本发明涉及一种发酵黄精的工艺方法，具体涉及一种利用啤酒酵母菌固态发酵黄精的工艺方法。
背景技术：
黄精为滇黄精polygonatumkingianumcoll.ethemsl.、黄精polygonatumsibirifumred.和多花黄精polygonatumcyrtonemahua的干燥根茎。黄精味甘，能够补气养阴，健脾，润肺，益肾，是中医常用药物之一。黄精主要成分有多糖、皂苷、生物碱、木脂素、黄酮及挥发油等，多糖占4.47％～21.34％左右，其中多糖和皂苷是主要药效成分。现代研究表明黄精具有降血糖、调血脂、调节免疫力、抗肿瘤、抗衰老、抗菌和改善学习记忆能力等药理作用。
生黄精具有麻味，生品服用时，口舌麻木，刺激咽喉，且容易导致腹泻。古人对于黄精的加工多采用“九蒸九晒”的方法，这种传统工艺也一直沿用至今，但该方法所需时间长，工艺较为复杂，费工费时。因此，从长远的经济效益出发，黄精的加工工艺急需注入新的技术，来解决当前存在的问题。
啤酒酵母菌是啤酒生产上常用的发酵酵母，除用于酿造啤酒外，还常用于发酵面包。啤酒酵母菌菌体维生素、蛋白质含量高，可作食用、药用和饲料酵母，还可以从其中提取细胞色素c、核酸、谷胱甘肽、凝血质、辅酶a和三磷酸腺苷等。啤酒酵母几乎不含脂肪、淀粉和糖，含有绝佳的蛋白质、完整的b族维生素、多种生物态矿物质及优质膳食纤维。由于啤酒酵母菌的特性被深入认识，啤酒酵母现广泛应用于瘦身、糖尿病、脂肪肝、维生素b缺乏等保健领域。如果能将其成功应用于黄精的发酵工艺，不仅是一项很大的创新，而且势必对黄精药材的进一步开发起到至关重要的作用。
技术实现要素：
针对现有技术存在的问题，本发明提供一种利用啤酒酵母菌固态发酵黄精的工艺方法，该方法可显著降低黄精的刺激性，缩短黄精加工时间，提高黄精药材的质量和疗效。本发明的技术方案为：
一种利用啤酒酵母菌固态发酵黄精的工艺方法，包括以下步骤：
步骤1、取干净鲜黄精，蒸30min～2h后切1～2mm厚片，烘干后紫外线照射30～40min，得到发酵底物；
步骤2、取啤酒酵母菌菌种，在固体培养基上划线培养，将获得的单菌落用液体培养基培养；
步骤3、将步骤2中的菌液按照3:100的比例接入液体培养基培养至对数期末期，得到啤酒酵母菌发酵液；
步骤4、将步骤1中的发酵底物和步骤3中的发酵液进行固态发酵；
步骤5、固态发酵结束后，将发酵混合物烘干后粉碎。
进一步地，所述步骤2中在固体培养基上划线培养的时间为45～60h。
进一步地，所述固体培养基的组成为：麦芽汁干粉0.131g/ml，琼脂0.02g/ml。
进一步地，所述步骤2中将获得的单菌落用液体培养基培养的条件为：温度37℃，转速180rpm，培养时间7～10h。
进一步地，所述步骤3中的培养条件为：温度37℃，转速120rpm。
进一步地，所述液体培养基的组成为：麦芽汁干粉0.131g/ml。
进一步地，所述步骤4中固态发酵的条件为：菌料比5～25％，发酵温度37℃，时间40～60h。
进一步地，所述步骤4中固态发酵的条件优选为：菌料比15％，发酵温度37℃，时间48h。
进一步地，所述烘干的条件为：温度55～65℃，时间20min～6h。
本发明的有益效果是：本发明利用啤酒酵母菌对黄精进行发酵，在降低黄精的生黄精刺激性的同时，能产生淡淡的持久香气，为开发黄精茶和饮品奠定基础。并且，药理实验证明，利用啤酒酵母菌发酵后的黄精能显著增强小鼠的脾和胸腺的脏器指数，且能够降低mda的含量，增加肝糖原和肌糖原的含量，还能延长小鼠的力竭游泳时间。这说明黄精发酵后能发挥更好的抗疲劳、抗氧化和免疫增强作用。
具体实施方式
本发明实施例采用的啤酒酵母菌的菌株(sac-charomycescerevisiae)购于上海鲁微科技有限公司，菌株保藏号为atcc9763。
在本发明的描述中，需要说明的是，实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
下面结合具体的实施例对本发明做进一步详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。
实施例1
本实施例提供一种利用啤酒酵母菌固态发酵黄精的工艺方法，包括以下步骤：
步骤1、取干净鲜黄精，蒸1h后切2mm厚片，于60℃烘2h后用紫外灯照射30min，得到发酵底物；
步骤2、取啤酒酵母菌菌种，在固体培养基上划线培养45h，将获得的单菌落用液体培养基于37℃、转速180rpm、培养7h；
步骤3、将步骤2中的菌液按照3:100的比例接入液体培养基，于37℃、120rpm的条件下培养至对数期末期，得到啤酒酵母菌发酵液；
步骤4、将步骤1中的发酵底物和步骤3中的发酵液进行固态发酵，固态发酵条件为：菌料比5％，发酵温度37℃，时间40h；
步骤5、固态发酵结束后，将发酵混合物于60℃烘2h后粉碎。
所述固体培养基的组成为：麦芽汁干粉0.131g/ml，琼脂0.02g/ml。
所述液体培养基的组成为：麦芽汁干粉0.131g/ml。
实施例2
本实施例提供一种利用啤酒酵母菌固态发酵黄精的工艺方法，包括以下步骤：
步骤1、取干净鲜黄精，蒸1h后切2mm厚片，于60℃烘1h后用紫外灯照射30min，得到发酵底物；
步骤2、取啤酒酵母菌菌种，在固体培养基上划线培养50h，将获得的单菌落用液体培养基于37℃、转速180rpm、培养7h；
步骤3、将步骤2中的菌液按照3:100的比例接入液体培养基，于37℃、120rpm的条件下培养至对数期末期，得到啤酒酵母菌发酵液；
步骤4、将步骤1中的发酵底物和步骤3中的发酵液进行固态发酵，固态发酵条件为：菌料比15％，发酵温度37℃，时间48h；
步骤5、固态发酵结束后，将发酵混合物于60℃烘2h后粉碎。
所述固体培养基的组成为：麦芽汁干粉0.131g/ml，琼脂0.02g/ml。
所述液体培养基的组成为：麦芽汁干粉0.131g/ml。
实施例3
本实施例提供一种利用啤酒酵母菌固态发酵黄精的工艺方法，包括以下步骤：
步骤1、取干净鲜黄精，蒸1h后切2mm厚片，于60℃烘2h后用紫外灯照射30min，得到发酵底物；
步骤2、取啤酒酵母菌菌种，在固体培养基上划线培养60h，将获得的单菌落用液体培养基于37℃、转速180rpm、培养8h；
步骤3、将步骤2中的菌液按照3:100的比例接入液体培养基，于37℃、120rpm的条件下培养至对数期末期，得到啤酒酵母菌发酵液；
步骤4、将步骤1中的发酵底物和步骤3中的发酵液进行固态发酵，固态发酵条件为：菌料比25％，发酵温度37℃，时间55h；
步骤5、固态发酵结束后，将发酵混合物于60℃烘1h后粉碎。
所述固体培养基的组成为：麦芽汁干粉0.131g/ml，琼脂0.02g/ml。
所述液体培养基的组成为：麦芽汁干粉0.131g/ml。
对比例1
本实施例提供一种发酵黄精的工艺方法，按照传统“九蒸九晒”的工艺方法，具体操作为：将干净鲜黄精去须根，上锅蒸6h，取出晾干，晒一日再蒸，如此反复3～4次，直到内心出现黑色，浊润时为止，取出晒干或用微火烘干，粉碎。
实施例4
对实施例1～3、对比例1制备的黄精粉以及生黄精进行质量检测：
1)性状特征比较
取实施例1～3、对比例1以及生黄精，从颜色、质地、气、味等对黄精质量进行比对，结果如表1所示。
表1黄精发酵前后性状比较
2)黄精多糖含量的测定
a、标准曲线的制备
以无水葡萄糖为对照品，配制对照品溶液，取溶液0.2ml于洁净玻璃试管中。应用苯酚-硫酸法，加5％苯酚溶液0.2ml，摇匀，迅速加入浓硫酸1ml，摇匀后置于室温下反应40min。取反应后的溶液0.2ml于96孔板中，用酶标仪测定葡萄糖溶液在490nm波长下的吸光度，绘制标准曲线。
b、多糖测定
取实施例1～3、对比例1制备的黄精粉以及鲜黄精样本，60℃干燥至恒重后取0.25g，精密称定，置圆底烧瓶中，加80％乙醇150ml，置水浴中加热回流1小时，趁热滤过，残渣用80％热乙醇洗涤3次，每次10ml。将残渣及滤纸置烧瓶中，加水150ml，置沸水浴中加热回流1小时，趁热滤过，残渣及烧瓶用热水洗涤4次，每次10ml，合并滤液与洗液，放冷，转移至250ml量瓶中，加水至刻度，摇匀，获得供试品溶液。运用对照品测吸光度的方法测定供试品溶液的吸光度，根据标准曲线获得样品中无水葡萄糖的浓度(mg/ml)，最后确定发酵后黄精的多糖含量。测定结果如表2所示，公式如[1]所示：
表2黄精多糖含量
3)黄精浸出物含量的测定
取实施例1～3和对比例1以及鲜黄精样品，每个样品约2g。精密称定，置100ml的锥形瓶中，精密加乙醇50ml，密塞，称定重量。静置1小时后，连接回流冷凝管，加热至沸腾，并保持微沸1小时。放冷后，取下锥形瓶，密塞，再称定重量，用乙醇补足减失的重量，摇匀，用干燥滤器滤过。精密量取滤液25ml，置已干燥至恒重的蒸发皿中，在水浴上蒸干后。于105℃干燥3小时，置干燥器中冷却30分钟，迅速精密称定重量。以干燥品计算供试品中水溶性浸出物的含量(％)。测定结果如表3所示，计算公式如式[2]所示：
水溶性浸出物的含量(％)＝【m2-m0】*v/25m1*100％，[2]
式[2]中，m0为干燥至恒重的蒸发皿重量，m1为供试品质量，m2为干燥至恒重的蒸发皿和供试品的总重量，v为滤液的体积)
表3黄精浸出物含量
4)总皂苷的含量测定
a、对照品溶液的制备
精密称取薯蓣皂苷对照品2.0mg，置于5ml容量瓶中，加甲醇溶解并稀释到刻度，摇匀，即得每1ml含0.4mg薯蓣皂苷对照品溶液。
b、供试品溶液制备
取实施例1～3、对比例1制备的黄精粉以及鲜黄精样本，60℃干燥至恒重后精密称取0.5g，加乙醇15ml，60℃超声提取50min，过滤，药渣加入15ml80％乙醇，60℃超声提取45min，过滤，合并两次滤液。定容到50ml容量瓶中即得供试品溶液。
c、检测波长的确定
分别吸取对照液0.5ml、供试液0.1ml于具塞试管，水浴中挥干甲醇，精密加入新配制的5％(w/v)香草醛冰醋酸溶液:高氯酸(2:8，v/v)混合液1.0ml，摇匀，置60℃水浴25min，迅速置冷水中冷却，后加入5ml冰醋酸，摇匀，用紫外-可见分光光度计在400-700nm范围内扫描，确定最大吸收波长为测定波长，为550nm。
d、标准曲线制备
分别精密吸取0，0.05，0.10，0.20，0.30，0.40，0.50，0.60ml对照品溶液于具塞试管，水浴挥干甲醇，精密加入新配置的5％(w/v)香草醛冰醋酸溶液：高氯酸(2：8)混合液1.0ml，摇匀，置60℃水浴25min，迅速置冷水中冷却，后加入5ml冰醋酸，摇匀。以试剂空白为对照，于测定波长处测定吸光度值a。以在550nm处测定的a值为纵坐标，以薯蓣皂苷含量x为横坐标，绘制标准曲线，得到线性回归方程。
e、测定法
精确量取供试品溶液0.1ml于具塞试管，水浴挥干甲醇，按c、中方法显色，以试剂空白为对照，于测定波长处测定a值，并根据标准曲线计算含量，取3次平均值作为测量结果。结果如表4所示。
表4黄精总皂苷含量
通过表1～4的数据，可以看出，黄精经过发酵后浸出物、多糖和总皂苷的含量比传统“九蒸九制”所得样品和生黄精均有所增加，其中以实施例2含量最高。可见，用啤酒酵母菌固态发酵黄精后，不仅去除了它的麻味和刺喉感，增加了香气，还使得有效成分含量明显增加。
实施例5
药理试验
一、受试物药物的制备
(1)发酵黄精提取液的制备
取实施例1～3和对比例1制备的黄精，加10倍量蒸馏水，浸泡30min，用文火煎煮0.5h，第二次加8倍量的蒸馏水文火煎煮0.5h，合并2次煎出液，静置过滤去渣，浓缩为生药量0.60g/ml的黄精提取液，备用。
(2)生黄精和人参提取液的制备
取生黄精和人参，分别加10倍量蒸馏水，浸泡30min，用文火煎煮0.5h，第二次加8倍量的蒸馏水文火煎煮0.5h，合并2次煎出液，静置过滤去渣，浓缩为生药量0.60g/ml的生黄精提取液和人参提取液。
二、实验动物分组及处理
清洁级雄性昆明种小鼠70只。随机分为7组，每组10只，分别为实施例1～3组，对比例1组，生黄精对照组，人参对照组和空白组。各给药组药液浓度均为生药量0.60g/ml。以上7组，按灌胃体积0.1ml/10g灌胃给药，阴性对照组(空白组)灌以相同体积的生理盐水。每天早晚各灌胃1次，连续灌胃15d，末次给药30min后，进行负重游泳力竭实验。
三、小鼠力竭游泳实验方法
根据步骤二中的给药方式：每天早晚各灌胃1次，连续灌胃15d，每次灌药按照0.1ml/10g，药物浓度已知，就可以指导每天给药量，根据小鼠体重不同，给药量会有所差异。在小鼠尾根部负以牛津杯(小鼠体重的5％)，放入水温(25.0±0.5)℃，水深40cm的游泳箱中，用秒表记录自游泳开始至力竭的时间。力竭的评判标准为小鼠沉没后5s仍不能浮出水面。
四、血清mda含量测定
小鼠进行游泳力竭实验后，眼球采血，放入4℃冰箱中保存。取血液在4℃下离心，转速为3500r/min，取上层清液，按试剂盒测定方法检测血清mda含量。
五、肝糖元和肌糖元的测定
游泳结束，立即处死小鼠，取出肝脏和肌肉，放入-80℃冰箱中保存。用糖元测试试剂盒进行测定。
六、胸腺指数、脾脏指数
将小鼠处死，立即取出胸腺和脾脏，用生理盐水洗净，吸干，称重，以脏器湿重(mg/g)表示胸腺指数和脾脏指数。
七、结果统计
采用统计学方法进行据分析。应用spss20统计软件，进行单因素方差分析，计量资料以平均值
1)力竭游泳实验结果
如表5数据所示，6个给药组和生理盐水组相比，均能显著提高小鼠力竭游泳时间，其中人参对照组和实施例2组有极显著差异，实施例2组时间最长，可见不同黄精给药组和人参对照组均具有抗疲劳的作用，其中以实施例2组作用最强。和人参对照组相比，生理盐水组、生黄精对照组和对比例组的小鼠力竭游泳时间均显著降低，而实施例1、3组，时间降低，但无统计学差异，实施例2组时间高于人参对照组，但无统计学差异。可见固态发酵后的黄精的抗疲劳效果显著增加，实施例2组和人参相当。
表5黄精提取液对小鼠游泳时间的影响(n＝10)
注：“*”代表与生理盐水组作对照有显著性，“**”代表与生理盐水组作对照有极显著性；
“△”代表与人参组做对照有显著性，“△△”代表与人参组做对照有极显著性。
2)糖原测定
如表6数据所示，6个给药组和生理盐水组相比，均能显著增加肝糖原和肌糖原的含量，其中人参对照组和实施例2组有极显著差异，实施例2组肝糖原和肌糖原含量最高，可见不同黄精给药组和人参对照组均具有抗疲劳的作用，其中以实施例2组作用最强。和人参对照组相比，生理盐水组、生黄精对照组和对比例组的肝糖原和肌糖原含量均显著降低，实施例1、3组虽有降低，但无统计学差异，实施例2组的含量高于人参对照组，但无统计学差异。可见固态发酵后的黄精的抗疲劳效果显著增加，其中实施例2的黄精和人参相当。
表6黄精提取液对运动疲劳小鼠糖原的影响
注：“*”代表与生理盐水组作对照有显著性，“**”代表与生理盐水组作对照有极显著性；
“△”代表与人参组做对照有显著性，“△△”代表与人参组做对照有极显著性。
3)血清mda测定
如表7数据所示，6个给药组和生理盐水组相比，均能显著降低mda的含量，其中人参对照组和实施例2组有极显著差异，实施例2组mda含量最低，可见不同黄精给药组和人参对照组均具有抗氧化的作用，其中以实施例2组作用最强。和人参对照组相比，除生理盐水组和生黄精对照组mda含量显著高于对照组外，其余各组均无统计学意义的差异，实施例2组的mda含量略低于人参对照组，黄精各加工组的含量均低于生黄精对照组，可见黄精经过加工后，能提高其抗氧化效果，其中实施例2的效果最好。
表7黄精提取液对运动疲劳小鼠血清mda的影响
注：“*”代表与生理盐水组作对照有显著性，“**”代表与生理盐水组作对照有极显著性；
“△”代表与人参组做对照有显著性，“△△”代表与人参组做对照有极显著性。
4)脏器指数测定
如表8数据所示，黄精加工组和生理盐水组相比，均能显著增加脾脏和胸腺指数，其中人参对照组和实施例2组有极显著差异，实施例2组脾脏指数最高，生黄精对照组和生理盐水组无显著差异，可见不同加工后的黄精给药组和人参对照组均具有免疫增强的作用。和人参对照组相比，除生理盐水组和生黄精对照组脾脏指数和胸腺指数显著低于对照组外，其余各组均无统计学意义的差异，实施例2组的脾脏指数和胸腺指数高于人参对照组，可见黄精经过加工后，能提高其免疫增强作用，其中实施例2的效果最好。
表8黄精提取液对运动疲劳小鼠脏器指数的影响
注：“*”代表与生理盐水组作对照有显著性，“**”代表与生理盐水组作对照有极显著性；
“△”代表与人参组做对照有显著性，“△△”代表与人参组做对照有极显著性。
综上，黄精经过加工后可以提高其抗疲劳、抗氧化和增强免疫的作用，啤酒酵母菌固态发酵黄精比传统加工方法的增强效果更明显，其中以实施例2组效果最好。可见本发明的新型加工方法，能够达到增强黄精疗效的实际应用效果。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。