到的研磨物和磷酸盐缓冲液混合，浸提，离心，取第二上清液；4)在步骤3)所述第二上清液中加入硫酸铵水溶液进行混合，静置，离心，取沉淀物，得到纳豆激酶；5)将步骤2)所述纳豆抗菌肽溶液与步骤4)所述纳豆激酶进行混合，过滤除菌，调节ph值至7.0，得到纳豆激酶和纳豆抗菌肽的混合制剂；所述步骤1)～2)和步骤3)～4)之间没有时间顺序限制。优选的，步骤1)所述纳豆和水的质量比为1～3:1。优选的，步骤3)中所述研磨的温度为1～5℃。优选的，步骤3)中所述磷酸盐缓冲液的温度为1～5℃；所述磷酸盐缓冲液的ph值为7.5～8.0。本发明还提供了上述方案所述制备方法制备得到的纳豆激酶和纳豆抗菌肽混合制剂。本发明还提供了上述方案所述混合制剂在制备提高机体免疫力的药物中的应用。本发明还提供了上述方案所述混合制剂在抑制细菌中的应用。本发明还提供了上述方案所述混合制剂作为疫苗增强剂的应用。优选的，所述疫苗为禽类疫苗或畜类疫苗。优选的，所述混合制剂与畜类疫苗的比例为2～5ml:1～3头份；所述混合制剂与禽类疫苗的比例为0.1～1ml:1～3羽份。本发明的有益效果：本发明提供了一种纳豆激酶和纳豆抗菌肽混合制剂的制备方法，该方法制备获得的纳豆激酶和纳豆抗菌肽混合制剂具有抑制细菌、提高机体免疫力以及提高兽用疫苗的免疫效果的作用。经过实验验证，本发明制备获得的纳豆激酶和纳豆抗菌肽的混合制剂对大肠杆菌、沙门氏菌抑菌、金黄色葡萄球菌和绿脓杆菌都具有抑菌效果，并且与庆大霉素相比，在抑制大肠杆菌和沙门氏菌的试验中抑菌效果相当。并且，本发明的纳豆激酶和纳豆抗菌肽的混合制剂，使用安全且有利于增强猪圆环病毒灭活疫苗和鸡大肠杆菌病灭活疫苗的免疫效果。具体实施方式本发明提供了一种纳豆激酶和纳豆抗菌肽混合制剂的制备方法，包括以下步骤：1)将纳豆和水混合，进行研磨，过滤，得到研磨滤液；2)在步骤1)所述研磨滤液中加入固体硫酸铵，静置，取第一上清液，灭菌，得到纳豆抗菌肽溶液；3)将纳豆和磷酸盐缓冲液混合，进行研磨，得到的研磨物和磷酸盐缓冲液混合，浸提，离心，取第二上清液；4)在步骤3)所述第二上清液中加入硫酸铵水溶液进行混合，静置，离心，取沉淀物，得到纳豆激酶；5)将步骤2)所述纳豆抗菌肽溶液与步骤4)所述纳豆激酶进行混合，过滤除菌，调节ph值至7.0，得到纳豆激酶和纳豆抗菌肽的混合制剂；所述步骤1)～2)和步骤3)～4)之间没有时间顺序限制。本发明将纳豆和水混合，进行研磨，过滤，得到研磨滤液；所述纳豆和水的质量比优选为1～3:1，更优选为2:1；所述研磨的时间优选为5～10min；本发明对所述研磨的温度没有特殊限制；所述研磨的设备优选为匀浆器或组织研磨仪；所述匀浆器优选为玻璃匀浆器，更优选为50ml玻璃匀浆器。本发明中，所述过滤优选为采用纱布过滤；所述纱布的滤孔孔径优选为0.4～0.5μm，更优选为0.45μm；所述纱布的层数优选为4～6层，更优选为5层。本发明在过滤后，优选的还包括将过滤得到的滤渣和水混合，浸提，过滤，得到浸提滤液后与上述方案所述研磨滤液合并，得到合并滤液；所述滤渣和水的质量比优选为1～3:1，更优选为2:1；所述浸提的温度优选为1～5℃，更优选为4℃；所述浸提的时间优选为0.5～1.5h，更优选为1h。得到合并滤液后，本发明在所述合并滤液中加入固体硫酸铵，静置，取第一上清液，灭菌，得到纳豆抗菌肽溶液；所述固体硫酸铵的加入量优选为使合并滤液中硫酸铵的饱和度达到60％～65％；所述静置的时间优选为12～18h，更优选为14～16h；所述静置的温度优选为1℃～5℃，更优选为4℃；所述灭菌的方式优选为高压灭菌和/或过滤除菌；所述高压灭菌的温度优选为115～121℃；所述高压灭菌的时间优选为15～20min；所述过滤除菌的滤膜孔径优选为0.1μm或0.22μm。本发明在得到第一上清液后，优选的还包括在第一上清液中加入固体硫酸铵，静置，再次取上清液，灭菌；所述固体硫酸铵的加入量优选为使第一上清液中硫酸铵的饱和度达到60％～65％。本发明将纳豆和磷酸盐缓冲液混合，进行研磨，得到的研磨物和磷酸盐缓冲液混合，浸提，离心，取第二上清液；所述磷酸盐缓冲液的ph值优选为7.5～8.0，更优选为7.8；所述磷酸盐缓冲液的温度优选为1～5℃，更优选为4℃。本发明中，所述磷酸盐缓冲液优选的由以下方法制备获得：将磷酸氢二钾5.59g，磷酸二氢钾0.41g溶于1000ml纯化水，依次过滤除菌，高压灭菌；本发明对所述过滤除菌和高压灭菌的参数没有特殊限制，采用本领域常规方法即可。本发明中，所述纳豆和磷酸盐缓冲液质量比优选为1～3:1，更优选为2:1；所述研磨的温度优选为1～5℃，更优选为4℃；所述研磨的时间优选为5～10min，更优选为8min；所述研磨的设备优选为研钵或组织研磨仪；所述研钵或组织研磨仪优选的预冷至4℃；本发明中设置研磨的温度为1～5℃的作用是避免酶失活。本发明中，所述研磨物和磷酸盐缓冲液的体积比优选为0.5～1.5:2，更优选为1:2；所述浸提的温度优选为1～5℃，更优选为4℃；所述浸提的时间优选为9～16h，更优选为12～14h；所述离心的转速优选为4000～6000r/min，更优选为5000r/min；所述离心的时间优选为5～10min。得到第二上清液后，本发明在第二上清液中加入硫酸铵水溶液进行混合，静置，离心，取沉淀物，得到纳豆激酶；所述硫酸铵水溶液中硫酸铵的饱和度优选为57％～63％，更优先为60％；所述加入硫酸铵水溶液的过程优选的伴随搅拌；所述静置的时间优选为1～5℃，更优选为4℃；所述静置的时间优选为9～16h，更优选为12～14h；所述离心的转速优选为4000～6000r/min，更优选为5000r/min；所述离心的时间优选为5～10min，更优选为8min。得到纳豆抗菌肽溶液和纳豆激酶后，将纳豆抗菌肽溶液与纳豆激酶进行混合，过滤除菌，调节ph值至7.0，得到纳豆激酶和纳豆抗菌肽的混合制剂；所述过滤除菌的滤膜孔径优选为0.1μm或0.22μm；所述调节ph值的试剂优选为naoh水溶液。本发明还提供了上述方案所述制备方法制备得到的纳豆激酶和纳豆抗菌肽混合制剂。本发明还提供了上述方案所述混合制剂在制备提高机体免疫力的药物中的应用。本发明还提供了上述方案所述混合制剂在抑制细菌中的应用；所述细菌优选的包括大肠杆菌和沙门氏菌。本发明还提供了上述方案所述混合制剂作为疫苗增强剂的应用；所述疫苗为禽类疫苗或畜类疫苗；所述混合制剂与畜类疫苗的比例优选为2～5ml:1～3头份；所述混合制剂与禽类疫苗的比例优选为0.1～1ml:1～3羽份；所述畜类疫苗优选为猪圆环病毒灭活疫苗；所述禽类疫苗优选为鸡大肠杆菌病灭活疫苗。本发明还提供了上述方案所述混合制剂作为疫苗增强剂的应用；所述禽类为1月龄鸡；所述畜类为12～15日龄猪；所述混合制剂与禽类或畜类疫苗配合使用方法优选为根据所述比例，用混合制剂稀释禽类冻干疫苗或畜类冻干疫苗、或者与禽类液体疫苗或畜类液体疫苗充分混合后通过注射、饮水、点眼滴鼻等途径接种疫苗。下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。实施例1一种纳豆激酶和纳豆抗菌肽混合制剂的制备方法1.将市售的500g纳豆加入500ml蒸馏水中，用组织研磨仪充分研磨，纱布过滤，得到研磨滤液和滤渣；2.按滤渣：蒸馏水＝1:1在滤渣中加蒸馏水，在4℃的条件下重复浸提2次，每次浸提的时间为1h，得到浸提滤液；3.将研磨滤液和浸提滤液合并，加入50g固体硫酸铵，4℃静置12h，收集第一上清液；第一上清液中再次加入50g固体硫酸铵，4℃静置12h，收集上清液，于121℃高压灭菌20min，过滤即得纳豆抗菌肽溶液；4.将市售的500g纳豆加入500ml预冷的ph＝7.8的磷酸盐缓冲液缓冲液浸提，在预冷的组织研磨仪中研磨10min，得到研磨物；5.在研磨物中加入2倍体积的预冷ph＝7.5的磷酸盐缓冲液低温浸提，4℃冰箱放置过夜，5000r/min离心10min，弃沉淀，取第二上清液；6.将第二上清液在4℃、搅拌条件下加入饱和度为60％的硫酸铵溶液，充分混合后放置4℃冰箱，沉降，过夜，次日4℃，5000r/min离心10min，去上清液，取沉淀即得纳豆激酶；7.将纳豆激酶，用所得的纳豆抗菌肽溶液溶解，充分混和，再经0.1μm除菌过滤筛除菌，调节ph值为7.0，即得纳豆激酶和纳豆抗菌肽混合制剂。实施例2一种纳豆激酶和纳豆抗菌肽混合制剂的制备方法1.将市售的1500g纳豆加入500ml蒸馏水中，用组织研磨仪充分研磨，纱布过滤，得到研磨滤液和滤渣；2.按滤渣：蒸馏水＝3:1在滤渣中加蒸馏水，在4℃的条件下重复浸提2次，每次浸提的时间为1h，得到浸提滤液；3.将研磨滤液和浸提滤液合并，加入80g固体硫酸铵，静置15h，收集第一上清液；第一上清液中再次加入80g固体硫酸铵，静置15h，收集上清液，于121℃高压灭菌20min，过滤即得纳豆抗菌肽溶液；4.将市售的1500g纳豆加入500ml预冷的ph＝7.8的磷酸盐缓冲液缓冲液浸提，在预冷的组织研磨仪中研磨10min，得到研磨物；5.在研磨物中加入2倍体积的预冷ph＝7.8的磷酸盐缓冲液低温浸提，4℃冰箱放置过夜，5000r/min离心10min，弃沉淀，取第二上清液；6.将第二上清液在4℃、搅拌条件下加入饱和度为60％的硫酸铵溶液，充分混合后放置4℃冰箱，沉降，过夜，次日4℃，5000r/min离心10min，去上清液，取沉淀即得纳豆激酶；7.将纳豆激酶，用所得的纳豆抗菌肽溶液溶解，充分混和，再经0.1μm除菌过滤筛除菌，调节ph值为7.0，即得纳豆激酶和纳豆抗菌肽混合制剂。实施例3对实施例1制备的纳豆激酶和纳豆抗菌肽混合制剂进行质量检验①性状检验通过直接肉眼观察为淡黄色或微黄色透明液体。②ph值测定根据现行《中国兽药典》附录进行测定，ph值为7.0。③蛋白质定性检验取样2.0ml加入20％磺基水杨酸2.0ml通过直接肉眼观察，应为无浑浊沉淀，反应为阴性。④蛋白质含量测定根据现行《中国兽药典》附录“福林酚法”进行测定，蛋白质含量应不低于1.8mg/ml。⑤核糖含量测定根据现行《转移因子溶液国家药品标准》中“核糖测定方法”进行测定，核糖含量应不低于40μg/ml。⑥无菌检验根据现行《中国兽药典》附录进行测定，应无菌生长。⑦细菌内毒素检验根据现行《中国兽药典》附录“细菌内毒素检测法”进行测定，应不超过10eu/ml。⑧支原体检验根据现行《中国兽药典》附录“支原体检验”进行测定，液体培养基应无ph变化，琼脂固体平板无典型的“煎蛋”状支原体菌落。⑨热源检验根据现行《中国兽药典》附录“热源检查法”进行检验，家兔耳缘静脉注射纳豆激酶和纳豆抗菌肽的混合制剂，家兔的体温升高应不高2℃。⑩异常毒性检验根据现行《中国兽药典》附录“异常毒性检查法”进行检验，小鼠腹腔注射纳豆激酶和纳豆抗菌肽的混合制剂，48h内全部小鼠应均健活。制备的纳豆激酶和纳豆抗菌肽混合制剂进行质量检验结果，见表1表1制备的纳豆激酶和纳豆抗菌肽混合制剂进行质量检验结果检验项目结果性状微黄色透明液体ph值7.0无菌检验无菌生长支原体检验液体培养基无ph变化，固体平板无典型的“煎蛋”状支原体菌落，无支原体污染热源检验阴性异常毒性检验阴性，48h内全部小鼠均健活蛋白质定性检验阴性，肉眼观擦无浑浊沉淀蛋白质含量测定2.3mg/ml细菌内毒素检验4eu/ml核糖含量测定49μg/ml由表1结果可知，纳豆激酶和纳豆抗菌肽的混合制剂性状为微黄色透明液体；ph值为7.0；无菌生长和无支原体污染；热源检验、异常毒性检验和蛋白质定性检验均为阴性；蛋白质含量测定为2.3mg/ml；细菌内毒素检验为4eu/ml；核糖含量测定49μg/ml。综上所述，纳豆激酶和纳豆抗菌肽的混合制剂经全面检验均符合规定。实施例4实施例1制备的纳豆激酶和纳豆抗菌肽混合制剂抑菌效果1.采用滤纸片方法对实施例1制备的纳豆激酶和纳豆抗菌肽混合制剂进行抑菌效果测定，所用指示菌为沙门氏菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、曲霉菌、白色念珠菌、绿脓杆菌；结果见表2。表2中：“++++”表示抑菌效果很好，抑菌圈在25mm以上；“+++”表示抑菌效果较好，抑菌圈在15mm以上；“++”表示抑菌效果一般，抑菌圈在5mm以上；“+”表示抑菌效果不好，抑菌圈小于5mm，“-”表示没有抑菌效果，没有抑菌圈。表2纳豆激酶和纳豆抗菌肽的混合制剂进行抑菌效果由表2结果可知，纳豆激酶和纳豆抗菌肽的混合制剂对大肠杆菌、沙门氏菌抑菌、金黄色葡萄球菌和绿脓杆菌都具有抑菌效果，并且与庆大霉素相比，在抑制大肠杆菌和沙门氏菌的试验中抑菌效果相当。2.采用96孔反应板，用微量肉汤二倍稀释法测定纳豆激酶和纳豆抗菌肽对受试菌的mic值；采用肉汤稀释棋盘法对实施例1制备的纳豆激酶和纳豆抗菌肽进行联合药敏试验fic指数测定与结果判定，根据测得纳豆激酶和纳豆抗菌肽对受试菌的mic值，以4倍、2倍、1倍、0.5倍、0.25倍浓度分别进行联合，并设纳豆激酶、纳豆抗菌肽对照及细菌对照，测定联合用药对沙门氏菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和绿脓杆菌的抗菌效果。以部分抑菌浓度(fic)指数为联合药敏试验的判断依据，判断标准：fic≤0.5为协同作用，5<fic≤1为相加作用，1<fic≤2为无关作用，fic＞2为拮抗作用。fic＝(甲药联用mic/甲药单用mic)+(乙药联用mic/乙药单用mic)。结果见表3。表3纳豆激酶和纳豆抗菌肽对质控菌及受试菌的mic值和联合用药的药敏试验由表3可知，纳豆激酶和纳豆抗菌肽混合制剂对沙门氏菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和绿脓杆菌的fic指数分别为0.375、0.375、0.25和0.5，即产生协同作用。实施例5纳豆激酶和纳豆抗菌肽的混合制剂对兽用疫苗免疫效果的影响1.将实施例1制备的纳豆激酶和纳豆抗菌肽的混合制剂和猪圆环病毒灭活疫苗接种健康易感猪，设单独免疫猪圆环病毒灭活疫苗组，注射猪圆环病毒灭活疫苗2头份/头；单独接种纳豆激酶和纳豆抗菌肽的混合制剂组，注射纳豆激酶和纳豆抗菌肽的混合制剂2ml/头；同时接种纳豆激酶和纳豆抗菌肽的混合制剂及猪圆环病毒灭活疫苗组，注射纳豆激酶和纳豆抗菌肽的混合制剂1ml/头及猪圆环病毒灭活疫苗1头份/头和非免疫对照组。在注射后14d、21d、28d后分别采血检测血清中和抗体效价，以此评价纳豆激酶和纳豆抗菌肽的混合制剂对猪圆环病毒灭活疫苗免疫效果的影响。试验结果参见表4。表4猪圆环病毒血清抗体效价测定结果注：与单独免疫猪圆环病毒灭活疫苗组相比：△p＜0.05，△△p＜0.01；与非免疫对照组相比：*p＜0.05，**p＜0.01。表4结果显示，纳豆激酶和纳豆抗菌肽的混合制剂和猪圆环病毒灭活疫苗接种健康易感猪均健活；单一注射免疫猪圆环病毒灭活疫苗血清中和抗体在1.4～1.9之间，同时接种纳豆激酶和纳豆抗菌肽的混合制剂及猪圆环病毒灭活疫苗血清中和抗体在2.1～2.5之间。说明同时接种纳豆激酶和纳豆抗菌肽的混合制剂及猪圆环病毒灭活疫苗显著提高了猪圆环病毒血清抗体的效价。非免疫对照血清中和抗体在0.3～0.8之间，单独接种纳豆激酶和纳豆抗菌肽的混合制剂血清中和抗体在1.1～1.4之间，说明接种纳豆激酶和纳豆抗菌肽的混合制剂能够减缓猪体内血清中和抗体的消减。由此可见，本发明的纳豆激酶和纳豆抗菌肽的混合制剂，使用安全且有利于增强猪圆环病毒灭活疫苗免疫效果。2.将本发明的纳豆激酶和纳豆抗菌肽的混合制剂和鸡大肠杆菌病灭活疫苗接种健康易感雏鸡，设单独免疫鸡大肠杆菌病灭活疫苗组，注射鸡大肠杆菌病灭活疫苗2羽份/羽；同时接种纳豆激酶和纳豆抗菌肽的混合制剂及猪圆环病毒灭活疫苗组，注射纳豆激酶和纳豆抗菌肽的混合制剂1ml/羽及猪圆环病毒灭活疫苗1羽份/羽和非免疫对照组。在注射后不同时间采血检测血清中和抗体效价，二免一周后，进行攻毒，观察其攻毒保护效果，以此评价纳豆激酶和纳豆抗菌肽的混合制剂对鸡大肠杆菌病灭活疫苗免疫效果的影响。试验结果参见表5。表5鸡大肠杆菌病抗体效价测定结果和攻毒保护结果表5结果显示，攻毒前纳豆激酶和纳豆抗菌肽的混合制剂和鸡大肠杆菌病灭活疫苗接种健康易感鸡均健活；同时接种纳豆激酶和纳豆抗菌肽的混合制剂及鸡大肠杆菌病灭活疫苗血清中和抗体高于单独免疫鸡大肠杆菌病灭活疫苗血清中和抗体。从攻毒保护结果来看，同时接种纳豆激酶和纳豆抗菌肽的混合制剂及鸡大肠杆菌病灭活疫苗保护率高于单独免疫鸡大肠杆菌病灭活疫苗保护率。可见本发明的纳豆激酶和纳豆抗菌肽的混合制剂，使用安全且有利于增强鸡大肠杆菌病灭活疫苗免疫效果。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。当前第1页12