异甘草素的新用途的制作方法

本发明涉及异甘草素及其衍生物的新用途，具体涉及异甘草素及其衍生物治疗和/或预防白血病的用途。
背景技术：
：白血病是一类造血干细胞恶性克隆性疾病。克隆性白血病细胞因为增殖失控、分化障碍、凋亡受阻等机制在骨髓和其他造血组织中大量增殖累积，并浸润其他非造血组织和器官，同时抑制正常造血功能。临床可见不同程度的贫血、出血、感染发热以及肝、脾、淋巴结肿大和骨骼疼痛。据报道，我国各地区白血病的发病率在各种肿瘤中占第六位。急性髓细胞性白血病(acutemyeloidleukemia，aml)是髓系造血干/祖细胞恶性疾病。以骨髓与外周血中原始和幼稚髓性细胞异常增生为主要特征，临床表现为贫血、出血、感染和发热、脏器浸润、代谢异常等，多数病例病情急重，预后凶险，如不及时治疗常可危及生命。本病占小儿白血病的30％。在分子生物学改变及化疗反应方面儿童aml与成人(<50岁)相似。婴幼儿的aml比成人易发生髓外白血病。根据目前的认识，白血病的确切病因尚不明，但与地域环境因素、电离辐射、化学接触、酗酒与吸烟，以及与机体对某些病毒感染所致的特殊反应有关。此外，近年来通过基因突变频率和一些易患生物标记研究发现，它可能是遗传学和环境因素共同作用的结果。临床中急性骨髓系白血病可分为m0～m7一共8种。其中30％的急性髓性白血病患者和7％的急性淋巴性白血病患者会出现flt3-itd型突变，且伴有该突变的患者大多具有预后不良，容易对传统化疗药物耐药等特征。目前白血病的治疗方法包括放疗、支持疗法和造血干细胞移植，治疗药物为柔红霉素(dnr)、伊达比星(去甲氧柔红霉素)、阿柔比星(阿克拉霉素)、米托蒽醌(mito)、鬼臼类(依托泊苷和替尼泊苷)、阿霉素(多柔比星)、高三尖杉酯碱、安吖定(amsa，胺苯吖啶)、硫鸟嘌呤(6-tg)等。异甘草素(isl)为常见天然产物成分，具有抗炎、抗氧化、抗病毒、抗肿瘤等多种药理学活性。前期的研究发现无论从鸡血藤还是其它藤类中提取的异甘草素都具有抗乳腺癌的作用。无论是雌激素依赖的还是非依赖的细胞系都表现出了良好的抗增值作用。后续的研究还发现异甘草素可以促进其它化疗药物如柔美素对乳腺癌干细胞的敏感性。通过docking技术，我们发现isl可以作用grp78影响β-catenin/abcg2信号通路。目前未见isl在血液性疾病中，尤其是急性淋巴髓单核细胞白血病中的应用。技术实现要素：本发明的一个目的在于提供异甘草素及其衍生物在制备治疗白血病的药物中的应用；本发明的第二个目的在于提供异甘草素及其衍生物在制备抑制白血病细胞增殖的药物中的应用。本发明的第三个目的在于提供一种治疗白血病的药物组合物。本发明的目的是通过如下技术方案实现的：作为本发明的一个方面，本发明提供异甘草素及其衍生物在制备治疗白血病的药物中的应用；所述白血病包括临床上各类型急、慢性白血病，具体包括慢性淋巴细胞白血病、慢性粒细胞白血病、急性淋巴细胞白血病、急性非淋巴细胞白血病、急性髓细胞白血病。进一步，所述白血病为急性髓细胞白血病。进一步，异甘草素及其衍生物在制备抑制白血病细胞增殖的药物中的应用。从理论上讲，包含异甘草素的天然植物均具有治疗白血病的作用；此外由天然植物经常规提取得到的提取物同样具有上述作用。其中，所述包含异甘草素的天然植物如豆科植物鸡血藤、甘草、黄芪、红芪、串果藤等；所述提取物为水/乙醇提取物，或水/乙醇提取物经进一步分离纯化得到的提取物。作为本发明的另一个方面，本发明还进一步提供了异甘草素及其衍生物作为fms样的酪氨酸激酶3抑制剂的应用。作为本发明的另一个方面，本发明还进一步提供了一种治疗白血病的药物组合物，该组合物包括活性成分异甘草素或其衍生物及药学上可接受的辅料。在所述药物组合物中，异甘草素或其衍生物为“治疗有效量”的。所述的“有效量”是指无毒性，但足够量的提供所需的作用的药物或药剂。“有效量”会因受试者的不同而不同，依据年龄和个体的一般情况，特定的活性药物等等。因此，不可能总是指精确的“有效量”，然而，任何个体病例中合适的“有效量”可以由本领域普通技术人员应用常规的实验方法来测定。本发明组合物可按照常规工艺加入常规辅料制成药剂学可接受的任何制剂，如注射剂、胶囊剂、片剂、颗粒剂、凝胶剂、缓释剂、口服液、滴丸剂或纳米制剂；也可与其他相关药物配伍使用，制成相应的制剂。所述药学可接受的辅料包括：填充剂、崩解剂、润滑剂、助悬剂、粘合剂、甜味剂、矫味剂、防腐剂、基质等。填充剂包括：淀粉、预胶化淀粉、乳糖、甘露醇、甲壳素、微晶纤维素、蔗糖等；崩解剂包括：淀粉、预胶化淀粉、微晶纤维素、羧甲基淀粉钠、交联聚乙烯吡咯烷酮、低取代羟丙纤维素、交联羧甲基纤维素钠等；润滑剂包括：硬脂酸镁、十二烷基硫酸钠、滑石粉、二氧化硅等；助悬剂包括：聚乙烯吡咯烷酮、微晶纤维素、蔗糖、琼脂、羟丙基甲基纤维素等；粘合剂包括，淀粉浆、聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基甲基纤维素等。本发明所述异甘草素可以从市场购买，也可以从鸡血藤、甘草、红芪、黄芪、串果藤等豆科植物中提取或其它植物中提取得到，还可以从其他植物中分离纯化得到，也可以通过化学合成或生物合成方法得到，其结构式如下：本发明所述异甘草素衍生物为与异甘草素具有相同黄酮母核的化合物，本发明研究发现异甘草素衍生物同样具有治疗白血病的用途。进一步，本发明所述异甘草素衍生物为新异甘草素，结构如下：本发明研究表明，异甘草素及其衍生物对白血病细胞有非常强的抑制作用，而且在体内抑制白血病的作用良好，可以在副作用很小的情况下起到抑制的作用，临床应用前景良好。附图说明图1为异甘草素对细胞株的增殖抑制活性结果图图2为异甘草素对肿瘤体积的抑制结果图图3为异甘草素抗肿瘤靶点分析结果图具体实施方式实施例1异甘草素的体外抗肿瘤细胞增殖实验1实验材料1.1主要试剂rpmi-1640、imdm和dmem培养基、胎牛血清、胰酶购自gibco公司(lifetechnologiescorporation)。二甲基亚砜(dmso)、四甲基偶氮唑盐(mtt)为sigma公司(usa)产品。异甘草素购自alphaaesar。体外实验时用100％dmso配制成20mg/ml储存液，置-20℃冰箱避光保存备用，临用时用完全培养液稀释至所需浓度。1.2细胞系及培养本实验所用的人白血病细胞株mv4-11、molm-13，人肺癌细胞株a549，人肝癌细胞株hepg-2，人胃癌细胞株hgc-27，人结肠癌细胞hct116，人乳腺正常细胞mcf-10a等均购于美国atcc公司，由本实验室保存。以上细胞株用含10％胎牛血清、100u/ml青霉素、100μg/ml链霉素的rpmi-1640、imdm、或dmem培养基在5％co2、37℃条件下培养。2实验方法利用mtt法检测了异甘草素对多种肿瘤细胞的体外抑制活性实验，方法：采用含fbs和抗生素的rpmi-1640、dmem或imdm培养基对mv4-11、molm-13等多种肿瘤细胞进行培养，待肿瘤细胞生长至对数生长期时，收集细胞将其按照4000-15000细胞/孔的量接种到96孔板内。24h后，将梯度浓度的异甘草素加入培养基中，并置于细胞培养箱中培养。72小时后，加入5mg/ml的mtt无菌溶液，并在作用2-4小时后加入sds三联液过夜。最后，利用酶标仪检测各加样孔对570nm光束的吸光度值，并利用相应的计算公式计算抑制率并统计异甘草素对各细胞的半数抑制浓度，各数据重复三次，并计算平均值。3.实验结果异甘草素对各种细胞株的增殖抑制活性(ic50)结果如表1所示：表1异甘草素对各种细胞株的增殖抑制活性细胞株肿瘤类型ic50值(μg/ml)mv4-11急性髓性白血病0.85±0.32molm-13人急性髓性白血病1.27±0.53oci-ly10大b细胞淋巴瘤5.14±1.72a549非小细胞肺癌>10hgc-27人胃癌细胞株>10hepg-2人肝癌细胞株>10hct116人结肠癌>10mcf-10a人乳腺正常细胞>10由表1可以看出，异甘草素对伴有flt3-itd突变的mv4-11、molm-13等急性髓性白血病细胞株抑制活性明显优于其他肿瘤细胞株，ic50<2μg/ml。而对其他肿瘤细胞株和正常细胞株ic50大多大于10μg/ml，由此推断，异甘草素对急性髓性白血病细胞具有更好的选择性抑制作用。实施例2异甘草素对稳定表达flt3/itd突变或flt3-itd/f691l突变ba/f3细胞的选择性抑制活性1)实验材料1.1主要试剂rpmi-1640培养基、胎牛血清、胰酶购自gibco公司(lifetechnologiescorporation)。二甲基亚砜(dmso)、四甲基偶氮唑盐(mtt)为sigma公司(usa)产品。异甘草素购自alphaaesar。体外实验时用100％dmso配制成20mg/ml储存液，置-20℃冰箱避光保存备用，临用时用完全培养液稀释至所需浓度。1.2细胞系及培养本实验所用的稳定表达flt3/itd突变和flt3-itd/f691l突变ba/f3细胞，由本实验室构建和保存。以上细胞株用含10％胎牛血清、100u/ml青霉素、100μg/ml链霉素的rpmi-1640、imdm、或dmem培养基在5％co2、37℃条件下培养。2实验方法利用mtt法检测异甘草素对稳定表达flt3/itd突变和flt3-itd/f691l突变ba/f3细胞的体外抑制活性实验，方法：采用含fbs和抗生素的rpmi-1640对上述细胞进行培养，待肿瘤细胞生长至对数生长期时，收集细胞将其按照4000-15000细胞/孔的量接种到96孔板内。24h后，将梯度浓度的异甘草素加入普通培养基或含有10ng/mlil-3的培养基中，并置于细胞培养箱中培养。72小时后，加入5mg/ml的mtt无菌溶液，并在作用2-4小时后加入sds三联液过夜。最后，利用酶标仪检测各加样孔对570nm光束的吸光度值，并利用相应的计算公式计算抑制率并统计异甘草素对各细胞的半数抑制浓度，各数据重复三次，并计算平均值。3实验结果异甘草素对细胞株的增殖抑制活性结果如图1所示。由图1可以看出isl抗白血病细胞增值的作用是主要是通过抑制flt3-itd来实现的。实施例3异甘草素体内抗肿瘤活性实验本实验的目的是检测发明化合物的体内抗肿瘤效果。本实验使用nod-scid小鼠皮下急性髓性白血病细胞株mv4-11体内肿瘤模型测试异甘草素的体内抗急性髓性白血病活性。1实验材料imdm培养基、胎牛血清、胰酶等购自gibcobrl公司(lifetechnologiescorporation)，人急性髓性白血病细胞株mv4-11购于美国atcc公司，nod-scid小鼠购自中国北京协和实验动物中心。2实验方法使用6～8周龄nod-scid小鼠，按照约8×106个/0.1ml/只mv4-11细胞浓度接种于小鼠皮下后肋部构建急性髓性白血病肿瘤模型，待肿瘤长到150-300mm3后(约15天)，小鼠分组(n＝6)并开始口服给药。实验分组：药物溶剂对照组(5％dmso+20％peg400+75％水)；异甘草素100mg/kgq.d.口服给药；异甘草素50mg/kgq.d.口服给药；异甘草素25mg/kgq.d.口服给药；观察指标：每3天测量一次小鼠体重及肿瘤长径、短径并计算肿瘤体积(length×width2×0.5)，观察有无腹泻，抽搐，皮疹，体重明显降低等反应。3实验结果3.1异甘草素体内抗急性髓性白血病活性肿瘤体积的变化图如图2所示。由图2可以看出，异甘草素对人急性髓性白血病细胞株mv4-11具有明显的体内生长抑制作用，在25、50、100mg/kg/d剂量下，均可以明显抑制肿瘤生长，并呈剂量依赖关系。给药过程中但未发现动物出现皮疹、腹泻、死亡等现象。实验结果说明，本发明异甘草素在较低剂量的情况下给药，可以有效抑制白血病肿瘤，并且副作用较小。实施例4异甘草素结构改造的物质(新异甘草素)的抗肿瘤作用1实验材料1.1主要试剂rpmi-1640、imdm和dmem培养基、胎牛血清、胰酶购自gibco公司(lifetechnologiescorporation)。二甲基亚砜(dmso)、四甲基偶氮唑盐(mtt)为sigma公司(usa)产品。新异甘草素购自上海弘顺生物科技有限公司。体外实验时用100％dmso配制成20mg/ml储存液，置-20℃冰箱避光保存备用，临用时用完全培养液稀释至所需浓度。1.2细胞系及培养本实验所用的人白血病细胞株mv4-11、molm-13，人肺癌细胞株a549，人肝癌细胞株hepg-2，人胃癌细胞株hgc-27，人结肠癌细胞hct116，人乳腺正常细胞mcf-10a、baf3等均购于美国atcc公司，由本实验室保存。稳定表达flt3/itd突变和flt3-itd/f691l突变baf3细胞，由本实验室构建和保存。以上细胞株用含10％胎牛血清、100u/ml青霉素、100μg/ml链霉素的rpmi-1640、imdm、或dmem培养基在5％co2、37℃条件下培养。2实验方法利用mtt法检测了新异甘草素对多种肿瘤细胞的体外抑制活性实验，方法：采用含fbs和抗生素的rpmi-1640、dmem或imdm培养基对mv4-11、molm-13等多种肿瘤细胞进行培养，待肿瘤细胞生长至对数生长期时，收集细胞将其按照4000-15000细胞/孔的量接种到96孔板内。24h后，将梯度浓度的异甘草素加入培养基中，并置于细胞培养箱中培养。72小时后，加入5mg/ml的mtt无菌溶液，并在作用2-4小时后加入sds三联液过夜。最后，利用酶标仪检测各加样孔对570nm光束的吸光度值，并利用相应的计算公式计算抑制率并统计异甘草素对各细胞的半数抑制浓度，各数据重复三次，并计算平均值。3实验结果新异甘草素对各种细胞株的增殖抑制活性(ic50)结果如表2所示：表2新异甘草素对各种细胞株的增殖抑制活性由表2可以看出，新异甘草素对伴有flt3-itd突变的mv4-11、molm-13等急性髓性白血病细胞株抑制活性明显优于其他肿瘤细胞株，ic50<2μg/ml。而对其他肿瘤细胞株和正常细胞株ic50大于20μg/ml，由此推断，异甘草素对急性髓性白血病细胞具有更好的选择性抑制作用。同时，通过对比新异甘草素对ba/f3-flt3-itd、ba/f3-flt3-itd/f691l、wt-ba/f3三种细胞的抑制活性，可以看出新异甘草素抗白血病细胞增值的作用是通过抑制flt3来实现的实施例5异甘草素的作用机制研究本实验的目的是检测发明化合物抗肿瘤的靶点。本实验使用均相时间分辨荧光技术对多个酪氨酸蛋白进行活性测定，发现了异甘草酸作用的分子靶点。1、实验材料移液器、384平板、多标记微孔板检测仪(perkinelmer)、kineasetm、fms样的酪氨酸激酶3(flt3)和bruton酪氨酸激酶(btk)购自北京义翘神舟，表皮生长因子受体(egfr)、细胞周期检测点激酶1(chk1)通过昆虫表达系统融合表达，蛋白激酶b1(akt1)和auroraa通过大肠杆菌表达系统融合表达。2、实验原理htrf试剂盒中提供的底物具有单磷酸化位点，其一端接上了biotin。在biotin端，biotin能与streptavidin-xl665(acceptor)相连，完成标记。而在经过磷酸化之后，该底物便能与抗磷酸化位点的抗体(已标有donor)结合，从而产生fret信号。信号的强弱和酶的活力呈正相关。3、实验方法所有的实验按照试剂盒中提供的优化程序操作，实验的数据通过graphpad软件进行拟合。4、实验结果实验结果如图3。在体外实验中，异甘草素对egfr、chk1、akt1、aurora-a和flt3都有一定的抑制作用，但是对flt3的抑制作用最为明显。呈现了良好的选择性。表示可以在合理的剂量下，单一靶向flt3而对其它蛋白不产生直接抑制。实施例6取异甘草素或新异甘草素10g，加入注射剂(包括冻干粉针剂和无菌分装干粉针剂)适当辅料，按注射剂(包括冻干粉针剂和无菌分装干粉针剂)工艺制备成注射剂。实施例7取异甘草素或新异甘草素10g，加入片剂(包括缓控释片、骨架片、包衣片、分散片等)适当辅料，按片剂(包括缓控释片、骨架片、包衣片、分散片等)工艺制备成片剂。实施例8取异甘草素或新异甘草素10g，加入胶囊剂适当辅料，按胶囊剂工艺制备成胶囊剂。实施例9取异甘草素或新异甘草素10g，加入乳剂(包括微乳、纳米乳等)适当辅料，按乳剂(包括微乳、纳米乳等)工艺制备成乳剂。实施例10取异甘草素或新异甘草素10g，加入颗粒剂适当辅料，按颗粒剂工艺制备成颗粒剂。实施例11取异甘草素或新异甘草素10g，加入缓释控释剂适当辅料，按缓释控释剂工艺制成缓释控释剂。实施例12取异甘草素或新异甘草素10g，加入口服液适当辅料，按口服液工艺制备成口服液。实施例13取异甘草素或新异甘草素10g，加入脂质体剂型适当辅料，按脂质体工艺制备成纳米制剂。当前第1页12