一种卡巴他赛蛋白纳米材料及其制备方法与流程

本发明属于药物制剂
技术领域：
，尤其涉及一种卡巴他赛蛋白纳米材料及其制备方法。
背景技术：
：卡巴他赛属于紫衫烷类抗肿瘤药物，是由紫杉的针叶中提取的化合物半合成的紫杉醇衍生物，其作用机理与其他紫杉烷类药物类似，通过促进微管双聚体装配成微管，同时防止去多聚化过程而使微管稳定，抑制细胞进一步分裂，从而抑制癌细胞的有丝分裂和增值。目前已上市产品为卡巴他赛注射液，为增加卡巴他赛的溶解性及制剂稳定性，注射剂处方中加有大量聚山梨酯80、脱水乙醇等表面活性剂作为共溶剂，临床研究证实可导致严重超敏反应，甚至可能包括普遍性皮疹/红斑，低血压和支气管痉挛，给患者本人及家属都带来很大的痛苦；同时，给药剂量大、时间长，稀释后的注射液需在短时间内使用，否则将会产生沉淀，稳定性比较差，存在用药方面的安全隐患。由此可见，现有的卡巴他赛注射液毒副作用大、易致使严重超敏反应，并且，给药剂量大、时间长，以及稳定性比较差，存在用药方面的安全隐患的问题。技术实现要素：本发明实施例的目的在于提供一种卡巴他赛蛋白纳米材料，旨在解决现有的卡巴他赛注射液毒副作用大、易致使严重超敏反应，并且，给药剂量大、时间长，以及稳定性比较差，存在用药方面的安全隐患的问题。本发明实施例是这样实现的，一种卡巴他赛蛋白纳米材料，包括以下重量份数的原料：卡巴他赛50～150份；蛋白载体材料400～4000份；蛋白纳米修饰材料50～300份。本发明实施例的另一目的在于一种卡巴他赛蛋白纳米材料的制备方法，其特征在于，包括：按量称取卡巴他赛以及蛋白纳米修饰材料，溶于有机溶剂内，作为油相，备用；按量称取蛋白载体材料，溶于纯水中，并调节ph值为7～10，作为水相，备用；将所述油相与水相进行冰浴超声处理，形成初乳液，超声功率20％～60％，超声时间3～12min；将所述初乳液在室温下继续搅拌1～4h或者通过高压均质机在压力为500～800bar的条件下，循环6～10次；将处理后的乳液进行减压旋蒸处理，除去有机溶剂，在22000r/min(34700×g)，4℃条件下离心30min，去除上清液，沉淀加适量超纯水复溶即得。本发明实施例提供的一种卡巴他赛蛋白纳米材料，由卡巴他赛、蛋白载体材料以及蛋白纳米修饰材料组成，即通过将卡巴他赛包封于蛋白载体材料和蛋白纳米修饰材料组成的球形或椭球型纳米内或附着在纳米表面，所得卡巴他赛蛋白纳米材料粒径均一、包封率高，具有较好的缓释效果，同时具有较高的抗肿瘤效果，有效避免了表面活性剂等共溶剂的使用带来的超敏反应，减少制剂毒性，提高生物利用度，降低给药剂量，延长给药时间。附图说明图1为一种卡巴他赛蛋白纳米材料粒径分布图；图2为卡巴他赛蛋白纳米材料在ph值为7.4条件下的累积释药曲线图；图3为卡巴他赛蛋白纳米材料在不同浓度下的细胞存活率曲线图；图4为空白蛋白纳米在不同浓度下的细胞存活率曲线图；图5为bsa浓度(a)与胆固醇用量(b)响应面交互作用图；图6为bsa浓度(a)与油相的选择(c)响应面交互作用图；图7为胆固醇用量(b)与油相的选择(c)响应面交互作用图；图8为hsa浓度(a)、胆固醇用量(b)、ph值(c)、载药比(d)对包封率影响的效应曲面图；图9为另一种卡巴他赛蛋白纳米材料粒径分布图。具体实施方式为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。卡巴他赛是亲脂性药物，不溶于水可溶于乙醇。由于蛋白载体材料多个结合位点的存在，白蛋白可以与多个化合物结合，比如多柔比星，甲氨蝶呤，肠促胰岛素类似物(exendin-4)等，可增强疏水性分子在血液中的溶解度。作为化合物的转运蛋白，通过增强药物的渗透性，在细胞质中保留效果以及组织gp60介导的转胞吞作用将化合物递送到体内的特定组织并影响化合物分子在血液中的分布，实现靶向转运，让更多的药物聚集在肿瘤组织或进入到肿瘤细胞内。从而有效地将其内容物释放到细胞质中。将降低药物的刺激性和毒副反应，更好的发挥其抗肿瘤作用。因此，本发明着重于研究一种卡巴他赛蛋白纳米材料，由卡巴他赛、蛋白载体材料以及蛋白纳米修饰材料组成，即通过将卡巴他赛包封于蛋白载体材料和蛋白纳米修饰材料组成的球形或椭球型纳米内或附着在纳米表面，所得卡巴他赛蛋白纳米材料粒径均一、包封率高，具有较好的缓释效果以及较高的抗肿瘤效果，避免了表面活性剂等共溶剂的使用，减少制剂毒性，提高生物利用度，降低给药剂量，延长给药时间。在本发明实施例中，蛋白载体材料包括玉米醇溶蛋白、牛血清白蛋白、人血清白蛋白中的一种或几种。在本发明实施例中，蛋白纳米修饰材料包括大豆磷脂、氢化大豆磷脂、胆固醇、蛋黄卵磷脂、天然磷脂和磷脂酰乙醇胺中的一种或几种。在本发明实施例中，该卡巴他赛蛋白纳米材料的制备方法包括取重量份数为50～150份的卡巴他赛、50～300份的蛋白纳米修饰材料溶于有机溶剂内，作为油相备用；另取重量份数400～4000份的蛋白载体材料溶于纯水中，调节ph值为7～10，作为水相备用；将油相加入水相中进行冰浴超声形成初乳液，超声功率20％～60％，超声时间3～10min；初乳液转移通过高压均质机，压力500～800bar，循环6～10次，或者将初乳液在室温下继续搅拌1～4h；将最终获得的乳液进行35℃减压旋蒸去除有机溶剂，即得。在本发明实施例中，有机溶剂为三氯甲烷与无水乙醇混合液，且经本发明大量实验验证，随着油相中无水乙醇的增加，纳米粒粒径明显减小，综合考量其对药物包封率、载药量的影响，选择三氯甲烷与无水乙醇体积比11:1时药物包封率、载药量均最高，且粒径相对较小。在本发明实施例中，经大量实验验证，油水相比例对药物包封率、载药量影响相对较小，对纳米粒径有一定影响，油水相比例1:10时有最小粒径，包封率、载药量也较高，因此优选油水相比例1:10作为蛋白纳米粒的制备条件，同时可减少有机油相的使用。以下结合具体实施例对本发明做进一步详细说明(所有实施例中油水相体积比均为1:10，最终样品体积为100ml)。实施例1卡巴他赛蛋白纳米材料，包括以下原料：卡巴他赛50mg；胆固醇100mg；牛血清白蛋白0.5g(浓度为0.5％)。制备过程：将卡巴他赛与胆固醇溶解于有机溶剂(三氯甲烷：无水乙醇＝11:1，共10ml)中，作为油相备用；将牛血清白蛋白溶解于超纯水中，调节ph至8，作为水相备用(油水相比例1:10)；将所述油相加入水相中，进行40％功率下冰浴超声8min，形成初乳液；将所述初乳液通过高压均质机在压力为500bar的条件下，循环8次；将处理后的乳液进行35℃减压旋蒸处理，除去有机溶剂，在22000r/min(34700×g)，4℃条件下离心30min，去除上清液，沉淀加适量超纯水复溶即得。实施例2卡巴他赛蛋白纳米材料，包括以下原料：卡巴他赛100mg；胆固醇150mg；牛血清白蛋白1.5g(浓度为1.5％)。制备过程：将卡巴他赛与胆固醇溶解于有机溶剂(三氯甲烷：无水乙醇＝11:1，共10ml)中，作为油相备用；将牛血清白蛋白溶解于超纯水中，调节ph至10，作为水相备用；将所述油相加入水相中，进行30％功率下冰浴超声12min，形成初乳液；将所述初乳液通过高压均质机在压力为800bar的条件下，循环8次；将处理后的乳液进行35℃减压旋蒸处理，除去有机溶剂，在22000r/min(34700×g)，4℃条件下离心30min，去除上清液，沉淀加适量超纯水复溶即得。实施例3卡巴他赛蛋白纳米材料，包括以下原料：卡巴他赛150mg；胆固醇200mg；牛血清白蛋白1.5g(浓度为1.5％)。制备过程：将卡巴他赛与胆固醇溶解于有机溶剂(三氯甲烷：无水乙醇＝11:1，共10ml)中，作为油相备用；将牛血清白蛋白溶解于超纯水中，调节ph至8，作为水相备用；将所述油相加入水相中，进行40％功率下冰浴超声8min，形成初乳液；将所述初乳液通过高压均质机在压力为500bar的条件下，循环8次；将处理后的乳液进行35℃减压旋蒸处理，除去有机溶剂，在22000r/min(34700×g)，4℃条件下离心30min，去除上清液，沉淀加适量超纯水复溶即得。实施例4卡巴他赛蛋白纳米材料，包括以下原料：卡巴他赛150mg；胆固醇300mg；牛血清白蛋白2.5g(浓度为2.5％)。制备过程：将卡巴他赛与胆固醇溶解于有机溶剂(三氯甲烷：无水乙醇＝11:1，共10ml)中，作为油相备用；将牛血清白蛋白溶解于超纯水中，调节ph至7，作为水相备用；将所述油相加入水相中，进行40％功率下冰浴超声5min，形成初乳液；将所述初乳液通过高压均质机在压力为500bar的条件下，循环8次；将处理后的乳液进行35℃减压旋蒸处理，除去有机溶剂，在22000r/min(34700×g)，4℃条件下离心30min，去除上清液，沉淀加适量超纯水复溶即得。实施例5卡巴他赛蛋白纳米材料，包括以下原料：卡巴他赛100mg；胆固醇100mg；人血清白蛋白2.0g(浓度为2％)。制备过程：将卡巴他赛与胆固醇溶解于有机溶剂(三氯甲烷：无水乙醇＝11:1，共10ml)中，作为油相备用；将人血清白蛋白溶解于超纯水中，调节ph至8，作为水相备用；将所述油相加入水相中，进行40％功率下冰浴超声3min，形成初乳液；将所述初乳液在室温下继续搅拌2h；将处理后的乳液进行35℃减压旋蒸处理，除去有机溶剂，在22000r/min(34700×g)，4℃条件下离心30min，去除上清液，沉淀加适量超纯水复溶即得。实施例6卡巴他赛蛋白纳米材料，包括以下原料：卡巴他赛150mg；胆固醇50mg；人血清白蛋白2.0g(浓度为2％)。制备过程：将卡巴他赛与胆固醇溶解于有机溶剂(三氯甲烷：无水乙醇＝11:1，共10ml)中，作为油相备用；将人血清白蛋白溶解于超纯水中，调节ph至9，作为水相备用；将所述油相加入水相中，进行30％功率下冰浴超声3min，形成初乳液；将所述初乳液在室温下继续搅拌3h；将处理后的乳液进行35℃减压旋蒸处理，除去有机溶剂，在22000r/min(34700×g)，4℃条件下离心30min，去除上清液，沉淀加适量超纯水复溶即得。实施例7卡巴他赛蛋白纳米材料，包括以下原料：卡巴他赛150mg；胆固醇100mg；人血清白蛋白4.0g(浓度为4％)。制备过程：将卡巴他赛与胆固醇溶解于有机溶剂(三氯甲烷：无水乙醇＝11:1，共10ml)中，作为油相备用；将人血清白蛋白溶解于超纯水中，调节ph至8，作为水相备用；将所述油相加入水相中，进行40％功率下冰浴超声5min，形成初乳液；将所述初乳液在室温下继续搅拌4h；将处理后的乳液进行35℃减压旋蒸处理，除去有机溶剂，在22000r/min(34700×g)，4℃条件下离心30min，去除上清液，沉淀加适量超纯水复溶即得。实施例8卡巴他赛蛋白纳米材料，包括以下原料：卡巴他赛100mg；胆固醇100mg；人血清白蛋白2.0g(浓度为2％)。制备过程：将卡巴他赛与胆固醇溶解于有机溶剂(三氯甲烷：无水乙醇＝11:1，共10ml)中，作为油相备用；将人血清白蛋白溶解于超纯水中，调节ph至8，作为水相备用；将所述油相加入水相中，进行60％功率下冰浴超声8min，形成初乳液；将所述初乳液在室温下继续搅拌2h；将处理后的乳液进行35℃减压旋蒸处理，除去有机溶剂，在22000r/min(34700×g)，4℃条件下离心30min，去除上清液，沉淀加适量超纯水复溶即得。实施例9卡巴他赛蛋白纳米材料，包括以下原料：卡巴他赛50mg；蛋黄卵磷脂100mg；牛血清白蛋白0.4g(浓度为0.4％)。制备过程：将卡巴他赛与蛋黄卵磷脂溶解于有机溶剂(三氯甲烷：无水乙醇＝11:1，共10ml)中，作为油相备用；将牛血清白蛋白溶解于超纯水中，调节ph至8，作为水相备用；将所述油相加入水相中，进行40％功率下冰浴超声8min，形成初乳液；将所述初乳液通过高压均质机在压力为500bar的条件下，循环8次；将处理后的乳液进行35℃减压旋蒸处理，除去有机溶剂，在22000r/min(34700×g)，4℃条件下离心30min，去除上清液，沉淀加适量超纯水复溶即得。实施例10卡巴他赛蛋白纳米材料，包括以下原料：卡巴他赛50mg；大豆磷脂100mg；牛血清白蛋白0.45g(浓度为0.45％)。制备过程：将卡巴他赛与大豆磷脂溶解于有机溶剂(三氯甲烷：无水乙醇＝11:1，共10ml)中，作为油相备用；将牛血清白蛋白溶解于超纯水中，调节ph至8，作为水相备用；将所述油相加入水相中，进行40％功率下冰浴超声8min，形成初乳液；将所述初乳液通过高压均质机在压力为500bar的条件下，循环8次；将处理后的乳液进行35℃减压旋蒸处理，除去有机溶剂，在22000r/min(34700×g)，4℃条件下离心30min，去除上清液，沉淀加适量超纯水复溶即得。将实施例1-10所制得的卡巴他赛蛋白纳米材料进行粒径、包封率指标考察，所得结果如表1所示：表1综上，由表1可知，本发明实施例1-8均成功制得卡巴他赛蛋白纳米材料。其中，实施例4所得卡巴他赛蛋白纳米材料的包封率最小是因为蛋白溶液ph为7，接近白蛋白等电点，不利于纳米粒的形成；而实施例1-4的载体材料为牛血清白蛋白，实施例5-8的载体材料为人血清白蛋白，可以推测人血清白蛋白对卡巴他赛的载药能力优于牛血清白蛋白；另外，实施例1-4粒径随主药用量、胆固醇用量及载体材料的增加而增大，说明超声功率、超声时间及均质压力对粒径有一定影响，但影响较小。同时，载药比、白蛋白浓度、胆固醇对包封率有较大影响，载药比增大到一定比例后，包封率明显降低。另外，在蛋白纳米修饰材料试验过程中分别对胆固醇、蛋黄卵磷脂、大豆磷脂进行筛选，结果显示蛋黄卵磷脂和大豆磷脂作为修饰材料效果不好，乳液颜色变黄，24h已析出沉淀。因此以下所有实施例为进一步研究卡巴他赛蛋白纳米材料的优选制备参数，均选用胆固醇作为蛋白纳米修饰材料。实施例11将上述实施例2、3、5、8制得的卡巴他赛蛋白纳米材料分别加入冻干保护剂(冻干保护剂辛酸钠的用量：每1g白蛋白加入8mg辛酸钠)，振摇混匀，分装(2ml)，冷冻干燥，即得卡巴他赛蛋白纳米注射剂(注射用卡巴他赛蛋白纳米冻干粉)；所测得包封率指标变化如表2所示：表2卡巴他赛白蛋白胆固醇冻干保护剂包封率实施例2100mg1.5g150mg12mg辛酸钠74.60％实施例3150mg1.5g200mg12mg辛酸钠76.15％实施例5100mg2.0g100mg16mg辛酸钠77.50％实施例8100mg2.0g100mg16mg辛酸钠89.92％实施例12将上述实施例11制得的卡巴他赛蛋白纳米注射剂进行冻干卡巴他赛蛋白纳米初步质量评价，其粒径分布如图1所示，zeta电位在-10mv～-40mv之间，4℃下放置30天，外观为白色疏松块状，具体结果如下表3所示。表3再分散性平均粒径zeta电位包封率实施例2良188nm-24.4mv73.51％实施例3优203nm-26.9mv76.38％实施例5优237nm-14.1mv77.62％实施例8优237nm-13.4mv87.33％综上，从表2-3中可看出，通过冻干能够增加制剂的稳定性，但冻干过程的预冻期、真空期等过程会使蛋白纳米的性能有所损失，因此，包封率略有下降。具体而言，4℃下放置30天，蛋白纳米在5ml超纯水中再分散性良好，30天内包封率无明显变化，粒径有所增大，但仍小于220nm。冻干卡巴他赛蛋白纳米在4℃条件下，30天储存期内外观、再分散性、粒径、包封率稳定性良好。实施例13将上述实施例3制得卡巴他赛蛋白纳米材料在不同ph条件下进行体外释放测试。配制ph为7.4的磷酸盐缓冲液100ml(含5％乙醇)作为释放介质，然后取一定量卡巴他赛蛋白纳米材料于截留分子量为2000的透析袋中，将其置于上述ph7.4磷酸盐缓冲液释放介质中，采用恒温振荡法，分别于0.5h、1h、4h、6h、8h、12h、24h、48h取样2ml，补液2ml，计算累积释放度，绘制释放曲线如图2所示。表明游离卡巴他赛与载药蛋白纳米在ph7.4磷酸盐缓冲液释放介质中释放规律的不同。实施例14将上述实施例3制得卡巴他赛蛋白纳米材料进行细胞毒性实验测试。取对数生长期的鼠源乳腺癌4t1细胞，按照每孔2000个细胞对消化后的细胞悬液进行稀释。在96孔板接种细胞悬液，每孔100ul，至于细胞培养箱内培养24小时。配置药物浓度为100ug/ml的卡巴他赛蛋白纳米溶液，采用十倍稀释法使得载药蛋白纳米组的药物浓度分别为100ug/ml、10ug/ml、1ug/ml、0.1ug/ml、0.01ug/ml，对照组为相对应的游离卡巴他赛浓度的溶液，空白组为空白蛋白纳米(为不加主药的蛋白纳米，其余组成与载药蛋白纳米相同，选用牛血清白蛋白么)，配制浓度为1000ug/ml的空白蛋白纳米溶液，采用十倍稀释法使得空白蛋白纳米组的药物浓度分别为1000ug/ml、100ug/ml、10ug/ml、1ug/ml、0.1ug/ml。每孔加入100ul，每个浓度平行3孔，在细胞培养箱内培养24h、48h、72h。培养结束后每孔加入10ulcck-8(cellcountingkit-8)溶液，在细胞培养箱内培养2h，用酶标仪测定在450nm处的吸收值，计算其细胞存活率，其细胞存活率趋势如图3-4所示。结果表明在一定浓度范围内，空白蛋白纳米无毒性，而卡巴他赛蛋白纳米材料(kbts-bsanps)的抗鼠源乳腺癌细胞的效果明显。综上，本发明实施例提供的一种卡巴他赛蛋白纳米材料，通过将卡巴他赛包封于蛋白载体材料和蛋白纳米修饰材料组成的球形或椭球型纳米内或附着在纳米表面，所得卡巴他赛蛋白纳米材料粒径均一、包封率高，具有较好的缓释效果，同时具有较高的抗肿瘤效果，有效避免了表面活性剂等共溶剂的使用带来的超敏反应，减少制剂毒性，提高生物利用度，降低给药剂量，延长给药时间。本发明实施例提供的卡巴他赛蛋白纳米注射剂，包括上述卡巴他赛蛋白纳米材料，还可能包括冻干保护剂，即卡巴他赛蛋白纳米注射剂有可能是蛋白纳米混悬液，也有可能是蛋白纳米混悬液通过加入冻干保护剂后制成的蛋白纳米冻干粉。该冻干保护剂不应该只是上述提及的辛酸钠，还可以是牛血清白蛋白、甘露醇、海藻糖、乳糖、乙酰色氨酸钠中的一种或几种。进一步，本发明在预实验中发现白蛋白浓度不同，对药物包封率及纳米形态有较大影响，浓度过高，纳米颗粒容易聚集，粒径增大。为确定最佳白蛋白浓度，设计实验方案如下：本实验固定主药(卡巴他赛)与白蛋白(牛血清白蛋白)比例(1:20)，白蛋白溶液ph为7.0，油水相比例为1:20，胆固醇用量150mg，探头超声(30％)10min，高压均质条件不变，平行制备三批样品，以包封率(ee％)、载药量(dl％)为主要考察指标，测定结果如表4所示。表4白蛋白(bsa)溶液浓度的选择综上，由表4结果可知，在bsa溶液浓度为1.5％时，包封率较理想。因此优选1.5％bsa浓度来制备卡巴他赛蛋白纳米。进一步，本发明在预实验中发现白蛋白等电点为4.4左右，白蛋白溶液ph越接近等电点，白蛋白易聚集成团不易形成蛋白纳米。为确定最佳白蛋白溶液ph值，设计实验方案如下：固定bsa浓度为1.5％，其他条件不变，用0.2mol/l的柠檬酸溶液和0.2mol/l的氢氧化钠溶液，调节bsa溶液的ph分别为6.0、7.0、8.0、9.0、10.0，其他制备条件同上，在各ph条件下制备三批样品，以包封率、载药量为主要考察指标，选择最优ph值，测定结果见表5。表5bsa溶液ph的选择综上，由表5结果可知，ph值为7～10时成功制得卡巴他赛蛋白纳米材料，ph为6.0时，bsa凝聚成团，且ph越大，纳米粒粒径有减小趋势，而ph＞8.0时，包封率、载药量明显降低，因此，优选ph＝8.0的bsa溶液制备卡巴他赛蛋白纳米材料。进一步，本发明为确定最佳投药量与白蛋白之比(载药比)，设计以下实验方案：固定水相溶液ph为8.0，白蛋白溶液浓度为1.5％，其他制备条件同上，按kbts(卡巴他赛)与bsa比例为1:20、1:13.3、1:10、1:8、1:6.67进行投药，平行制备三批样品，以包封率、载药量粒径、电位为考察指标，测定结果见表6。表6载药比的选择综上，从表6可知，随着载药比的增加，纳米粒粒径有明显增加，综合考量其对包封率、载药量、粒径的影响，虽然1:20的载药比对应的包封率最高，但是包封率并不是考察的唯一因素，而1:10的载药比将载药量从4.07％提高到6.14％，因此，优选1:10的载药比，获得的蛋白纳米对kbts具有较高包封率和载药量，可避免药物的浪费。在预实验中发现胆固醇的加入有助于kbts与白蛋白结合稳定，对药物包封率有明显提高。因此，本发明进一步考察胆固醇用量对卡巴他赛蛋白纳米材料包封率和载药量的影响，即固定其他制备条件，载药比为1:10，改变胆固醇用量分别为100mg，150mg，200mg，250mg，300mg，各变量下分别制备三批样品，测定结果见表7。表7胆固醇用量的选择由表7结果可知，胆固醇用量对卡巴他赛蛋白纳米材料的包封率有较大影响，当胆固醇用量增加到200mg时有最大包封率，继续增加胆固醇用量，包封率无增加，纳米粒粒径有略微增大，因此优选胆固醇用量为200mg(0.2％)。进一步，本发明为确定最佳有机油相的使用，涉及以下实验方案：有机油相分别为三氯甲烷、三氯甲烷-无水乙醇体积比9:1、三氯甲烷-无水乙醇体积比11:1、三氯甲烷-无水乙醇体积比13:1，固定各有机油相与水相体积比为1:20，各制备三批样品，测定结果见表8。表8有机油相的选择从表8实验结果显示，当选用三氯甲烷作为油相时，制备的蛋白纳米粒粒径最大。随着油相中无水乙醇的增加，纳米粒粒径明显减小，综合考量其对药物包封率、载药量的影响，选择三氯甲烷-无水乙醇体积比11:1时药物包封率、载药量均最高，且粒径相对较小。前期实验结果显示，油水相比例(有机溶剂与纯水的比例)对药物包封率影响相对较小，对纳米粒粒径有较大影响。进一步确定最佳油水相比例，即固定载药比1:10,其他制备条件不变，改变油水相比例，各比例条件下制备三批样品，以纳米粒粒径作为主要考察指标，测定结果见表9。表9油水相比例的选择表9结果显示，油水相比例对药物包封率、载药量影响相对较小，对纳米粒径有一定影响，油水相比例1:10时有最小粒径，包封率、载药量也较高，因此选择油水相比例1:10作为蛋白纳米粒的制备条件，同时可减少有机油相的使用。本发明预实验结果显示超声功率对纳米粒粒径有一定影响，对包封率、载药量影响不明显。为确定最佳超声功率，本发明设计以下实验方案：固定其他条件不变，设置超声功率(总功率650w)分别为20％、30％、40％、50％、60％，各功率条件下分别制备三批样品，以粒径、zeta电位为主要考察指标，测定结果见表10。表10超声功率的选择由表10结果可知，随着超声功率的增加，纳米粒粒径有减小趋势，当功率超过40％，粒径减小不明显，而功率越大，动能对蛋白纳米的做功，有可能导致纳米粒聚集，样品被重金属污染的可能性也更大。因此优选超声功率为设备总功率的40％，即260w。进一步，前期预实验考察得出，超声时间长短对纳米粒粒径有一定影响，对包封率、载药量的影响不明显。因此选择40％的超声功率，固定其他制备条件不变，设置超声时间分别为3min、5min、8min、10min、12min，各条件下分别制备三批样品，以粒径作为主要考察指标，测定结果见表11。表11超声时间的选择由表11可知，随着超声时间的增加，粒径呈下降趋势，在超声超过8min时，蛋白纳米粒径减小趋势不明显，因此选择超声时间为8min，制备蛋白纳米初乳。由以上单因素考察结果可知，结合牛血清白蛋白对kbts的包封率、载药量，以及蛋白纳米的粒径、zeta电位等方面综合考量，确定卡巴他赛蛋白纳米材料组成为：白蛋白浓度1.5％，白蛋白溶液ph为8.0，载药比为1:10，胆固醇用量200mg(0.2％，质量与体积比w/v，处方用量均是制成100ml制剂)，三氯甲烷和无水乙醇体积比11:1，油水相比例1:10，该组成在超声功率40％，超声时间8min时，500bar下均质8个循环，制备的蛋白纳米包封率好，载药量高，粒径相对较小。进一步，为更进一步优化卡巴他赛蛋白纳米材料组成，根据单因素试验结果，bsa浓度(a)、胆固醇用量(b)以及油相的选择(c)是影响包封率(ee％)的主要因素；以其不同用量进行3因素3水平响应面设计实验优化。应用design-export软件中的box-behnkendesign，简称bbd，也是响应面优化法常用的实验设计方法，每个因素的低、中、高实验水平分别编码为-1、0、1。本实验选取包封率(ee％)作为响应值，保持各处方中主药kbts的量为150mg，蛋白溶液ph值为8.0，油相为三氯甲烷与无水乙醇的混合溶剂，油水相比例为1:10，超声功率40％，超声时间为8min，均质压力500bar，进行8个循环。利用design-expert8.0.6软件建立3因素3水平拟合模型，实验中因素和水平如表12。表12拟合模型设计因素及编码用design-expert8.0.6进行实验设计，共17组处方组成，制备卡巴他赛蛋白纳米材料并测定各处方所得卡巴他赛蛋白纳米材料的包封率(见表13)以及响应面优化方差分析结果(见表14)。表13设计实验结果表14响应面优化方差分析“***”表示p<0.0001，“*”表示p<0.05，“*”表示p>0.05。通过软件对表数据进行分析，发现二次多项式为最优模型，拟合方程为ee％＝85.45+3.51a+3.58b+3.57c+2.27ab+2.44ac+2.81bc-9.52a2-9.28b2-10.53c2(r2＝0.9865；p＝0.0001，有意义；失拟项：p＝0.9305，无意义)。拟合方程模型有显著差异(p<0.05)，失拟项无显著差异(p>0.05)，表明98.65％的实验结果可用该拟合模型解释，具有统计学意义。回归方程得到的bsa浓度(a)与胆固醇用量(b)的交互作用、bsa浓度(a)与油相的选择(c)的交互作用以及胆固醇用量(b)与油相的选择(c)的交互作用对药物包封率(ee％)的影响见图5-图7。根据design-expert8.0.6方差分析结果，回归模型预测最优处方为bsa浓度1.58％，胆固醇用量195mg，油相应是三氯甲烷:无水乙醇＝11.3:1(v/v)，模型预测包封率84.60％。本发明进一步以人血清白蛋白(hsa)作为研究对象，同样进行了以下研究：由于在预实验中，白蛋白浓度不同，对药物包封率及纳米形态有较大影响，浓度过高，纳米颗粒容易聚集，粒径增大。本实验固定主药与hsa比例(1:20)，胆固醇的用量为10mg，hsa溶液ph为7.0，有机溶剂为三氯甲烷与无水乙醇的混合溶液(11:1)，其他条件保持不变，以包封率、粒径这两个因素作为主要的考察指标，测定结果如表15。表15hsa溶液浓度的选择由表15可知，随着人血清白蛋白溶液浓度的增加，粒径逐渐增大，浓度为2％时包封率最大，综合考虑，选择2％hsa溶液来制备kbts-hsa-nps。白蛋白等电点为4.4左右，白蛋白溶液ph越接近等电点，白蛋白易聚集成团不易形成蛋白纳米。将hsa溶液浓度固定为2％，保持其余条件不变，用0.2mol/l的柠檬酸溶液和0.2mol/l的氢氧化钠溶液，分别调节hsa溶液的ph值至5.0、6.0、7.0、8.0、9.0这五个值，其他制备条件同上，用超声乳化法制备kbts-hsa-nps，将包封率、粒径大小两个因素作为主要考察指标，确定ph的最优值，测定结果见表16。从表16可以看到，随着ph值的增大，白蛋白纳米粒的粒径随之减小，ph值为7时白蛋白纳米颗粒的包封率相对较大，综合考虑，选择ph值为7的hsa溶液来制备kbts-hsa-nps。表16hsa溶液ph的选择固定hsa溶液的ph为7.0，浓度为2％，其他制备条件同上，按kbts与hsa用量比例为1:8、1:10、1:13.3、1:20进行投药，同时仍然以包封率、粒径两个因素作为考察指标，结果详列于表17。表17载药比的选择由表17结果可以看到，白蛋白纳米粒的粒径随着载药比的增加而增加但幅度较小，载药比在1:10时纳米粒的包封率最大。综合考虑，载药比为1:10，制备得到的人血清白蛋白纳米颗粒对kbts具有较高的包封率，可避免药物的浪费。预实验中，胆固醇的加入有助于卡巴他赛与白蛋白结合稳定。考察胆固醇用量对kbts-hsa-nps包封率的影响，固定hsa溶液的浓度为2％，ph为7，载药比为1:10，其他条件不变，改变胆固醇用量分别为0mg、10mg、20mg、30mg，仍然以包封率、粒径两个因素作为考察指标，测定结果见表18。由表18可知，胆固醇用量的与kbts-hsa-nps的粒径呈反比，当胆固醇用量为10mg时，白蛋白纳米颗粒的包封率较大，胆固醇用量为0mg时，包封率较小，用量为20mg、30mg时，蛋白纳米粒的包封率差别不大，因此，最终选择10mg胆固醇用以制备白蛋白纳米粒。表18胆固醇用量的选择在处方筛选方面，通过单因素考察，选取对白蛋白纳米粒性质影响显著的四个条件：hsa浓度(a)、胆固醇用量(b)、hsa的ph值(c)、载药比(d)为考察因素，以包封率(ee％)作为评价指标，采用四因素三水平的box-behnken设计实验优化kbts-hsa-nps处方。design-export软件中的box-behnkendesign，简称bbd，是响应面优化法常用的实验设计方法，每个因素的低、中、高实验水平分别编码为-1、0、1。结果见表19，表20中则详细描述了处方优化试验设计，表21列出了方差分析的结果。表19拟合模型设计因素及编码用design-expert8.0.6进行实验设计，共29组处方组成，制备kbts-hsa-nps并测定各处方所得的包封率，结果见表20。表20优化处方的实验设计表与结果表21响应面优化的方差分析注：*≤0.0001，表明结果高度显著；*<0.05，表明结果较为显著。对处方优化试验所得数据进行处理，以包封率为评价指标对各因素进行多元线性回归和二项式方程拟合，发现二次多项式为最优模型。方程为ee％＝90.10+2.48a+1.89b+2.04c-1.51d+2.03ab-3.31ac-3.15ad-2.26bc+0.37bd+1.53cd-7.22a2-7.57b2-4.91c2-8.19d2(r2＝0.9771；p＝0.0001；失拟项：p＝0.1785>0.05)。方差分析显示，p值为0.0001，远远小于0.05,表明此模型可靠度较高；方程的r2值为0.9771，说明有97.71％的数据可用该模型解释；失拟值为0.1785，大于0.05，失拟值不显著也表明了模型良好的可预测性，具有统计学意义。综上，我们的回归方程对实验数据的拟合度较高，可用此模型确定kbts-hsa-nps的最优处方。为了更直观的观察4个因素:hsa浓度(a)、胆固醇用量(b)、hsa的ph(c)、载药比(d)的相互影响作用，绘制响应面曲线图来更形象说明，如图8所示。响应面通过固定四个因素中任意两个因素，纵坐标表示响应值的大小，位于水平面上的两相互垂直的横坐标表示另外两个因素，三个坐标轴共同构成响应面的三维模型。由图8显示，包封率(％)随hsa浓度与胆固醇用量增加而增加，达到一个峰值后又降低。图8针对kbts-hsa-nps处方的四个因素，包封率都有相似的变化趋势。从图8给出的三维响应曲线图可以看出，当a、b、c、d四个因素的取值处于中间范围时，响应面曲线在y轴方向出现峰值，表明此时a、b、c、d四个因素对包封率的影响较为显著。该软件同时也给出了处方最优选择：hsa溶液浓度为2.2％，胆固醇用量为21.4mg，ph值为7.1，载药比为1:10.4。在该条件下，回归模型预测值为包封率90.65％。为了对响应面模型预测的准确性进行实验验证，在该条件下进行kbts-hsa-nps的制备，测得hsa纳米颗粒的包封率为88.70％，可能是在制备过程中白蛋白易起泡，会导致一定的误差。所以得到的实际值与理论值有一点的差异，但是采用最优条件制备的kbts-hsa-nps包封率仍然高于单因素筛选条件下的包封率，因此该最优条件可行可靠。粒径为153.2nm,pdi为0.178，结果表明纳米颗粒分布良好，粒径分布可见图9。在该最佳条件下，连续制备3批kbts-hsa-nps进行包封率和粒径测定，结果如表22所示，人血清白蛋白对卡巴他赛药物的包封率为88.70％，粒径为148.9nm。表22kbts-hsa-nps测定结果以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。当前第1页12