本发明涉及生物医药剂型技术领域，具体涉及一种蓝萼甲素脂质体注射液及其制备方法。
背景技术：
蓝萼甲素(glaucocalyxina，gla)为蓝萼香茶菜中的特征性贝壳杉烷型二萜类主要成分之一。其化学结构式见式i：
蓝萼甲素对不同白血病细胞株均显现较强的抗肿瘤活性，尤其对人急性髓细胞白血病细胞株hl-60和人急性t细胞白血病细胞株6t-cem最为敏感。其中蓝萼甲素对不同白血病细胞株的半数细胞抑制剂量(ic50值)分别为：人急性髓细胞白血病细胞株hl-60：0.33μg/ml；人急性t细胞白血病细胞株6t-cem：0.049μg/ml；人急性成淋巴细胞性白血病细胞ccrf-cem：1.41μg/ml。蓝萼甲素在医药领域具有较好的应用前景。目前，国内外关于蓝萼甲素的剂型研究较少，尤其欠缺一种性质稳定，澄清度好，包封率高的蓝萼甲素脂质体注射液及其制备方法。
技术实现要素：
有鉴于背景技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种性质稳定，澄清度好，包封率高的蓝萼甲素脂质体注射液及其制备方法。
本发明提供了以下技术方案：
一种蓝萼甲素脂质体注射液，所述蓝萼甲素脂质体注射液以注射用水为分散系，包括0.5～1.5g/l的蓝萼甲素，6～10g/l的卵磷脂，1.2～2.0g/l的胆固醇和1％～2％体积分数的ph缓冲溶液。
优选的，所述ph缓冲溶液包括枸橼酸缓冲溶液和/或乙酸钠-乙酸缓冲液。
优选的，所述ph缓冲溶液为ph值为3.5～4.5的枸橼酸缓冲溶液
优选的，所述卵磷脂包括大豆卵磷脂或蛋黄卵磷脂。
本发明还提供了上述蓝萼甲素脂质体注射液的制备方法，包括如下步骤：
(1)将蓝萼甲素、卵磷脂和胆固醇共同溶于有机溶媒中，得到有机溶液；
(2)将所述有机溶液中的有机溶媒去除，得到磷脂膜；
(3)将所述磷脂膜与ph缓冲溶液混合，得到蓝萼甲素脂质体；
(4)将所述蓝萼甲素脂质体分散于注射用水中，得到蓝萼甲素脂质体注射液。
优选的，步骤(1)所述有机溶媒包括二氯甲烷和/或氯仿。
优选的，所述步骤(2)去除有机溶媒的方法包括减压蒸发。
优选的，步骤(3)所述混合后，还包括活性炭除杂。
优选的，所述活性炭除杂后，还包括滤膜过滤，所述滤膜的孔径为0.4～0.5μm。
优选的，步骤(4)得到蓝萼甲素脂质体注射液后，调节所述蓝萼甲素脂质体注射液的ph值为3.5～5.5。
本发明提供的蓝萼甲素脂质体注射液以注射用水为分散系，包括0.5～1.5g/l的蓝萼甲素，6～10g/l的卵磷脂，1.2～2.0g/l的胆固醇和1％～2％体积分数的ph缓冲溶液。利用本发明所述组分制得的蓝萼甲素脂质体注射液性质稳定，澄清度好，包封率高。
具体实施方式
本发明提供了一种蓝萼甲素脂质体注射液。在本发明中，所述蓝萼甲素脂质体注射液以注射用水为分散系，包括0.5～1.5g/l的蓝萼甲素，6～10g/l的卵磷脂，1.2～2.0g/l的胆固醇和1％～2％体积分数的ph缓冲溶液。
在本发明中，所述注射用水是指符合中国药典注射用水项下规定的蒸馏水或去离子水经蒸馏所得的水。以注射用水为分散系，本发明所述蓝萼甲素脂质体注射液包括蓝萼甲素、卵磷脂、胆固醇和ph缓冲溶液。所述蓝萼甲素的用量为0.5～1.5g/l，优选为0.8～1.2g/l，更优选为1g/l。所述卵磷脂的用量为6～10g/l，优选为7～9g/l，更优选为8g/l。所述胆固醇的用量为1.2～2.0g/l，优选为1.5～1.7g/l，更优选为1.6g/l。所述ph缓冲溶液的用量按体积分数计为1％～2％，优选为1.2％～1.8％，更优选为1.5％。在本发明中，所述卵磷脂为市售卵磷脂，优选包括大豆卵磷脂或蛋黄卵磷脂。所述ph缓冲溶液优选包括枸橼酸缓冲溶液和/或乙酸钠-乙酸缓冲液，更优选为枸橼酸缓冲溶液；所述枸橼酸缓冲溶液的ph值优选为3.5～4.5，更优选为4。本发明对上述各组分的来源不作特别限定，本领域常规市售产品均可。利用本发明上述组分制得的蓝萼甲素脂质体注射液具有良好的稳定性，且澄清度好，包封率高。
本发明还提供了上述蓝萼甲素脂质体注射液的制备方法，包括如下步骤：
(1)将蓝萼甲素、卵磷脂和胆固醇共同溶于有机溶媒中，得到有机溶液；
(2)将所述有机溶液中的有机溶媒去除，得到磷脂膜；
(3)将所述磷脂膜与ph缓冲溶液混合，得到蓝萼甲素脂质体；
(4)将所述蓝萼甲素脂质体分散于注射用水中，得到蓝萼甲素脂质体注射液。
本发明先将蓝萼甲素、卵磷脂和胆固醇共同溶于有机溶媒中，得到有机溶液。在本发明中，所述有机溶媒优选包括二氯甲烷和/或氯仿，更优选为二氯甲烷。以二氯甲烷为蓝萼甲素、卵磷脂和胆固醇的溶媒，具有良好的溶解特性，且澄明度良好。
得到有机溶液后，本发明将所述有机溶液中的有机溶媒去除。在本发明中，所述去除有机溶媒的方法优选包括减压蒸发。所述减压蒸发的温度优选为40～80℃。除溶媒过程中gla、卵磷脂和胆固醇相互混合溶解再干燥，形成磷脂复合物既磷脂膜待有机溶媒完全去除后，得到磷脂膜。
本发明将所述磷脂膜与ph缓冲溶液混合，得到蓝萼甲素脂质体。在本发明中，所述混合的温度优选为37℃。所述混合的同时优选震摇。混合后优选还包括活性炭除杂。在本发明中，所述活性炭除杂的目的是吸附混合液中的热源(如微生物等)。在所述活性炭除杂步骤中，活性炭的用量优选为0.5～1.5g/l，更优选为1g/l。本发明对所述活性炭的来源不作特别限定，本领域常规市售活性炭产品均可。活性炭除杂后优选还包括滤膜过滤。在本发明中，所述滤膜的孔径优选为0.4～0.5μm，更优选为0.45μm。本发明对所述滤膜的具体材质及来源不作特别限定，本领域常规市售产品即可。
得到蓝萼甲素脂质体注射液后，本发明优选调节所述蓝萼甲素脂质体注射液的ph值为3.5～5.5。实验表明，本发明制备得到的蓝萼甲素脂质体注射液在3.5～5.5的ph值条件下具有良好的稳定性，保存过程中澄清度良好。
本发明利用sephadexg-50凝胶微柱对上述方法制备得到的蓝萼甲素脂质体注射液的包封率进行测定。结果表明：蓝萼甲素脂质体注射液包封率较高，包封率平均值能达到79.18％。
下面将结合实施例对本发明提供的技术方案进行清楚、完整地描述。应当注意，下面所列举的实施例仅是本发明的部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
一种蓝萼甲素(gla)脂质体注射液(50支*20ml)，其处方如下：
实施例2
(1)gla脂质体膜的配制
取处方量gla、大豆卵磷脂、胆固醇，溶于适量二氯甲烷，减压蒸去有机溶剂，继续减压干燥8h制得磷脂膜。
(2)gla脂质体水化液
将磷脂膜加入枸橼酸缓冲溶液(ph4.0)15ml，于37℃振摇至完全水化后，加入1g/l活性炭(1％)，室温保温20min，过滤脱炭，得gla脂质体水化液。
(3)成品的制备
gla脂质体水化液经0.45μm微孔滤膜过滤3次，得到的滤液即为gla脂质体，加注射用水至1000ml，精滤，测定中间品含量以及ph值，必要时用盐酸或者氢氧化钠溶液调节ph，使ph在3.5～5.5之间。合格后，过滤灌装于20ml玻璃瓶中，115℃，30分钟灭菌即得。
实施例3
(1)gla脂质体膜溶媒的选择
以实施例1所述处方准确称取gla、大豆卵磷脂和胆固醇，各3份。分3个实验组，每组包括1份gla、1份大豆卵磷脂和1份胆固醇。将3个实验组分别加入到注射用水、二氯甲烷、氯仿中，搅拌均匀，0～4℃、40℃条件下贮存，观察测定，结果见表1。
表1不同溶媒对制备工艺的影响
由表1结果可知：gla不溶于水，故注射用水不能单独作为gla的溶媒。但二氯甲烷、氯仿是gla很好的分散剂，使其不结块，可加速gla的溶解速度。且二氯甲烷、氯仿能使gla、大豆卵磷脂、胆固醇全部溶解，澄明度好。综合考虑，采用二氯甲烷作为本品的溶媒，且在0～4℃和40℃条件下考察8小时，澄明度好，含量几乎不变。
(2)ph值对gla脂质体注射液的稳定性的影响
以实施例1所述处方配制3份gla脂质体注射液，每份20ml。分别取1ml注射液用80％甲醇定容至10ml，并分别用盐酸或者氢氧化钠溶液调节ph为3.5、4.5、5.5。将制成的注射液分别放置于40℃恒温烘箱中(无外包装)十天，并于0、5、10天取样测定，结果见表2。
表2不同ph值在40℃条件下gla脂质体注射液的稳定性的影响
由表2可知，ph值3.5～5.5对gla脂质体注射液稳定性影响并不很大。在ph3.5～5.5之间，gla脂质体注射液的色泽、澄明度和含量几乎没有变化，故本品适宜的ph值范围为3.5～5.5。
(3)sephadexg-50凝胶微柱测定脂质体包封率
精密吸取gla脂质体注射液1ml，缓缓加于柱顶部，500r·min-1离心3min使脂质体溶液进入凝胶柱中，然后以2000r·min-1离心5min，收集洗脱液，再于柱顶部加入相同体积的0.9％的氯化钠水溶液，重复以上操作，收集并检测洗脱液，将脂质体部分的洗脱液合并后加无水乙醇稀释至10ml，摇匀。精密吸取10μl溶液，进样，测定峰面积，以标准曲线法计算gla的含量；另精密吸取gla脂质体注射液1ml，用无水乙醇定容至10ml，摇匀。精密吸取10μl溶液，同法测定，计算包封率。
包封率计算公式：包封率(％)＝(过柱后脂质体中药物含量/过柱前脂质体中药物含量)×100％。结果见表3。
表3gla包封率测定结果
表3中，ee(％)为包封率；mean(％)为包封率平均值；rsd为相对标准差。样品1-3是制备的3批脂质体。表3数据表明：按本发明所述方法制备的gla脂质体注射液包封率良好。
实施例4
蓝萼甲素脂质体的动物实验：
小鼠淋巴细胞白血病细胞株l1210，在细胞培养箱中常规培养、传代。无菌条件下，常规方法取对数生长期的l1210细胞。取l1210细胞按照1*107细胞腹腔注射接种dba/2小鼠，生长8天左右从腹腔中取出生长旺盛的细胞，染色计数，按照5*106/ml每只0.2ml腹腔注射接种dba/2小鼠。
dba/2小鼠接种l1210细胞后第2天，腹腔注射给药。gla脂质体注射液(1mg/ml，20ml/瓶)分为低剂量组5mg/kg和高剂量组20mg/kg，每组各8只小鼠；阳性药(环磷酰胺，ctx)组8只小鼠，剂量为30mg/kg；模型组8只小鼠。每天给药1次，直至白血病小鼠死亡。
dba/2小鼠接种l1210细胞后1周陆续出现死亡，模型组(control)第8、9、10天分别死亡25％、50％和25％；蓝萼甲素脂质体低剂量组5mg/kg第8和9天分别死亡37.5％和62.5％；蓝萼甲素脂质体高剂量组20mg/kg第9、10、11和12天分别死亡25％(每天2只)；阳性药(ctx)组30mg/kg第9、10、11、12、13天分别死亡12.5％、12.5％、12.5％、25％和37.5％。具体结果见表4。
表4白血病小鼠的生存情况
由表4可以看出：蓝萼甲素脂质体20mg/kg对白血病小鼠有延长生存期的作用(p<0.01)，5mg/kg对白血病小鼠没有延长生存期的作用(p>0.05)，ctx对白血病小鼠有延长生存期的作用(p<0.05)。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。