一种一氧化氮气体响应脂质体及其制备方法和应用与流程

本发明涉及刺激响应领域，具体涉及一种一氧化氮气体响应脂质体及其制备方法和应用。

背景技术：

近年来，随着气体治疗被越来越多的人关注，气体响应性材料在生物化学界以及材料界受到广泛关注。利用气体治疗过程中产生气体这一优势，设计气体响应性药物运输材料体系达到气体治疗和药物治疗相结合的更优治疗效果。同时利用气体响应达到气体治疗和药物治疗的空间间隔效应。例如最近的化疗研究强烈要求减轻癌细胞中的多药耐药性(mdr)。癌细胞的mdr来自它们的质膜p-糖蛋白(p-gp)转运蛋白的过表达，其积极地增加药物流出并限制抗癌剂的有效性。因此，迫切需要一种极大地改善细胞内药物积累和mdr肿瘤细胞对药物敏感性的方法。癌症细胞对化疗药物的耐药性可以通过暴露于一氧化氮(no)来逆转，一氧化氮是一种可以降低其p-gp表达水平的气态分子信使。然而，使用no作为治疗剂，其具有气态和极短的半衰期的缺点。因此，开发含有释放no的供体的载体系统，并进行no响应释放试剂，其支持受控和延长的no释放以调节p-gp介导的mdr的逆转，是非常有必要的。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明的目的是提供一种可装载药物等小分子的一氧化氮气体响应脂质体及其制备方法和应用，所述气体响应脂质体能够对气体进行响应。

为了实现上述目的，本发明的技术方案具体如下：

本发明提供一种一氧化氮气体响应脂质体，其包括：胆固醇、大豆卵磷脂、磷脂-聚乙二醇2000和一氧化氮气体响应小分子脂质；

所述一氧化氮气体响应小分子脂质的结构式如下：

在上述技术方案中，优选所述胆固醇、大豆卵磷脂、磷脂-聚乙二醇2000和一氧化氮气体响应小分子脂质的摩尔比为31～34:57～60:2:3～10；最优选所述胆固醇、大豆卵磷脂、磷脂-聚乙二醇2000和一氧化氮气体响应小分子脂质的摩尔比为33：59：2：6。

在上述技术方案中，所述一氧化氮气体响应脂质体还包括产生no气体的供体精氨酸(l-arg)、以及中空介孔纳米材料金@硫化铜(au@cus)；所述中空介孔纳米材料金@硫化铜(au@cus)是用于产生活性氧(ros)和l-arg反应生成no气体以用于后续响应。

在上述技术方案中，所述一氧化氮气体响应脂质体包覆于au@cus表面，供体l-arg装载入au@cus内部。

使用近红外光(nir)进行激发，使得au@cus产生ros与内部装载的l-arg反应产生no气体，和au@cus表面的一氧化氮气体响应脂质体反应，打开通道，成功释放no或者其他小分子。

在上述技术方案中，所述供体l-arg还可以替换为s-亚硝基硫醇、rbs:nafe4s3(no)7化合物、bnn6或者lyso-ru-no。

本发明还提供一种一氧化氮气体响应脂质体的制备方法，包括以下步骤：

将胆固醇、大豆卵磷脂、磷脂-聚乙二醇2000和一氧化氮气体响应小分子脂质混合溶于有机溶剂置于圆底烧瓶中，用真空旋蒸仪旋干，在烧瓶内壁上得到脂质薄膜。

在上述技术方案中，优选所述有机溶剂为按2：1体积比配置的氯仿和甲醇的混合溶液。

本发明所述的一氧化氮气体响应脂质体可以进行装载，也可以对纳米粒子表面包裹。进而本发明还提供一种包覆有上述的一氧化氮气体响应脂质体的纳米材料的制备方法，包括以下步骤：

a.将胆固醇、大豆卵磷脂、磷脂-聚乙二醇2000和一氧化氮气体响应小分子脂质混合溶于有机溶剂置于圆底烧瓶中，用真空旋蒸仪旋干，在烧瓶内壁上得到脂质薄膜；

b.向步骤a的烧瓶中加入装载有产生no气体的供体的纳米粒子au@cus的水溶液，超声处理，得到包覆有一氧化氮气体响应脂质体的纳米材料。

在上述技术方案中，步骤b具体为：将产生no气体的供体加入到au@cus纳米材料的水溶液中，搅拌24-48小时，8000转离心取沉淀，得到装载有产生no气体的供体的au@cus纳米材料；接着将前述纳米材料加入到步骤a的烧瓶中，超声20分钟～30分钟，使得脂质薄膜充分脱落与纳米材料结合，之后静置一夜，8000～10000转离心取沉淀，得到包覆有气体响应脂质体的au@cus纳米材料。

本发明还提供一种上述一氧化氮气体响应脂质体在药物运载中的应用，运载的药物为阿霉素等小分子。

本发明的有益效果是：

本发明的气体响应脂质体能够对no气体进行有效响应，当气体治疗和化学治疗相结合的时候，可达到气体治疗和化学治疗的空间间隔治疗，使化学治疗发挥最大优势，达到最优治疗效果。

本发明的气体响应脂质体的制备方法简单，效率高。

本发明的气体响应脂质体可用在药物运载上，当脂质体内部包封小分子药物等，通过和no气体的接触反应对腔内小分子进行有效释放，提高材料的应用价值，并且可可控的对一些药物等小分子等进行有效的时间可控释放。

附图说明

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细说明。

图1为本发明第一具体制备实施案例所得一氧化氮气体响应小分子脂质的结构式图；

图2为本发明第二具体制备实施案例所得的气体响应脂质体对no气体的释放图；

图3为本发明第三具体制备实施案例所得的普通脂质体对no气体的释放图；

图4为本发明第四具体制备实施案例所得的气体响应脂质体进一步运载药物的no气体和药物的释放图；

图5为本发明第五具体制备实施案例气体响应脂质体对耐药型细胞的细胞毒性图；

图6为本发明第六具体制备实施案例气体响应脂质体所掺入不同一氧化氮响应小分子脂质后的no气体释放图。

具体实施方式

下面结合附图对本发明做以详细说明。

本发明提供一种一氧化氮气体响应脂质体，其包括：胆固醇、大豆卵磷脂、磷脂-聚乙二醇2000和一氧化氮气体响应小分子脂质；优选所述胆固醇、大豆卵磷脂、磷脂-聚乙二醇2000和一氧化氮气体响应小分子脂质的摩尔比为31～34:57～60:2:3～10；最优选所述胆固醇、大豆卵磷脂、磷脂-聚乙二醇2000和一氧化氮气体响应小分子脂质的摩尔比为33：59：2：6；

所述一氧化氮气体响应小分子脂质的结构式如下：

所述一氧化氮气体响应脂质体还包括产生no气体的供体精氨酸(l-arg)、以及中空介孔纳米材料金@硫化铜(au@cus)；所述中空介孔纳米材料金@硫化铜(au@cus)是用于产生活性氧(ros)和l-arg反应生成no气体以用于后续响应；

优选所述一氧化氮气体响应脂质体包覆于au@cus表面，供体l-arg装载入au@cus内部。

使用近红外光(nir)进行激发，使得au@cus产生ros与内部装载的l-arg反应产生no气体，和au@cus表面的no气体响应脂质体反应，打开通道，成功释放no或者其他小分子。

上述供体l-arg还可以替换为s-亚硝基硫醇、rbs:nafe4s3(no)7化合物、bnn6或者lyso-ru-no。

本发明还提供一种一氧化氮气体响应脂质体的制备方法，包括以下步骤：

将胆固醇、大豆卵磷脂、磷脂-聚乙二醇2000和一氧化氮气体响应小分子脂质混合溶于有机溶剂置于圆底烧瓶中，用真空旋蒸仪旋干，在烧瓶内壁上得到脂质薄膜。

优选所述有机溶剂为按2：1体积比配置的氯仿和甲醇的混合溶液。

本发明所述的一氧化氮气体响应脂质体可以进行装载，也可以对纳米粒子表面包裹。

进而本发明还提供一种包覆有上述的一氧化氮气体响应脂质体的纳米材料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

a.将胆固醇、大豆卵磷脂、磷脂-聚乙二醇2000和一氧化氮气体响应小分子脂质混合溶于有机溶剂置于圆底烧瓶中，用真空旋蒸仪旋干，在烧瓶内壁上得到脂质薄膜；

b.向步骤a的烧瓶中加入装载有产生no气体的供体的纳米粒子au@cus的水溶液，超声处理，得到包覆有一氧化氮气体响应脂质体的纳米材料。

优选步骤b具体为：将产生no气体的供体加入到au@cus纳米材料的水溶液中，搅拌24-48小时，8000转离心取沉淀，得到装载有产生no气体的供体的au@cus纳米材料；接着将前述纳米材料加入到步骤a的烧瓶中，超声20分钟～30分钟，使得脂质薄膜充分脱落与纳米材料结合，之后静置一夜，8000～10000转离心取沉淀，得到包覆有气体响应脂质体的au@cus纳米材料。

本发明还提供一种上述一氧化氮气体响应脂质体在药物运载中的应用，运载的药物为阿霉素等小分子。

下面结合具体实施案例对本发明进行进一步说明，以下实施例是对本发明的解释，本发明并不局限于以下示例。

第一具体制备实施案例：

一氧化氮气体响应小分子脂质的制备

一氧化氮气体响应小分子脂质的结构式如下：

本发明的气体响应脂质体的一氧化氮气体响应小分子脂质能够插入脂质体的磷脂双分子层中，从而在脂质体中形成规律性的排布，当本发明含有一氧化氮气体响应小分子脂质的气体响应脂质体接触到no气体，其构象可发生变化，将内含的一些小分子进行有效释放。

制备上述一氧化氮气体响应小分子脂质的方法，包括以下步骤：

a、将化合物1溶于有机溶剂四氢呋喃溶剂中，充分搅拌，再与化合物2进行混合得到混合物。

b、将化合物3溶于有机溶剂乙腈溶剂中，充分分散后在搅拌条件下，将化合物3加入到步骤a的混合物中。

c、在搅拌条件下向步骤b的混合物中加入化合物4，室温过夜，得最终产物，最终产物通过柱层析进行分离纯化，所用流动相为体积比为2:1的氯仿和甲醇溶液，收集纯化后样品进行真空干燥或者旋蒸得到淡黄色固体，即为一氧化氮气体响应小分子脂质。

所述化合物1的结构式如下：

所述化合物2的结构式如下：

所述化合物3的结构式如下：

所述化合物4的结构式如下：

如图1所示，即为本发明第一具体制备实施案例所得一氧化氮气体响应小分子脂质的结构式图。

第二具体制备实施案例：

在第一具体实施案例的基础上，本发明提出第二具体实施案例验证形成的气体响应脂质体可响应no并进行有效释放。第二具体实施案例包括以下步骤：

a：将摩尔比为33：59：2：6的胆固醇、大豆卵磷脂、磷脂-聚乙二醇2000和一氧化氮气体响应小分子脂质混合溶于有机溶剂置于圆底烧瓶中，用真空旋蒸仪旋干，在烧瓶内壁上得到脂质薄膜。所述有机溶剂为按2：1体积比配置的氯仿和甲醇的混合溶液。

b、加入装载有l-arg的纳米粒子au@cus的水溶液，超声处理，得到与纳米材料结合的气体响应脂质体。具体包括以下步骤：

将l-arg通过搅拌的方法装载入au@cus纳米材料。将l-arg加入到au@cus纳米材料的水溶液中，搅拌36小时，8000转离心取沉淀，得到装载有l-arg的au@cus纳米材料，之后进行样品的真空干燥备用；

将装载有l-arg的纳米粒子au@cus水溶液加入到悬干后的烧瓶中，在超声中超声25分钟，使得脂质体膜充分脱落与纳米材料结合，之后静置一夜，9000转离心取沉淀，得到包覆有一氧化氮气体响应脂质体的au@cus纳米材料。

在本发明的第二具体制备实施案例中，中空介孔纳米材料au@cus是用于产生活性氧(ros)和l-arg反应生成no气体以用于后续响应。

本发明的第二具体制备实施案例中，对运载l-arg包覆气体响应脂质体的纳米材料进行近红外光照射，之后griess试剂测540nm测定吸光度，确定no的产生情况。

如图2所示，为本发明第二具体制备实施案例所得的气体响应脂质体对no的释放图，所用对照组为生理盐水，和对照组相比，本发明第二具体制备实施案例所得的气体响应脂质体，在包裹完装载有l-arg的au@cus纳米粒子后，在近红外光照下，产生no气体，在溶液中通过griess试剂检测到no气体的存在，证明，在au@cus纳米材料空腔内产生的被有效释放，同时也证明no气体和纳米粒子表面的气体响应脂质体有效反应，才得以将气体释放至溶液中。证明了，气体响应脂质体对no气体的成功响应。

第三具体制备实施案例：

在第一具体制备实施案例的基础上，本发明提出第三具体制备实施案例作为对照组验证no气体的释放。第三具体制备实施案例包括以下步骤：

a：将摩尔比为35：61：4的胆固醇、大豆卵磷脂、磷脂-聚乙二醇2000混合溶于有机溶剂置于圆底烧瓶中，用真空旋蒸仪旋干，在烧瓶内壁上得到普通(无任何响应)脂质薄膜。所述有机溶剂为按2：1体积比配置的氯仿和甲醇的混合溶液。

b、加入装载有l-arg的纳米粒子au@cus的水溶液，超声处理，得到与纳米材料结合普通脂质体。具体包括以下步骤：

将l-arg通过搅拌的方法装载入au@cus纳米材料。将l-arg加入到au@cus纳米材料的水溶液中，搅拌36小时，8000转离心取沉淀，得到装载有l-arg的au@cus纳米材料，之后进行样品的真空干燥备用。

将装载有l-arg的au@cus纳米材料水溶液加入到悬干后的烧瓶中，在超声中超声25分钟，使得脂质体膜充分脱落与纳米材料结合，之后静置一夜，9000转离心取沉淀，得到包覆有普通脂质体的au@cus纳米材料。

在本发明的第三具体制备实施案例中，中空介孔纳米材料金@硫化铜(au@cus)是用于产生活性氧(ros)和l-arg反应生成no气体以用于后续响应。

在本发明的第三具体制备实施案例中，对运载l-arg包覆普通脂质体的纳米材料进行近红外光照射，之后griess试剂测540nm测定吸光度，确定no的产生情况。

如图3所示，为本发明第三具体制备实施案例所得的普通脂质体对no的释放图，从图中可以看出，普通脂质体，即不含有no气体响应小分子脂质的脂质体，当其包裹装载有l-arg的au@cus纳米粒子后，在近红外光照下，溶液中没有检测到大量的no气体的存在，则在au@cus纳米材料的空腔内产生的no没有进行有效释放，其普通脂质体只有包封的作用，并无响应的作用，本发明的气体响应脂质体与其相较更具有优势。

第四具体制备实施案例：

在第一具体制备实施案例的基础上，本发明提出第四具体制备实施案例验证形成的气体响应脂质体可响应no并进行有效释放。第四具体制备实施案例包括以下步骤：

a：将摩尔比为33：59：2：6的胆固醇、大豆卵磷脂、磷脂-聚乙二醇2000和一氧化氮气体响应小分子脂质混合溶于有机溶剂置于圆底烧瓶中，用真空旋蒸仪旋干，在烧瓶内壁上得到脂质薄膜。所述有机溶剂为按2：1体积比配置的氯仿和甲醇的混合溶液。

b、加入装载有l-arg和药物的纳米粒子au@cus的水溶液，超声处理，得到与纳米材料结合的气体响应脂质体。具体包括以下步骤：

将l-arg和阿霉素(dox)通过搅拌的方法装载入au@cus纳米材料。将l-arg加入到au@cus纳米材料的水溶液中，搅拌36小时，8000转离心取沉淀，得到装载有l-arg和dox的au@cus纳米材料，之后进行样品的真空干燥备用。

将装载有l-arg和dox的au@cus纳米材料水溶液加入到悬干后的烧瓶中，在超声中超声25分钟，使得脂质体膜充分脱落与纳米材料结合，之后静置一夜，9000转离心取沉淀，得到包覆有气体响应脂质体的au@cus纳米材料。

在本发明的第四具体制备实施案例中，中空介孔纳米材料金@硫化铜(au@cus)是用于产生活性氧(ros)和l-arg反应生成no气体以用于后续响应。

本发明的第四具体制备实施案例中，对运载l-arg包覆气体响应脂质体的纳米材料进行红外光照射，之后griess试剂测540nm测定吸光度，确定no的产生情况，用酶标仪测480nm的吸光度，确定dox的释放情况。

如图4所示，为本发明第四具体制备实施案例所得的气体响应脂质体进一步运载药物的no和药物的释放图，从图中可以看出，在0.25h的时候并没有检测到dox的存在，只有no的存在，此是由于no气体和dox的分子量的不同，气体响应脂质体在响应no后，在前期只有更小分子量的no气体可以进行释放，而较大分子量的dox只有当孔道更大一些方可流出，则证明本发明的气体响应脂质体可可控的对一些药物等小分子等进行有效的时间可控释放。

第五具体制备实施案例：

在第一具体制备实施案例的基础上，本发明提出第五具体制备实施案例验证形成的气体响应脂质体可响应no并进行有效释放，对耐药性肿瘤细胞进行有效杀伤。第五具体制备实施案例包括以下步骤：

a：将摩尔比为33：59：2：6的胆固醇、大豆卵磷脂、磷脂-聚乙二醇2000和一氧化氮气体响应小分子脂质混合溶于有机溶剂置于圆底烧瓶中，用真空旋蒸仪旋干，在烧瓶内壁上得到脂质薄膜。所述有机溶剂为按2：1体积比配置的氯仿和甲醇的混合溶液。

b、加入装载有l-arg和药物的纳米粒子au@cus的水溶液，超声处理，得到与纳米材料结合的气体响应脂质体。具体包括以下步骤：

将l-arg和阿霉素(dox)通过搅拌的方法装载入au@cus纳米材料。将l-arg加入到au@cus纳米材料的水溶液中，搅拌36小时，8000转离心取沉淀，得到装载有l-arg和dox的au@cus纳米材料，之后进行样品的真空干燥备用。

将装载有l-arg和dox的au@cus纳米材料水溶液加入到悬干后的烧瓶中，在超声中超声25分钟，使得脂质体膜充分脱落与纳米材料结合，之后静置一夜，9000转离心取沉淀，得到包覆有气体响应脂质体的au@cus纳米材料。

在本发明的第五具体制备实施案例中，中空介孔纳米材料金@硫化铜(au@cus)是用于产生活性氧(ros)和l-arg反应生成no气体以用于后续响应。

取对数生长期mcf/adr细胞，用胰酶消化后配成10⁵个/ml细胞悬液，后以每孔100μl接种到96孔板中。24小时后分别加入一系列不同浓度的装载有l-arg和dox以及涂覆有一氧化氮气体响应脂质体的au@cus纳米材料进行培养24小时，利用噻唑蓝(mtt)比色法测细胞存活率(存活率(％)＝(试验孔od值/对照孔od值)×100％)，重复三次实验；

mtt方法：取对数生长期mcf/adr细胞，用胰酶消化后配成10⁵个/ml细胞悬液，后以每孔100μl接种到96孔板中。24小时后分别加入一系列不同浓度的装载有l-arg和dox以及涂覆有no气体响应脂质体的au@cus纳米材料孵育6小时后用808nm近红外光照射进行实验，功率密度为0.75w/cm²，照射10分钟。然后在37℃培养箱继续孵育18小时，利用噻唑蓝(mtt)比色法测细胞存活率(存活率(％)＝(试验孔od值/对照孔od值)×100％)，重复三次实验；

进行数据处理得到对于耐药型细胞的杀伤结果。

如图5所示，为本发明第五具体制备实施案例气体响应脂质体对耐药型细胞的细胞毒性图，此为本发明的一项应用，对照组为au@cus纳米材料，从图中可以看出由于no气体和dox的时间可控释放，对于包裹有气体响应脂质体的纳米材料具有最优的细胞杀伤效果，则气体响应脂质体使得在纳米材料体系生物应用方面的效果更优。

第六具体制备实施案例：

在本发明中，为了保证no气体的有效释放，以及其有效利用，所述胆固醇、大豆卵磷脂、磷脂-聚乙二醇2000和一氧化氮体响应小分子脂质的摩尔比为可为31～34:57～60:2:3～10。

在第一具体制备实施案例的基础上，本发明提出第六具体制备实施案例验证除上述第一具体制备实施案例中所合成的一氧化氮气体响应脂质体所用的胆固醇、大豆卵磷脂、磷脂-聚乙二醇2000和一氧化氮(no)气体响应小分子脂质的摩尔比为33：59：2：6之外的比例依然可以进行no气体的有效释放，则其释放no的速率有所不同。第六具体制备实施案例包括以下步骤：

a：分别将摩尔比为31:57:2:10和摩尔比为34:60:2:3的胆固醇、大豆卵磷脂、磷脂-聚乙二醇2000和一氧化氮气体响应小分子脂质混合溶于有机溶剂置于圆底烧瓶中，用真空旋蒸仪旋干，在烧瓶内壁上得到两种不同加料的脂质薄膜。所述有机溶剂为按2：1体积比配置的氯仿和甲醇的混合溶液。接着进行以下相同的处理。

b、加入装载有l-arg的纳米粒子au@cus的水溶液，超声处理，得到与纳米材料结合的气体响应脂质体。具体包括以下步骤：

将l-arg通过搅拌的方法装载入au@cus纳米材料。将l-arg加入到au@cus纳米材料的水溶液中，搅拌25小时，8000转离心取沉淀，得到装载有l-arg的au@cus纳米材料，之后进行样品的真空干燥备用。

将装载有l-arg的au@cus纳米材料水溶液分别加入到悬干后的两种不同加料的脂质薄膜的烧瓶中，在超声中超声30分钟，使得脂质体膜充分脱落与纳米材料结合，之后静置一夜，8000转离心取沉淀，得到包覆有不同加料的气体响应脂质体的au@cus纳米材料。

在本发明的第六具体制备实施案例中，中空介孔纳米材料金@硫化铜(au@cus)是用于产生活性氧(ros)和l-arg反应生成no气体以用于后续响应。

本发明的第六具体制备实施案例中，对运载l-arg包覆气体响应脂质体的纳米材料进行红外光照射，之后griess试剂测540nm测定吸光度，确定加入的两种不同比的no响应脂质小分子后no的产生情况。

如图6所示，为本发明第六具体制备实施案例气体响应脂质体所掺入不同一氧化氮响应小分子脂质后的no气体释放图，从图中可以看出，组成气体响应脂质体的各物质的量的摩尔比为31:57:2:10的实验组no气体释放的快，在较短时间内很快就能到达平台期，而组成气体响应脂质体的各物质的量的摩尔比为34:60:2:3的实验组其no的释放速度较慢，缓慢达到平台期，因此通过改变掺入的no响应小分子脂质可以改变no气体的释放效率，其依然为气体响应脂质体。但对其内包裹的小分子等的释放是不同的。

在本发明中，气体响应脂质体可对no气体进行响应，在上述具体制备实施案例中所用no供体为l-arg，除此之外，本发明的气体响应脂质体依然可对其他供体产生的no进行响应。其他供体包括：

a:s-亚硝基硫醇(sno)；sno作为一氧化氮的中间代谢物形式普遍存在生物体系中，光、热、某些金属离子(cu、hg)及光可造成n-s键断裂，产生no。

b:roussin’sblacksalt(rbs)；rbs:nafe4s3(no)7化合物。它由[fe4s3(no)7]^-阴离子的钠盐组成，分为金属亚硝酰基化合物。no供体的一种。

c：n,n′-di-sec-butyl-n,n′-dinitroso-1,4-phenylenediamine(bnn6)；紫外可见光可将其结构式改变释放no气体。

d：其他一些自己合成的亚硝基供体，例如由钌组成亚硝酰供体(lyso-ru-no)，也可在外界条件刺激下导致其键的断裂产生no气体。

因此在本发明中，气体响应脂质体对no气体进行响应，对于供体并不局限于l-arg这一供体，对上述中的其他no供体以及为提及到的其他可产生no的供体，产生了no，本发明的气体响应脂质体均可对其他供体产生的no进行反应。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。