本发明涉及生物
技术领域：
：，具体地，本发明涉及化合物在促进干细胞因子合成和分泌中的用途，更具体地，本发明涉及化合物在促进干细胞因子合成和分泌中的用途、培养基、化合物在在制备培养基或药物中的用途以及促进干细胞因子合成和分泌的方法。
背景技术：
：：由基质细胞、细胞因子及细胞外基质等组成的造血微环境参与调控造血干细胞的自我更新及增殖分化。在众多参与维持造血干细胞稳态的造血调控因子中，干细胞因子(stemcellfactor，scf，又称为kit配体或肥大细胞生长因子)是由基质细胞所产生的一种酸性糖蛋白，在人骨髓及血清中均可被检测到。大量研究证据表明，在早期造血干/祖细胞增殖分化及动员归巢过程中，scf均发挥关键的调控作用，并主要包括以下几方面：1.调控造血干细胞的增殖及分化。在体外培养条件下,scf能够单独或协同其他造血细胞因子促进造血干/祖细胞的体外增殖，并支持其向特定造血谱系的定向分化。2.参与造血干细胞的动员。利用动物模型研究发现，scf与g-csf等细胞因子联用能够提高外周血中总有核细胞数、cd34+细胞数量及造血集落数量，表明其可能是一种潜在的造血动员剂。3.促进造血干细胞的归巢。体内外研究证据表明，scf能够调控造血干细胞表面黏附蛋白的表达水平，与sdf-1α协同作用参与造血干细胞归巢并定植于骨髓微环境中。4.scf能够促进辐射损伤后造血功能的恢复重建。来自动物模型的研究表明，scf能够提高受辐照动物的生存率，缩短血小板及中性粒细胞恢复周期，表明其可能是一种效果持久、疗效广谱的抗放药。因此，筛选能激活内源性scf因子合成分泌的激动剂，具有十分重要的临床意义和应用前景。技术实现要素：本申请是基于发明人对以下事实和问题的发现和认识作出的：在本发明中，发明人利用高通量分析技术，筛选到一种能够促进骨髓基质细胞分泌scf的小分子化合物prx-08066maleicacid(后简称prx)。该小分子化合物作为一种选择性的5-ht2b受体拮抗剂，其ic50为3.4nm，作用于mct大鼠模型，可缓解肺动脉高压的严重程度。在本申请中，发明人发现，在小鼠骨髓基质细胞培养体系中添加0-10μmprx处理后，利用westernblot检测细胞裂解物scf蛋白表达水平，发现与溶剂对照组相比，prx能够显著提高细胞总scf的表达水平，并具有剂量依赖效应；利用elisa检测培养上清中可溶性scf浓度同样发现，prx能够有效刺激细胞分泌可溶型scf蛋白。这些实验证据有力支持prx可作为一种促进内源scf合成分泌的激动剂，成为一种安全有效的潜在靶向药物，用于调节造血干/祖细胞增殖和/或分化、动员归巢及再生重建。为此，在发明的第一方面，本发明提出式(i)所示化合物或式(i)所示化合物的立体异构体、互变异构体、氮氧化物、溶剂化物、代谢产物、药学上可接受的盐或前药在促进干细胞因子合成和分泌中的用途，式(i)所示化合物即称为prx-08066maleicacid(即prx)。根据本发明的实施例，式(i)所示化合物的立体异构体、互变异构体、氮氧化物、溶剂化物、代谢产物、药学上可接受的盐或前药与式(i)所示化合物在机体或细胞内具有相似或相应的理化性质。发明人通过实验发现，prx能够有效提高基质细胞总scf的表达和分泌水平，可作为有效地促进内源scf合成和分泌的激动剂；式(i)所示化合物或式(i)所示化合物的立体异构体、互变异构体、氮氧化物、溶剂化物、代谢产物、药学上可接受的盐或前药能够显著促进干细胞因子合成和分泌。根据本发明的实施例，上述用途还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：根据本发明的实施例，所述干细胞因子由基质细胞合成。根据本发明的实施例，所述基质细胞为骨髓基质细胞。在本发明的第二方面，本发明提出了一种培养基。根据本发明的实施例，所述培养基包含：化合物，所述化合物为式(i)所示化合物或式(i)所示化合物的立体异构体、互变异构体、氮氧化物、溶剂化物、代谢产物、药学上可接受的盐或前药。发明人发现，在小鼠骨髓基质细胞培养体系中添加prx处理后，scf蛋白表达和分泌水平均明显提高。根据本发明实施例的培养基用于培养造血干细胞，可有效促进造血干/祖细胞增殖和/或分化，促进造血干细胞动员、归巢及长期植入；根据本发明实施例的培养基用于培养骨髓基质细胞，可有效促进干细胞因子的合成和分泌。根据本发明的实施例，上述培养基还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：根据本发明的实施例，所述培养基进一步包括胎牛血清或血清替代物以及碱性成纤维生长因子。干细胞因子的合成和分泌效率进一步提高。根据本发明的实施例，所述化合物的浓度为0-10μm，如化合物的浓度可以为0.1μm、1μm或10μm，所述胎牛血清或血清替代物的体积分数为5％，所述碱性成纤维生长因子的浓度为10ng/ml。进而利用根据本发明实施例的培养基培养骨髓基质细胞，干细胞因子的合成和分泌效率进一步提高。在本发明的第三方面，本发明提出了式(i)所示化合物或式(i)所示化合物的立体异构体、互变异构体、氮氧化物、溶剂化物、代谢产物、药学上可接受的盐或前药在制备培养基或药物中的用途，所述培养基或药物用于下列的至少之一：培养造血干细胞，促进干细胞因子合成和分泌，促进造血干/祖细胞增殖和/或分化，促进造血干细胞动员，促进造血干细胞移植后归巢及长期植入，促进辐射或化疗后造血功能的恢复重建。发明人通过实验发现，prx能够有效提高基质细胞总scf的表达和分泌，可作为有效地促进内源scf合成和分泌的激动剂。利用式(i)所示化合物或式(i)所示化合物的立体异构体、互变异构体、氮氧化物、溶剂化物、代谢产物、药学上可接受的盐或前药所制备的培养基或药物用于培养造血干细胞，促进干细胞因子合成和分泌，促进造血干/祖细胞增殖和/或分化，促进造血干细胞动员，促进造血干细胞移植后归巢及长期植入，促进辐射或化疗后造血功能的恢复重建效果显著。在本发明的第四方面，本发明提出了一种促进干细胞因子合成和分泌的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：利用添加有式(i)所示化合物或式(i)所示化合物的立体异构体、互变异构体、氮氧化物、溶剂化物、代谢产物、药学上可接受的盐或前药的培养基培养基质细胞。根据本发明实施例的方法可显著促进基质细胞中干细胞因子合成和分泌，促进造血干/祖细胞增殖和/或分化、促进造血干细胞动员以及归巢和重建。根据本发明的实施例，上述方法还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：根据本发明的实施例，所述培养基为包含5％胎牛血清(或血清替代物)、10ng/ml碱性成纤维生长因子以及0-10μm所述化合物的αmem培养基。根据本发明实施例的方法促进干细胞因子合成和分泌的效率进一步显著提高。根据本发明的实施例，所述基质细胞预先经过预培养，所述预培养的培养基为包含20％胎牛血清或血清替代物以及10ng/ml碱性成纤维生长因子的αmem培养基，所述预培养后，所述基质细胞的汇合度不小于90％。进而用于基质细胞可处于最佳的状态，可进一步提高基质细胞中干细胞因子合成和分泌的效率。根据本发明的实施例，所述化合物的浓度为10μm。发明人发现，化合物的浓度为10μm，其促进干细胞因子合成和分泌的效率更高。根据本发明的实施例，所述基质细胞为骨髓基质细胞。骨髓基质细胞(bonemarrowstromalcell)，是指成体骨髓中的一类多能干细胞，是造血微环境的主要组成部分之一，对维持造血干/祖细胞稳态及功能具有关键调控作用。利用根据本发明实施例的方法培养骨髓基质细胞，可显著促进骨髓基质细胞中干细胞因子合成和分泌，显著促进骨髓基质细胞中造血干/祖细胞增殖和/或分化。附图说明图1是根据本发明实施例的不同浓度prx处理小鼠骨髓基质细胞scf表达量检测的结果图；以及图2是根据本发明实施例的prx处理小鼠骨髓基质细胞后培养上清中游离scf浓度检测的结果图。具体实施方式定义和一般术语本发明使用的立体化学定义和惯例大体上按照s.p.parker,ed,mcgraw-hilldictionaryofchemicalterms(1984)mcgraw-hillbookcompany,newyork；andeliel,e.andwilen,s.,“stereochemistryoforganiccompounds”,johnwiley&sons,inc.,newyork,1994。本发明化合物可含有不对称中心或手性中心，因此以不同的立体异构形式存在。所预期的是，本发明化合物的所有立体异构形式，包括但不限于非对映异构体、对映异构体和阻转异构体(atropisomer)及它们的混合物如外消旋混合物，也包含在本发明范围之内。许多有机化合物以光学活性形式存在，即它们具有使平面偏振光的平面发生旋转的能力。当描述具有光学活性的化合物时，使用前缀d和l或r和s来表示就分子中的手性中心(或多个手性中心)而言分子的绝对构型。前缀d和l或(+)和(-)是用于指定化合物所致平面偏振光旋转的符号，其中(-)或l表示化合物是左旋的。前缀为(+)或d的化合物是右旋的。就给定的化学结构而言，除了这些立体异构体互为镜像外，这些立体异构体是相同的。具体的立体异构体也可称为对映异构体，并且所述异构体的混合物通常称作对映异构体的混合物。对映异构体的50:50混合物称为外消旋混合物或外消旋体，当在化学反应或方法中没有立体选择性或立体特异性时，可出现所述外消旋混合物或外消旋体。依据原料和方法的选择，本发明化合物可以以可能的异构体中的一个或它们的混合物的形式存在，例如作为纯旋光异构体，或作为异构体混合物，如作为外消旋和非对应异构体混合物，这取决于不对称碳原子的数量。旋光性的(r)-或(s)-异构体可使用手性合成子或手性制剂制备，或使用常规技术拆分。如果此化合物含有一个双键，取代基可能为e或z构型；如果此化合物中含有二取代的环烷基，环烷基的取代基可能为顺式或反式(cis-或trans-)构型。本发明化合物可以含有不对称中心或手性中心，因此以不同的立体异构体形式存在。所预期的是，本发明化合物的所有立体异构体形式，包括但不限于非对映异构体、对映异构体和阻转异构体(atropisomer)和几何(或构象)异构体及它们的混合物，如外消旋混合物，均在本发明的范围之内。除非另外指出，本发明描述的结构还表示包括此结构的所有异构体(如，对映体、非对映体阻转异构体(atropisomer)和几何(或构象))形式；例如，各不对称中心的r和s构型，(z)和(e)双键异构体，以及(z)和(e)构象异构体。因此，本发明化合物的单个立体化学异构体以及对映体混合物、非对映体混合物和几何异构体(或构象异构体)混合物均在本发明的范围之内。术语“互变异构体”或“互变异构形式”是指具有不同能量的可通过低能垒(lowenergybarrier)互相转化的结构异构体。若互变异构是可能的(如在溶液中)，则可以达到互变异构体的化学平衡。例如，质子互变异构体(protontautomer)(也称为质子转移互变异构体(prototropictautomer))包括通过质子迁移来进行的互相转化，如酮-烯醇异构化和亚胺-烯胺异构化。价键互变异构体(valencetautomer)包括通过一些成键电子的重组来进行的互相转化。酮-烯醇互变异构的具体实例是戊烷-2,4-二酮和4-羟基戊-3-烯-2-酮互变异构体的互变。互变异构的另一个实例是酚-酮互变异构。酚-酮互变异构的一个具体实例是吡啶-4-醇和吡啶-4(1h)-酮互变异构体的互变。除非另外指出，本发明化合物的所有互变异构体形式都在本发明的范围之内。本发明所使用的“氮氧化物”是指当化合物含几个胺官能团时，可将1个或大于1个的氮原子氧化形成n-氧化物。n-氧化物的特殊实例是叔胺的n-氧化物或含氮杂环氮原子的n-氧化物。可用氧化剂例，如过氧化氢或过酸(例如过氧羧酸)处理相应的胺形成n-氧化物(参见advancedorganicchemistry,wileyinterscience,第4版,jerrymarch,pages)。尤其是，n-氧化物可用l.w.deady的方法制备(syn.comm.1977,7,509-514)，其中例如在惰性溶剂，例如二氯甲烷中，使胺化合物与间-氯过苯甲酸(mcpba)反应。本发明的“溶剂化物”是指一个或多个溶剂分子与本发明的化合物所形成的缔合物。形成溶剂化物的溶剂包括，但并不限于，水，异丙醇，乙醇，甲醇，二甲亚砜，乙酸乙酯，乙酸，氨基乙醇。术语“水合物”是指溶剂分子是水所形成的缔合物。“代谢产物”是指具体的化合物或其盐在体内通过代谢作用所得到的产物。一个化合物的代谢产物可以通过所属领域公知的技术来进行鉴定，其活性可以通过如本发明所描述的那样采用试验的方法进行表征。这样的产物可以是通过给药化合物经过氧化，还原，水解，酰氨化，脱酰氨作用，酯化，脱脂作用，酶裂解等等方法得到。相应地，本发明包括化合物的代谢产物，包括将本发明的化合物与哺乳动物充分接触一段时间所产生的代谢产物。本发明所使用的“药学上可接受的盐”是指本发明的化合物的有机盐和无机盐。药学上可接受的盐在所属领域是为我们所熟知的，如文献：s.m.bergeetal.,describepharmaceuticallyacceptablesaltsindetailinj.pharmaceuticalsciences,1977,66:1-19.所记载的。药学上可接受的无毒的酸形成的盐包括，但并不限于，与氨基基团反应形成的无机酸盐有盐酸盐，氢溴酸盐，磷酸盐，硫酸盐，高氯酸盐，和有机酸盐如乙酸盐，草酸盐，马来酸盐，酒石酸盐，柠檬酸盐，琥珀酸盐，丙二酸盐，或通过书籍文献上所记载的其他方法如离子交换法来得到这些盐。其他药学上可接受的盐包括己二酸盐，藻酸盐，抗坏血酸盐，天冬氨酸盐，苯磺酸盐，苯甲酸盐，重硫酸盐，硼酸盐，丁酸盐，樟脑酸盐，樟脑磺酸盐，环戊基丙酸盐，二葡萄糖酸盐，十二烷基硫酸盐，乙磺酸盐，甲酸盐，反丁烯二酸盐，葡庚糖酸盐，甘油磷酸盐，葡萄糖酸盐，半硫酸盐，庚酸盐，己酸盐，氢碘酸盐，2-羟基-乙磺酸盐，乳糖醛酸盐，乳酸盐，月桂酸盐，月桂基硫酸盐，苹果酸盐，丙二酸盐，甲磺酸盐，2-萘磺酸盐，烟酸盐，硝酸盐，油酸盐，棕榈酸盐，扑酸盐，果胶酸盐，过硫酸盐，3-苯基丙酸盐，苦味酸盐，特戊酸盐，丙酸盐，硬脂酸盐，硫氰酸盐，对甲苯磺酸盐，十一酸盐，戊酸盐，等等。通过适当的碱得到的盐包括碱金属，碱土金属，铵和n+(c1-4烷基)4的盐。本发明也拟构思了任何所包含n的基团的化合物所形成的季铵盐。水溶性或油溶性或分散产物可以通过季铵化作用得到。碱金属或碱土金属盐包括钠，锂，钾，钙，镁，等等。药学上可接受的盐进一步包括适当的、无毒的铵，季铵盐和抗平衡离子形成的胺阳离子，如卤化物，氢氧化物，羧化物，硫酸化物，磷酸化物，硝酸化物，c1-8磺酸化物和芳香磺酸化物。本发明所使用的术语“前药”，代表一个化合物在体内转化为式(i)所示的化合物。这样的转化受前体药物在血液中水解或在血液或组织中经酶转化为母体结构的影响。本发明前体药物类化合物可以是酯，在现有的发明中酯可以作为前体药物的有苯酯类，脂肪族(c1-24)酯类，酰氧基甲基酯类，碳酸酯，氨基甲酸酯类和氨基酸酯类。例如本发明里的一个化合物包含羟基，即可以将其酰化得到前体药物形式的化合物。其他的前体药物形式包括磷酸酯，如这些磷酸酯类化合物是经母体上的羟基磷酸化得到的。关于前体药物完整的讨论可以参考以下文献：t.higuchiandv.stella,pro-drugsasnoveldeliverysystems,vol.14ofthea.c.s.symposiumseries,edwardb.roche,ed.,bioreversiblecarriersindrugdesign,americanpharmaceuticalassociationandpergamonpress,1987,j.rautioetal.,prodrugs:designandclinicalapplications,naturereviewdrugdiscovery,2008,7,255-270,ands.j.heckeretal.,prodrugsofphosphatesandphosphonates,journalofmedicinalchemistry,2008,51,2328-2345。本发明化合物的任何不对称原子(例如，碳等)都可以以外消旋或对映体富集的形式存在，例如(r)-、(s)-或(r,s)-构型形式存在。在某些实施方案中，各不对称原子在(r)-或(s)-构型方面具有至少50％对映体过量，至少60％对映体过量，至少70％对映体过量，至少80％对映体过量，至少90％对映体过量，至少95％对映体过量，或至少99％对映体过量。如果可能的话，具有不饱和双键的原子上的取代基可以以顺式-(z)-或反式-(e)-形式存在。因此，如本发明所描述的那样，本发明的化合物可以以可能的异构体、旋转异构体、阻转异构体、互变异构体中的一种形式或其混合物的形式存在，例如为基本纯的几何(顺式或反式)异构体、非对映异构体、光学异构体(对映体)、外消旋体或其混合物形式。可以根据组分的物理化学差异将所得的任何异构体混合物分离成纯或基本纯的几何或光学异构体、非对映异构体、外消旋体，例如通过色谱法和/或分步结晶来进行分离。可以用已知的方法将任何所得终产物或中间体的外消旋体通过本领域技术人员熟悉的方法拆分成光学对映体，如，通过对获得的其非对映异构的盐进行分离。外消旋的产物也可以通过手性色谱来分离，如，使用手性吸附剂的高压液相色谱(hplc)。特别地，对映异构体可以通过不对称合成制备(如，jacques,etal.,enantiomers,racematesandresolutions(wileyinterscience,newyork,1981)；principlesofasymmetricsynthesis(2nded.roberte.gawley,jeffreyaubé,elsevier,oxford,uk,2012)；eliel,e.l.stereochemistryofcarboncompounds(mcgraw-hill,ny,1962)；andwilen,s.h.tablesofresolvingagentsandopticalresolutionsp.268(e.l.eliel,ed.,univ.ofnotredamepress,notredame,in1972)。下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例1不同浓度prx处理小鼠骨髓基质细胞分离小鼠骨髓基质细胞，将其培养于含20％(体积分数)胎牛血清以及10ng/ml碱性成纤维生长因子的αmem培养基中，每隔两天换液一次至细胞生长至90％以上汇合度。将培养基更换为添加不同浓度prx的αmem培养基(含5％胎牛血清以及10ng/ml碱性成纤维生长因子)，孵育处理一段时间后分别收集细胞培养上清及细胞裂解物，分别进行elisa及westernblot的检测。实施例2免疫印迹分析(westernblot)用预冷的含1％蛋白酶抑制剂的ripa裂解液处理细胞1小时，16000rpm离心20分钟1收集上清，利用bca法对上清中总蛋白含量进行测定。将上样缓冲液与样本混匀后100℃处理5分钟，吸取一定体积蛋白裂解物进行sds聚丙烯酰胺凝胶电泳，并将蛋白样本通过半干法转印至pvdf膜上，对膜进行非特异抗原封闭结合处理后，分别将膜与scf抗体稀释液、β-actin抗体稀释液共孵育，洗脱掉未结合抗体后。将膜与hrp偶联的二抗稀释液共孵育一段时间后洗脱未结合抗体，用ecl试剂孵育膜后用x感光胶片检测发光强度。结果如图1所示，结果显示，与溶剂对照组相比，prx能够显著提高细胞总scf的表达水平，并具有剂量依赖效应。实施例3酶联免疫吸附检测(elisa)用含10微摩尔/mlprx的αmem+5％(体积分数)胎牛血清+10ng/ml碱性成纤维生长因子的培养基处理小鼠骨髓基质细胞72小时，收集细胞培养上清。培养上清测定体积后12000rpm，4℃离心20min，取2ml上清用稀释液等体积稀释，按照试剂盒操作步骤测定上清中scf含量。结果如图2所示，结果显示，prx能够有效刺激细胞分泌可溶型scf蛋白。在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。当前第1页12当前第1页12