雷复尼特在制备抗肿瘤药物中的应用的制作方法

本发明属于医药用途领域，具体涉及雷复尼特(rafoxanide)在制备不以b-raf^v600e为靶标的抗肿瘤药物中的应用。

背景技术：

b-raf是人类最重要的原癌基因之一，大约8％的人类肿瘤发生b-raf突变。b-raf绝大部分突变形式为b-raf^v600e突变，主要发生于黑色素瘤、结肠癌和甲状腺癌中。该突变导致下游mek-erk信号通路持续激活，对肿瘤的生长增殖和侵袭转移至关重要，是抗黑色素瘤等v600e突变肿瘤的有效作用靶标之一。2011年，首个b-raf^v600e靶向抑制剂维罗非尼(vemurafenib)被fda批准上市，用于治疗b-raf^v600e突变的晚期黑色素瘤患者，有效延长了患者无进展生存期及总生存期，取得了突破性的治疗效果，也是典型的基于基因诊断选择用药的靶向治疗药物。

文献表明，维罗菲尼对b-raf^v600e的ht29结肠癌裸鼠移植模型有效，但对b-raf^wt的hct116结肠癌裸鼠移植模型无效(yang,h.；higgins,b.；kolinsky,k.；packman,k.；bradley,w.d.；lee,r.j.；schostack,k.；simcox,m.e.；kopetz,s.；heimbrook,d.；lestini,b.；bollag,g.；su,f.,antitumoractivityofbrafinhibitorvemurafenibinpreclinicalmodelsofbraf-mutantcolorectalcancer.cancerres.2012,72,779-789图3)。

雷复尼特(rafoxanide)的结构式如下所示：

该化合物的分子式为c19h11cl2i2no3，白色粉末状，分子量为626.01，cas编号为22662-39-1。该化合物的通用名为雷复尼特，目前主要用于牛和绵羊的肝片吸虫的治疗。专利(cn201610124976)指出雷复尼特可以作为b-raf^v600e的抑制剂，因此可以用于制备以b-raf^v600e为靶标的药物，即用于制备预防和/或治疗黑色素瘤、结直肠肿瘤以及甲状腺癌的药物。

本申请的发明人发现有些b-raf^v600e的抑制剂对骨髓瘤无效。譬如化合物1a，针对b-raf^v600e的ic50为0.50μm，针对b-raf^v600e的ic50为1.50μm，针对黑色素瘤a375细胞的ic50为0.80μm(wang,g.-m.；wang,x.；zhu,j.-m.；guo,b.-b.；yang,z.；xu,z.-j.；li,b.；wang,h.-y.；meng,l.-h.；zhu,w.-l.；ding,j.,docking-basedstructuralsplicingandreassemblystrategytodevelopnoveldeazapurinederivativesaspotentb-rafv600einhibitors.actapharmacol.sin.2017,38,1059-1068)，而在人骨髓瘤细胞h929中80μm仍没有任何抑制效应。化合物1m，针对b-raf^v600e的ic50为0.05μm，针对b-raf^v600e的ic50为0.44μm，针对黑色素瘤a375细胞的ic50为0.80μm(wang,g.-m.；wang,x.；zhu,j.-m.；guo,b.-b.；yang,z.；xu,z.-j.；li,b.；wang,h.-y.；meng,l.-h.；zhu,w.-l.；ding,j.,docking-basedstructuralsplicingandreassemblystrategytodevelopnoveldeazapurinederivativesaspotentb-rafv600einhibitors.actapharmacol.sin.2017,38,1059-1068)，而在人骨髓瘤细胞h929中80μm仍没有任何抑制效应。

化合物1a的结构为：

化合物1m的结构为：

大多数的肿瘤是没有b-raf^v600e突变的。因此，雷复尼特在不以b-raf^v600e为靶标的肿瘤治疗中是否有效，值得探索。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供雷复尼特的新用途，即雷复尼特在制备不以b-raf^v600e为靶标的抗肿瘤药物中的应用。

本发明一方面提供了雷复尼特在制备不以b-raf^v600e为靶标的药物中的应用。

特别地，本发明提供了雷复尼特在用于制备预防和/或治疗不以b-raf^v600e为靶标的肿瘤药物的应用，或者，本发明提供了雷复尼特在用于制备预防和/或治疗没有b-raf^v600e突变的肿瘤药物的应用。

更为具体的，所述肿瘤为骨髓瘤、淋巴瘤、肝癌、乳腺癌、肺癌、前列腺癌以及b-raf^v600e抑制剂无效的结直肠癌等。

在本发明中，特别地，雷夫尼特作为p38mapk抑制剂。

本申请发明人经实验研究发现，雷复尼特能显著抑制没有b-raf^v600e突变的肿瘤细胞，特别是骨髓瘤细胞的生长，在骨髓瘤裸鼠移植瘤上可显著抑制肿瘤的生长，可发展为骨髓瘤的预防和/或治疗药物。

本发明的有益效果主要体现在：

(1)本发明人对已知药物雷复尼特发掘了新的医疗用途，开拓了新的应用领域。

(2)本发明人发现雷复尼特在不以b-raf^v600e为靶标的肿瘤中有效。

(3)本发明人发现雷复尼特可以抑制p38mapk通路。

(4)本发明人发现雷复尼特在动物水平可以显著抑制肿瘤的生长。

附图说明

图1为三种化合物(雷复尼特、化合物1a、化合物1m)对人骨髓瘤细胞h929的抑制曲线。

图2为雷复尼特对人骨髓瘤细胞arp-1的抑制曲线。

图3为雷复尼特对人骨髓瘤细胞oci-my5的抑制曲线。

图4为雷复尼特对p38mapk的抑制作用实验。

图5为雷复尼特对人骨髓瘤细胞h929裸鼠移植瘤的抑制实验中显示肿瘤体积的照片。

图6为雷复尼特对人骨髓瘤细胞h929裸鼠移植瘤的抑制实验中肿瘤体积曲线。

图7为雷复尼特对人骨髓瘤细胞h929裸鼠移植瘤的抑制实验中小鼠体重曲线。

图8为雷复尼特对人淋巴瘤细胞oci-ly8的抑制曲线。

图9为雷复尼特对人淋巴瘤细胞nudul-1的抑制曲线。

图10为雷复尼特对7721肝癌细胞的抑制曲线。

图11为雷复尼特对mdamb231乳腺癌细胞的抑制曲线。

图12为雷复尼特对a549肺癌细胞的抑制曲线。

图13为雷复尼特对du145前列腺癌细胞的抑制曲线。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此。

实施例1：针对人骨髓瘤细胞h929的杀伤活性

1.实验材料

(1)细胞株：人多发性骨髓瘤细胞(h929细胞)(美国atcc，本实验室传代保存)，培养于1640培养基(含10％胎牛血清)。

(2)主要试剂：1640培养基(美国gibco公司)，胎牛血清(美国gibco公司)，雷复尼特(百灵威科技有限公司)，化合物1a、1m(参照wang,g.-m.；wang,x.；zhu,j.-m.；guo,b.-b.；yang,z.；xu,z.-j.；li,b.；wang,h.-y.；meng,l.-h.；zhu,w.-l.；ding,j.,docking-basedstructuralsplicingandreassemblystrategytodevelopnoveldeazapurinederivativesaspotentb-rafv600einhibitors.actapharmacol.sin.2017,38,1059-1068文献方法自主合成)。

(3)主要仪器：二氧化碳培养箱(美国thermoforma公司)，全自动酶标仪(bio-tek，elx800)。

2.实验方法

(1)细胞培养

细胞培养于1640培养基(含10％胎牛血清，ph7.2)，置于细胞培养箱中在37℃、5％co2环境下培养。

(2)cck8试剂盒测定各药物的细胞毒性

取人多发性骨髓瘤细胞(h929细胞)的单细胞悬液，计数后调整细胞浓度至2×10⁵个/ml。取96孔培养板每孔加入95μl上述细胞悬液，然后加不同浓度的用培养基配制的药物(雷复尼特、化合物1a、化合物1m)5μl，对照组加入相应体积的培养基，每组设置3个平行孔。连续培养48h，培养结束前2h，每孔加入cck8试剂10μl，于co2孵箱中继续培养。2h后自动酶标仪检测450nm各孔od值。计算细胞存活率与抑制率：细胞存活率(％)＝(实验孔od均值/对照孔od均值)×100％。细胞抑制率(％)＝100％-细胞存活率(％)。拟合函数求出抑制细胞生长达50％时药物浓度ic50。实验重复三次。

3.实验结果

实验结果见图1。

结论：雷复尼特对人多发性骨髓瘤细胞h929具有杀伤活性，其ic50为10.2μm，而化合物1a和1m对h929细胞没有杀伤活性。

实施例2：雷复尼特针对人骨髓瘤细胞arp-1的杀伤活性

1.实验材料

(1)细胞株：人多发性骨髓瘤细胞(arp-1细胞)(美国atcc，本实验室传代保存)，培养于1640培养基(含10％胎牛血清)。

(2)主要试剂：1640培养基(美国gibco公司)，胎牛血清(美国gibco公司)，雷复尼特(百灵威科技有限公司)。

(3)主要仪器：二氧化碳培养箱(美国thermoforma公司)，全自动酶标仪(bio-tek，elx800)。

2.实验方法

(1)细胞培养

细胞培养于1640培养基(含10％胎牛血清，ph7.2)，置于细胞培养箱中在37℃、5％co2环境下培养。

(2)cck8试剂盒测定各药物的细胞毒性

取人多发性骨髓瘤细胞(arp-1细胞)的单细胞悬液，计数后调整细胞浓度至2×10⁵个/ml。取96孔培养板每孔加入95μl上述细胞悬液，然后加不同浓度的用培养基配制的雷复尼特5μl，对照组加入相应体积的培养基，每组设置3个平行孔。连续培养48h，培养结束前2h，每孔加入cck8试剂10μl，于co2孵箱中继续培养。2h后自动酶标仪检测450nm各孔od值。计算细胞存活率与抑制率：细胞存活率(％)＝(实验孔od均值/对照孔od均值)×100％。细胞抑制率(％)＝100％-细胞存活率(％)。拟合函数求出抑制细胞生长达50％时药物浓度ic50。实验重复三次。

3.实验结果

实验结果见图2。

结论：雷复尼特对人多发性骨髓瘤细胞arp-1具有杀伤活性，其ic50为19.3μm。

实施例3：雷复尼特针对人骨髓瘤细胞oci-my5的杀伤活性

1.实验材料

(1)细胞株：人多发性骨髓瘤细胞(oci-my5细胞)(美国atcc，本实验室传代保存)，培养于1640培养基(含10％胎牛血清)。

(2)主要试剂：1640培养基(美国gibco公司)，胎牛血清(美国gibco公司)，雷复尼特(百灵威科技有限公司)。

(3)主要仪器：二氧化碳培养箱(美国thermoforma公司)，全自动酶标仪(bio-tek，elx800)。

2.实验方法

(1)细胞培养

细胞培养于1640培养基(含10％胎牛血清，ph7.2)，置于细胞培养箱中在37℃、5％co2环境下培养。

(2)cck8试剂盒测定各药物的细胞毒性

取人多发性骨髓瘤细胞(oci-my5细胞)的单细胞悬液，计数后调整细胞浓度至2×10⁵个/ml。取96孔培养板每孔加入95μl上述细胞悬液，然后加不同浓度的用培养基配制的雷复尼特5μl，对照组加入相应体积的培养基，每组设置3个平行孔。连续培养48h，培养结束前2h，每孔加入cck8试剂10μl，于co2孵箱中继续培养。2h后自动酶标仪检测450nm各孔od值。计算细胞存活率与抑制率：细胞存活率(％)＝(实验孔od均值/对照孔od均值)×100％。细胞抑制率(％)＝100％-细胞存活率(％)。拟合函数求出抑制细胞生长达50％时药物浓度ic50。实验重复三次。

实验结果

实验结果见图3。

结论：雷复尼特对人多发性骨髓瘤细胞oci-my5具有杀伤活性，其ic50为27.8μm。

实施例4：雷复尼特对p38mapk的抑制作用

1.实验材料

(1)细胞株：人多发性骨髓瘤细胞(h929、arp-1细胞)(美国atcc，本实验室传代保存)，培养于1640培养基(含10％胎牛血清)。

(2)主要试剂：1640培养基(美国gibco公司)，胎牛血清(美国gibco公司)，雷复尼特(百灵威科技有限公司)，bca工作液(碧云天公司)，裂解液(碧云天公司)，pbs(上海生工生物工程有限公司)，sds(上海生工生物工程有限公司)，上样缓冲液(碧云天公司)，电泳缓冲液(碧云天公司)，转移缓冲液(碧云天公司)，pbst洗脱抗体缓冲液(碧云天公司)，p38mapk抗体(美国abcam公司)，p-p38mapk抗体(美国abcam公司)，p-stat1抗体(美国abcam公司)，β-actin抗体(美国sigma公司)。

(3)主要仪器：二氧化碳培养箱(美国thermoforma公司)，全自动酶标仪(bio-tek，elx800)，电泳仪(美国bio-rad公司)，odyssey双色红外激光成像系统(美国licor公司)。

2.实验方法

(1)细胞培养

细胞培养于1640培养基(含10％胎牛血清，ph7.2)，置于细胞培养箱中在37℃、5％co2环境下培养。

(2)蛋白质印迹法(westernblot法)检测雷复尼特对p38mapk的抑制作用

1)蛋白样品制备

用0、20和40μm雷复尼特处理h929细胞48小时；收集细胞，1200rpm/min，5min；去上清，用1ml1×pbs重悬细胞，离心1200rpm/min，5min；去上清，加入ripa裂解液，冰上裂解30min；4℃离心12000rpm/min，10min，收集上清，-20℃保存。

2)bca法蛋白定量

用ddh2o稀释标准蛋白，使其浓度为0.5mg/ml；将bca和cu试剂按50:1配成bca工作液；按表中的方法将各试剂加入96孔板中；将96孔板置于37℃培养箱中孵育30min；使用多功能酶标仪在波长为562nm检测吸光度；制定标准曲线，计算待测孔蛋白浓度x值。

表bca法蛋白定量加样表

3)蛋白样品加入1×上样缓冲液(loadingbuffer)，100℃加热10min。

4)配胶

清洗玻璃板，晾干待用；将玻璃板安装在配胶架上；将2×pagegel4ml(10％)与2×分离胶缓冲液(resolvingbuffer)4ml混合，加入80μlap(过硫酸铵)，混匀后立即加入玻璃板空隙中，立即加入无水乙醇封胶；待分离胶凝固后，将无水乙醇倒尽；将2×浓缩胶(stackinggel)1.5ml与2×浓缩胶缓冲液(stackingbuffer)1.5ml混合，加入30μlap，混匀后立即加入玻璃板中，加满玻璃板空隙后，小心插入10孔梳子；等待上层浓缩胶凝固后，将玻璃板从配胶架上拆下，置于加有双蒸水的袋子中，放于4℃备用。

5)westernblot试剂配置

①1×电泳液：

加入双蒸水定容到1000ml。

②1×转膜液：

加入双蒸水定容到800ml，混匀，加入甲醇200ml，置于-20℃冰箱预冷。

③pbst：1000ml1×pbs内加入1ml吐温-20，混匀备用。

④5％脱脂奶粉或5％bsa：2.5mg脱脂奶粉或bsa，用1×pbs定容到50ml，混匀，置于4℃冰箱备用。

6)上样

将玻璃板安装到电泳槽内，加入足量电泳液，取下梳子，将蛋白样品小心的加入孔中。

7)电泳

接上电源，用80v的电压进行电泳，当蛋白跑至分离胶时，可将电压调至120v进行电泳。

8)转膜

将玻璃板取下，撬开玻璃板，切下需要的分离胶，置于转膜液中；转膜夹黑面朝下，打开置于转膜液中，上面覆一层海绵垫，海绵垫上覆一层滤纸；将分离胶置于滤纸上，上面覆盖一层预先浸润的pvdf膜，上覆一层滤纸，滤纸上覆一层海绵垫；赶走气泡，将转膜夹关上，安装至转膜槽中，内置冰盒，加入足量转膜液，将转膜槽置于冰中；转膜200ma，1小时。

9)用5％脱脂奶粉或5％bsa封闭1小时。

10)分别用p38mapk、p-p38mapk、p-stat1和β-actin抗体4℃孵育过夜。

11)用pbst洗膜三次，每次5min。

12)用荧光标记的二抗室温、避光孵育1小时。

13)用pbst避光洗膜三次，每次5min。

14)用odyssey双色红外激光成像系统分析。

实验结果见图4。

结论：雷复尼特能明显抑制p38mapk信号通路。

实施例5：雷复尼特对h929裸鼠骨髓瘤移植瘤的抑制作用

1.实验材料

(1)细胞株：人多发性骨髓瘤细胞(h929细胞)(美国atcc，本实验室传代保存)，培养于1640培养基(含10％胎牛血清)。

(2)实验动物：雄性balb/c裸鼠(6-8周，购自上海斯莱克实验动物有限公司)，置于spf级环境中饲养(上海第十人民医院中心实验室动物房)。

2.实验方法

(1)细胞培养参见实施例1。

(2)动物实验

将含2.5×10⁶个h929细胞的1640培养基注射到裸鼠右腋窝皮下，当瘤子长成并可测量时，随机分为对照组和给药组。给药组裸鼠隔天腹腔注射雷复尼特15mg/kg，对照组裸鼠注射相同体积的溶剂(100μl，5％dmso+95％生理盐水)。每两天测量一次瘤子大小(测量瘤子的长和宽，瘤子体积＝(长/2)×(宽)^{^}2。给药14天后处死老鼠并取瘤子拍照。

3.实验结果

实验结果见图5-图7。

结论：雷复尼特能够有效抑制裸鼠多发性骨髓瘤的生长。

实施例6：雷复尼特对对人淋巴瘤细胞的杀伤活性

1.实验材料

(1)细胞株：人淋巴瘤细胞(oci-ly8细胞、nudul-1细胞)(美国atcc，本实验室传代保存)，培养于1640培养基(含10％胎牛血清)。

(2)主要试剂：1640培养基(美国gibco公司)，胎牛血清(美国gibco公司)，雷复尼特(百灵威科技有限公司)。

(3)主要仪器：二氧化碳培养箱(美国thermoforma公司)，全自动酶标仪(bio-tek，elx800)。

2.实验方法

(1)细胞培养

细胞培养于1640培养基(含10％胎牛血清，ph7.2)，置于细胞培养箱中在37℃、5％co2环境下培养。

(2)cck8试剂盒测定各药物的细胞毒性

取人淋巴瘤细胞(oci-ly8细胞、nudul-1细胞)的单细胞悬液，计数后调整细胞浓度至2×10⁵个/ml。取96孔培养板每孔加入95μl上述细胞悬液，然后加不同浓度的用培养基配制的药物5μl，对照组加入相应体积的培养基，每组设置3个平行孔。连续培养48h，培养结束前2h，每孔加入cck8试剂10μl，于co2孵箱中继续培养。2h后自动酶标仪检测450nm各孔od值。计算细胞存活率与抑制率：细胞存活率(％)＝(实验孔od均值/对照孔od均值)×100％。细胞抑制率(％)＝100％-细胞存活率(％)。拟合函数求出抑制细胞生长达50％时药物浓度ic50。实验重复三次。

3.实验结果

实验结果见图8-9。

结论：雷复尼特对人淋巴瘤细胞具有杀伤活性，oci-ly8细胞及nudul-1细胞的ic50分别为13.83μm，23.65μm。

实施例7：雷复尼特对人实体瘤(肝癌、乳腺癌、肺癌、前列腺癌)细胞的杀伤活性

1.实验材料

(1)细胞株：人实体瘤细胞(7211肝癌、mdamb231乳腺癌、a549肺癌、du145前列腺癌)(美国atcc，本实验室传代保存)，培养于dmem培养基(含10％胎牛血清)

(2)主要试剂：dmem培养基(美国gibco公司)，胎牛血清(美国gibco公司)，雷复尼特(百灵威科技有限公司)。

(3)主要仪器：二氧化碳培养箱(美国thermoforma公司)，全自动酶标仪(bio-tek，elx800)。

2.实验方法

(1)细胞培养

细胞培养于dmem培养基(含10％胎牛血清，ph7.2)，置于细胞培养箱中在37℃、5％co2环境下培养。

(2)cck8试剂盒测定各药物的细胞毒性

取7211、mdamb231、a549及du145细胞分别用胰酶消化后制备成单细胞悬液，计数后调整细胞浓度至6×10⁴个/ml。取96孔培养板每孔加入50μl上述细胞悬液，置co2孵箱37℃培养24h后，细胞贴壁且生长良好，加不同浓度的用培养基配制的雷复尼特5μl，对照组加入相应体积的培养基，每组设置3个平行孔。连续培养48h，培养结束前2h，每孔加入cck8试剂10μl，于co2孵箱中继续培养。2h后自动酶标仪检测450nm各孔od值。计算细胞存活率：细胞抑制率(％)＝[1-(实验孔od均值/对照孔od均值)]×100％。拟合函数求出抑制细胞生长达50％时药物浓度ic50。实验重复三次。

3.实验结果

实验结果见图10-图13。

结论：雷复尼特对人7211肝癌、mdamb231乳腺癌、a549肺癌及du145前列腺癌有很好的杀伤活性，其ic50分别为17.5μm，42.1μm，7.9μm及49.4μm。