表没食子儿茶素没食子酸酯在制备抗猪链球菌药物中的应用的制作方法

本发明属于兽药技术领域，具体涉及表没食子儿茶素没食子酸酯在制备抗猪链球菌药物中的应用。

背景技术：

猪链球菌是一种人畜共患的传染病病原菌，能引起脑膜炎、败血症、关节炎、心内膜炎、肺炎，导致猪甚至人的感染死亡。猪链球菌病不仅对养猪业造成了重大的经济损失，而且对人类公共卫生安全构成了巨大威胁。根据细菌荚膜多糖抗原特异性的不同，猪链球菌被分为33种血清型，在众多血清型中，猪链球菌2型致病性最强，也是经常从病死猪中分离出来的优势血清型。

控制猪链球菌病的重点是预防为主，兼以抗生素治疗。然而，近年来，随着抗生素的大量、不合理使用，导致细菌性病原的耐药性非常严重。临床实验数据显示，不同国家和地区分离的猪链球菌都出现了不同程度的耐药性。法国学者marie分离的猪链球菌中，几乎所有的菌株都对青霉素g、阿莫西林、头孢噻呋、氟苯尼考、庆大霉素、杆菌肽锌敏感,耐药性最为严重的是多西环素、大环内酯类以及林可胺类抗生素。韩国学者dong检测了本国猪体内分离到的55株猪链球菌对于临床常用的四环素、庆大霉素和壮观霉素均耐药。我国学者从山东发病猪分离的53株猪链球菌对常用抗生素耐药率高，耐药情况复杂，特别是对四环素、链霉素、卡那霉素和林可霉素的耐药率均在80％以上，而磺胺类药物耐药率达到73％，β-内酰胺类药物耐药率也达到20％。广西分离的32株猪链球菌耐药性非常普遍，且耐药谱广，对阿莫西林均具有耐药性，耐药率为100％，分离株对3种以上抗生素都具有耐药性，呈多重耐药性。因此，寻找新的抗生素替代物和开发新型抗菌药物已经迫在眉睫。茶多酚是从茶叶中分离提纯的多酚类化合物，对自然界中十余种类群的近百种病原菌均有优异的抗菌活性。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是克服现有猪链球菌耐药性严重的问题，提供表没食子儿茶素没食子酸酯(egcg)在制备抗猪链球菌药物中的应用。该物质对猪链球菌有很好的抑菌和杀菌作用，在猪链球菌病的防治方面具有很好的应用前景。

为实现上述目的，本采取以下技术方案：

表没食子儿茶素没食子酸酯(egcg)制备抗猪链球菌药物中的应用，包括在制备治疗或预防猪链球菌感染的药物中的应用，包括利用该物质抑制体外的猪链球菌的生长，或者直接灭杀猪链球菌；或者制备成制剂用于猪链球菌感染的疾病的药物。

以上所述的应用中，优选的，所述的猪链球菌为猪链球菌2型。

与现有技术相比，本发明具有以下优点和效果：

本发明首次发现表没食子儿茶素没食子酸酯可用于抗猪链球菌。本发明通过多种方法研究证实了表没食子儿茶素没食子酸酯对猪链球菌有很好的抗菌效果，为研制抗猪链球菌病的新型药物奠定了理论基础，乃至为抗生素替代物发掘提供了候选物质，在猪链球菌病的防治方面具有很好的应用前景。

而且，茶多酚类物质具有以下优点：抗癌、抗衰老、抗氧化、抗辐射、抗菌、抗病毒等作用。茶多酚类物质对食品中的色素和维生素类具有保护作用，使食品在较长时间内保持原有色泽与营养水平，能有效防止食品、食用油类的腐败，并能消除异味，在食品贮藏方面的广泛应用为其在畜牧业使用奠定了安全基础。另外，已验证茶多酚在细胞水平上对细胞无毒性，且其具有抗氧化能力强，无毒副作用，无异味等特点，可口服，对机体无刺激、安全无毒性，无三致作用，有望成为新型的防治猪链球菌病的生物活性分子，为茶多酚类物质对猪链球菌的抗菌药物研发提供了先决条件，在猪链球菌病的防治方面具有很好的应用前景，而且为茶多酚类物质成为抗生素替代物的推广应用提供了理论基础。

附图说明

图1为表没食子儿茶素没食子酸酯抗猪链球菌生长的生长曲线动态分析。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。本发明实施例以猪链球菌中的猪链球菌2型为例进行说明，其他的猪链球菌本发明所述物质对其也具有抑制和杀灭作用。

本发明以下实施例的统计学分析：所有试验至少3次独立重复，结果采用平均值和标准误表示，使用单因素方差分析和t检测分析。所有统计分析均采用以p<0.05作为具有显著统计学差异的检验标准，分析软件为graphpadprism5。

实施例1：

表没食子儿茶素没食子酸酯对猪链球菌最小抑菌浓度和最小杀菌浓度测定：

1、材料

mueller-hinton(mh)肉汤(购自bd公司)，用于药物敏感实验，检测药物的抑菌效力。

2、试验方法

用无菌接种环挑取纯化的猪链球菌2型sc19菌落，充分分散于mh液体培养基，用麦氏比浊法制备浓度为0.5麦氏比浊标准菌悬液；

用mh液体培养基倍比稀释后不同浓度的表没食子儿茶素没食子酸酯溶液分别加到无菌的96孔聚苯乙烯板中，第1至第10孔加表没食子儿茶素没食子酸酯溶液，每孔50μl，第11孔加mh液体培养基50μl作为生长对照，第12孔只加mh液体培养基100μl作为阴性对照。

用mh肉汤将0.5麦氏比浊标准菌悬液1∶1000稀释后，向第1至第11孔中加50μl菌悬液，37度孵育16-20h，观察有无细菌生长，判断mic值。吸取每孔菌液，涂布mh平板中，计数少5个菌落则为mbc值。

3、结果

由表1可知，当表没食子儿茶素没食子酸酯浓度为512μg/ml时，其对猪链球菌生长具有抑制作用，当表没食子儿茶素没食子酸酯浓度为1024μg/ml时，其对猪链球菌具有杀菌作用。

表1表没食子儿茶素没食子酸酯对猪链球菌最小抑菌浓度和最小杀菌浓度

实施例2：

表没食子儿茶素没食子酸酯对猪链球菌2型生长曲线的抑制作用：

用无菌接种环挑取纯化的猪链球菌2型sc19菌落，充分分散于mh液体培养基，用麦氏比浊法制备浓度为0.5麦氏比浊标准菌悬液。

用mh液体培养基倍比稀释后不同浓度的表没食子儿茶素没食子酸酯溶液分别加到无菌的细菌瓶中，生长对照只有mh液体培养基无表没食子儿茶素没食子酸酯溶液。

将0.5麦氏比浊标准菌悬液等量接种于上述细菌瓶，放置37度摇床震荡培养，每隔两小时取菌液倍比稀释涂布mh平板进行活菌计数，结果用cfu/ml表示。

由图1可知，当表没食子儿茶素没食子酸酯浓度为256μg/ml时(即0.5mic值)，与没加表没食子儿茶素没食子酸酯对照组相比，每个时间点的菌数没有明显差异。当表没食子儿茶素没食子酸酯浓度为512μg/ml时(即1mic值)，与没加表没食子儿茶素没食子酸酯对照组相比，每个时间点的菌数差异显著，表明表没食子儿茶素没食子酸酯浓度为512μg/ml时对猪链球菌具有抑菌作用。当表没食子儿茶素没食子酸酯浓度为1024μg/ml时(即2mic值)，培养到第二个小时猪链球菌全被杀死。

以上结果表明，表没食子儿茶素没食子酸酯不仅能抑制猪链球菌2型生长，还能杀灭猪链球菌2型。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。