以乙酰紫草素为代表的几种中药单体在抗肠道病毒D68型感染中的应用的制作方法

本发明涉及药学的技术领域，具体说是乙酰紫草素、紫草素、没食子儿茶素、杨梅素和桑根酮d在抗肠道病毒d68型感染中的应用。

背景技术：

肠道病毒d68型(enterovirusd68，简称ev-d68)可感染呼吸道，可见于呼吸道分泌物，人与人之间可通过密切接触，咳嗽或喷嚏传播。易感人群多为小儿，侵犯的主要脏器为肺，其引发的呼吸道疾病的最初症状与普通感冒类似，包括发烧、肌肉酸疼、打喷嚏、咳嗽和红疹、腹痛。也有报道证实ev-d68与重症呼吸系统疾病有关，可以加剧哮喘和肺炎，引发高热昏厥和致死性神经系统感染，个别病例感染后可出现心肺功能衰竭和中枢神经系统并发症，甚至引发死亡。目前为止没有针对ev-d68的疫苗，也没有获批的特效药物用于抗病毒治疗。

ev-d68于1962年首次从美国加利福尼亚4名支气管炎和肺炎患者的鼻咽拭子中分离出来，后罕有报道。直到2014年ev-d68几乎在全美暴发流行才引起广泛关注。在2014年下半年，该病毒从美国中西部向全国蔓延，全美48个州报道有1153人因感染ev-d68病毒而引起严重呼吸系统疾病，确认感染病毒的患者中有14例死亡，成为有史以来最严重的一次ev-d68暴发流行。2014年8月，美国疾病预防控制中心报道称近期重症呼吸系统疾病的病例数比去年同期上升，采集的鼻咽拭子检测结果显示肠道病毒的感染增多。对近期发病的重症患者的鼻咽拭子样品进行基因测序，结果显示80％左右的病例为ev-d68感染。近几年该病毒在其他多个国家也频繁暴发，中国在2006年检出ev-d68感染病例，2014年在香港收集的1461份呼吸道样品中ev-d68检出24例，2015年在深圳4名患病儿童体内检测出ev-d68。

ev-d68属于小rna病毒科，肠道病毒属，为无包膜单股正链rna病毒。该病毒基因组全长约7400bp，由1条两端为非编码区的单一开放阅读框组成，开放阅读框编码1个前体多聚蛋白，然后不断被自身蛋白酶水解切割成4个结构蛋白和7个非结构蛋白。最新研究揭示了ev-d68的3c蛋白酶剪切tir结构域衔接蛋白和干扰素调节因子7，从而抑制宿主toll样受体3调节的先天免疫应答和干扰素的合成。这些结果表明3c蛋白酶在ev-d68破坏宿主免疫过程起到重要的作用。所以，该ev-d68的3c蛋白酶也成为一个关键的抗病毒药物靶标。所以针对ev-d68的3c蛋白酶进行抑制剂筛选对ev-d68相关的药物研发具有很大的意义。

但迄今为止，乙酰紫草素、紫草素、没食子儿茶素、杨梅素和桑根酮d在肠道病毒d68型感染中的应用未见报道。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供乙酰紫草素、紫草素、没食子儿茶素、杨梅素、桑根酮d等中药单体在抗肠道病毒d68型感染中的应用。

本发明针对肠道病毒d68型3c蛋白酶的抑制剂，抑制剂分别为乙酰紫草素、紫草素、没食子儿茶素、杨梅素和桑根酮d。

本发明所涉及乙酰紫草素cas号为24502-78-1，紫草素cas号为517-89-5，没食子儿茶素cas号为3371-27-5，杨梅素cas号为529-44-2，桑根酮dcas号为81422-93-7购买于成都瑞芬思。通过设立阴性对照，发现乙酰紫草素、紫草素、没食子儿茶素、杨梅素和桑根酮d等中药单体对肠道病毒d68型3c蛋白酶有很好的抑制活性，因此上述化合物有望作为抑制肠道病毒d68型的潜在药物。

本发明提供几种用于预防或治疗含有肠道病毒d68型感染的药物，其活性成分分别为乙酰紫草素、紫草素、没食子儿茶素、杨梅素和桑根酮d，该药物包含上述含有乙酰紫草素、紫草素、没食子儿茶素、杨梅素和桑根酮d以及一种或多种药学上可接受的载体。所述载体包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂、增效剂。该药物可制成注射剂、片剂、丸剂、胶囊、悬浮剂或乳剂的形式使用。其给药途径可为口服、经皮、静脉或肌肉注射。

本发明具有的优点和积极效果是：

本发明的针对肠道病毒d68型3c蛋白酶的抑制剂，这几种抑制剂分别为乙酰紫草素、紫草素、没食子儿茶素、杨梅素和桑根酮d。乙酰紫草素、紫草素、没食子儿茶素、杨梅素、桑根酮d等中药单体对肠道病毒d68型3c蛋白酶活性具有显著的抑制效果。

附图说明

图1是乙酰紫草素对ev-d683cprotease抑制作用示意图

图2是紫草素对ev-d683cprotease抑制作用示意图

图3是没食子儿茶素对ev-d683cprotease抑制作用示意图

图4是杨梅素对ev-d683cprotease抑制作用示意图

图5是桑根酮d对ev-d683cprotease抑制作用示意图

具体实施方式

以下通过具体实施例对本发明中的技术方案进行详细说明：

本发明采用的肠道病毒d68型3c蛋白酶的表达、纯化等方法步骤及化合物筛选方法参考文献方法(tanj,georges,kusovy,etal.3cproteaseofenterovirus68:structure-baseddesignofmichaelacceptorinhibitorsandtheirbroad-spectrumantiviraleffectsagainstpicornaviruses[j].journalofvirology,2013,87(8):4339.)，肠道病毒d68型的3c蛋白酶的活性测定采用纯度大于95％的dabcyl-kealfqgppqf-glu(edans)-nh2作为底物；荧光强度测定的仪器为m1000pro全波长多功能微孔板检测仪，激发光和发射光的波长分别为340nm和490nm；蛋白缓冲液组分为20mmtris，ph7.3，100mmnacl，1mmedta；用缓冲液配置ev-d683c蛋白酶(终浓度560nm)，加入溶解于dmso的化合物(终浓度为20μm)，室温放置5min,迅速加入荧光底物dabcyl-kealfqgppqf-glu(edans)-nh2，底物终浓度为20μm。每10s记录一次荧光读数，共测定1500s。654rpm震荡5s,检测荧光值。阴性对照不加备选样品，其他实验条件均相同。

以时间为x轴，荧光值为y轴可得酶活动力学曲线。通过酶标仪记录的酶反应的相关参数，根据荧光强度以及反应时间，采用graphpadprism5.0软件分析前400s的酶促反应的速率。设定v0为不加抑制剂的酶促反应的初速度，vi为加抑制剂的酶促反应的初速度。根据酶促反应速率，计算出每个化合物的剩余活性ra(residualactivity，ra)(vi/v0)以及抑制率ir(inhibitionrate，ir)(1-vi/v0)。

对于剩余活性<30％的化合物进行复筛，排除操作失误造成假阳性的可能。对于剩余活性<30％的化合物，设计荧光淬灭实验。综合考虑化合物的剩余活性百分率和荧光淬灭率就可以判断化合物对ev-d683c蛋白酶的抑制效果。因为该体系主要是通过荧光强度筛选，所以，当有荧光的化合物或者是与edans类似的化合物都会对体系产生干扰。另外，很多与dabcyl类似的结构会淬灭体系的荧光而造成假阳性，为了排除假阳性结果，我们采用先将蛋白酶与荧光底物反应一段时间，让体系荧光达到最大值q1、再在体系中加入与实验组等量的化合物，并检测体系的荧光值大小为q2。将两者的荧光值按照公式计算得出荧光淬灭率qr(qr＝(q1-q2)/q2*100％)。当荧光淬灭率高于20％为假阳性结果需排除，当荧光淬灭率低于20％为阳性结果。

以上所述仅为本发明的具体实施方式，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

本发明涉及药学的技术领域，具体说是乙酰紫草素、紫草素、没食子儿茶素、杨梅素、桑根酮d等中药单体在抗肠道病毒d68型感染中的应用。乙酰紫草素、紫草素、没食子儿茶素、杨梅素、桑根酮d等中药单体在抑制肠道病毒d68型3c蛋白酶时候其ir都在80％以上，在制备抗肠道病毒d68型小分子抑制剂方面有很大应用潜力。