二氢查尔酮类化合物RenifolinF的新用途的制作方法

本发明属于医药技术及保健品领域，具体涉及黄酮类化合物renifolinf在防治支气管哮喘中的应用。

背景技术：

支气管哮喘（简称哮喘，asthma）是一种异质性疾病，以气道慢性炎症、气道高反应性和气道黏液高分泌为特征，临床症状主要为反复发作的喘息、气急、胸闷、咳嗽等，夜间和清晨多发。该病由遗传因素和环境因素综合作用引起，是全球性的一种常见病、多发病，各年龄段均可患病。据统计，目前全球至少有3亿患者，中国约3000万，西欧近10年间患者也增加了1倍，并且随着经济发展和人们生活方式的改变，该病发病率和死亡率呈现快速上趋势，严重危害人民健康和生活质量。哮喘诊断时分为典型哮喘和不典型哮喘，包括急性发作期、慢性维持期和临床缓解期，其治疗目标在于达到哮喘症状的良好控制，维持正常的活动水平，同时尽可能减少急性发作、肺功能不可逆损害和药物相关不良反应的风险。

哮喘的发病原因错综复杂，其中由变应原诱导的变应性哮喘是临床上最为常见的哮喘类型，临床上至少70%以上的患者属于这个类型，在儿童和青少年中比例更高。吸入变应原是引起致敏和哮喘发作的主要途径，当机体接触变应原时，2型辅助性t细胞（thelper2cells，th2）增多，大量分泌炎性因子，激活b细胞合成ige，并促进嗜酸性粒细胞的分化、成熟、趋化和激活，从而表达各种细胞因子受体，释放炎性介质，引起组织损伤、支气管收缩、微血管通透性增高、黏膜水肿等一系列炎症反应，导致气道反应性增高和哮喘发作。

治疗哮喘的药物分为控制药物和缓解药物。控制药物需要每天使用并长期维持用药，以抗炎为主；缓解药物是在哮喘急性发作时，用于迅速解除支气管痉挛状态。给药方式有吸入给药、口服给药和注射给药，吸入为首选途径。常用药物包括：糖皮质激素、β2-受体激动剂、白三烯调节剂、茶碱、抗胆碱药和抗组胺药等，这些药物能通过不同途径迅速有效控制气道炎症、降低气道高反应性、减轻哮喘症状、提高生活质量、降低病死率，但这些药物大多会引起较大的副作用，如糖皮质激素吸入给药会引起声音嘶哑、口咽真菌感染、反射性咳嗽、口周皮炎、口干和舌体肥厚等局部不良反应，长期口服可引起机体免疫力降低、代谢紊乱、骨质疏松；β2-受体激动剂会引起骨骼肌震颤、低血钾、心律紊乱等；茶碱会导致恶心呕吐、心律失常、血压下降及多尿等。因此有必要寻找作用迅速、疗效好，并且安全性高、能长期使用的治疗哮喘的有效药物。

renifolinf是从豆科植物铜钱麻黄shuteriasinensishemsl中分离得到的的一种二氢查尔酮类化合物，结构式如下：

。

目前国内外文献均未见renifolinf具有防止哮喘的药效报道。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供二氢查尔酮类化合物renifolinf在制备预防或治疗支气管哮喘药物中的应用。

本发明通过以下方法实现的，

1、支气管哮喘为过敏性哮喘、重症哮喘、难治性哮喘、激素抵抗性哮喘、咳嗽变异性哮喘、胸闷变异性哮喘和隐匿性哮喘。

2、所述药物为含有renifolinf的制剂。

3、所述制剂由renifolinf单独制成或由renifolinf和药学上可接受的载体制成。

4、所述制剂为片剂、胶囊、丸剂、口服液、颗粒剂、混悬剂、注射剂、气雾剂、缓释制剂、舌下片。

5、所述药学上可接受的载体是指药学领域常规的药物载体，选自填充剂、粘合剂、崩解剂、增溶剂、助悬剂、润湿剂、色素、香精、溶剂、表面活性剂或矫味剂中的一种或几种。

6、所述制剂通过以下方式给药：口服、喷雾吸入、直肠给药、鼻腔给药、非肠道给药如皮下、静脉、肌肉注射或输入。

7、renifolinf拟临床用量为：5-25mg/d

8、本发明提供的renifolinf的新用途具有以下优点：

（1）本发明提供的renifolinf的新用途，即用于支气管哮喘的防治，为哮喘患者带来新的药物选择；

（2）实验结果显示，renifolinf能够明显改善卵清蛋白致敏小鼠肺组织的病理变化，抑制血清和肺泡灌洗液中多种炎性因子的生成，说明本发明的renifolinf可用于制备预防或治疗支气管哮喘药物。

附图说明

图1为本发明renifolinf的化学结构式。

图2为renifolinf对哮喘模型小鼠肺组织病理学影响（he染色）。

图3为renifolinf对哮喘模型小鼠肺组织病理学影响（pas染色）。

图4为renifolinf对哮喘模型小鼠血清中总ige水平的影响。

图5为renifolinf对哮喘模型小鼠血清中ova-特异性ige水平的影响。

图6为renifolinf对哮喘模型小鼠肺泡灌洗液中eotaxin水平的影响。

图7为renifolinf对哮喘模型小鼠肺泡灌洗液中il-33水平的影响。

图8为renifolinf对哮喘模型小鼠肺泡灌洗液中il-25水平的影响。

图9为renifolinf对哮喘模型小鼠肺泡灌洗液中tslp水平的影响。

图10为renifolinf对哮喘模型小鼠肺泡灌洗液中il-4水平的影响。

图11为renifolinf对哮喘模型小鼠肺泡灌洗液中il-5水平的影响。

图12为renifolinf对哮喘模型小鼠肺泡灌洗液中il-13水平的影响。

图13为renifolinf对哮喘模型小鼠肺泡灌洗液中il-2水平的影响。

图14为renifolinf对哮喘模型小鼠肺泡灌洗液中il-6水平的影响。

图15为renifolinf对哮喘模型小鼠肺泡灌洗液中il-7水平的影响。

图16为renifolinf对哮喘模型小鼠肺泡灌洗液中il-8水平的影响。

图17为renifolinf对哮喘模型小鼠肺泡灌洗液中il-9水平的影响。

图18为renifolinf对哮喘模型小鼠肺泡灌洗液中il-17a水平的影响。

图19为renifolinf对哮喘模型小鼠肺泡灌洗液中mcp-1水平的影响。

图20为renifolinf对哮喘模型小鼠肺泡灌洗液中muc5ac水平的影响。

图21为renifolinf对哮喘模型小鼠肺泡灌洗液中ifn-γ水平的影响。

图22为renifolinf对哮喘模型小鼠肺泡灌洗液中il-10水平的影响。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明方法作进一步详细说明，但本发明的保护范围不局限于所述内容，实施例中如无特殊说明，使用试剂为常规市售试剂，或按常规方法制得的试剂。

1、renifolinf在制备预防或治疗支气管哮喘药物中的应用

2、本发明的化合物renifolinf，分子式为c21h24o6，分子量为372，化学结构式为：

。

3、支气管哮喘为过敏性哮喘、重症哮喘、难治性哮喘、激素抵抗性哮喘、咳嗽变异性哮喘、胸闷变异性哮喘和隐匿性哮喘。

4、所述药物为含有renifolinf的制剂。

5、所述制剂由renifolinf单独制成或由renifolinf和药学上可接受的载体制成。

6、所述制剂为片剂、胶囊、丸剂、口服液、颗粒剂、混悬剂、注射剂、气雾剂、缓释制剂、舌下片。

7、所述药学上可接受的载体是指药学领域常规的药物载体，选自填充剂、粘合剂、崩解剂、增溶剂、助悬剂、润湿剂、色素、香精、溶剂、表面活性剂或矫味剂中的一种或几种。

8、所述制剂通过以下方式给药：口服、喷雾吸入、直肠给药、鼻腔给药、非肠道给药如皮下、静脉、肌肉注射或输入。

9、renifolinf拟临床用量为：5-25mg/d

10、本发明所用renifolinf主要从豆科植物铜钱麻黄shuteriasinensishemsl的根中分离得到。

实施例1：renifolinf的制备

干燥的铜钱麻黄根（5kg），粉碎后以10l70%乙醇加热回流提取3次，每次2h，提取液减压浓缩至无醇味，得乙醇浸膏（1.8kg）。浸膏用1l水分散后，以1l石油醚萃取脱脂1次，再用乙酸乙酯萃取3次，每次2l，合并乙酸乙酯萃取液，减压回收得乙酸乙酯浸膏（0.9kg）。

乙酸乙酯浸膏经硅胶柱色谱（三氯甲烷-甲醇系统）梯度洗脱（100：5-100：100），所得各馏分以薄层色谱检识，合并含有renifolinf的部分（20g），经mci柱色谱层析，甲醇-水（0：100-100：0）梯度洗脱，各馏分以薄层色谱检识，合并只含有renifolinf的部分，得renifolinf粗品（8g），经sephadexlh-20（甲醇）纯化得renifolinf纯品（3g）。对上述实施例中提取的化合物进行结构鉴定。

上述实施例中分离得到的化合物波普解析结果如下：

ir（kbr）：νmax3428，2974，2938，1638，1609，1514，1483，1460，1341，1163，1049，845cm^-1；¹h-nmr（dmso，400mhz），δ：7.80（1h，d，j=8.8hz，h-6′），6.55（2h，s，h-5，6），6.35（1h，dd，j=8.8，2.0hz，h-5′），6.27（1h，s，h-3′），3.70（3h，s，ome），3.61（1h，j=11.6，5.6hz，h-β），3.23（2h，dd，j=11.6，5.6hz，h-α），3.13（1h，dd，j=16.4，7.6hz，h-1′′b），2.95（1h，dd，j=16.4，7.6hz，h-1′′a），2.21（1h，brt，j=4.4hz，h-2′′），1.00（3h，s，h-5′′），0.98（3h，s，h-4′′）。¹³c-nmr（dmso，100mhz），δ：35.9（c-2），143.6（c-3），148.5（c-4），115.7（c-5），119.3（c-6），c=o（204.5），165.3（c-2′），102.9（c-3′），164.9（c-4′），108.6（c-5′）133.7（c-6′），30.7（c-1′′），55.6（c-2′′），71.5（c-3′′），27.1（c-4′′），28.2（c-5′′），59.6（ome）。

经波普解析，上述实施例中提取的化合物为renifolinf。

实施例2：renifolinf对小鼠哮喘的治疗作用

1、试剂：ova（批号：9006-59-1）和地塞米松（批号：bcbv3214）购于sigma公司；eotaxinelisa检测试剂盒（批号：2130802231）、il-4elisa检测试剂盒（批号：a20480141）、il-5elisa检测试剂盒（批号：a20580821）、il-13elisa检测试剂盒（批号：a21381132）、il-25elisa检测试剂盒（批号：m181225-007a）、il-33elisa检测试剂盒（批号：a23380314）、inf-γelisa检测试剂盒（批号：a201b81053）、muc5acelisa检测试剂盒（批号：zkvbmelgv3）、tslpelisa检测试剂盒（批号：a26580933）、il-2elisa检测试剂盒（批号：a20280153）、il-6elisa检测试剂盒（批号：a20681154）、il-7elisa检测试剂盒（批号：a20781123）、il-9elisa检测试剂盒（批号：a20980513）、il-10elisa检测试剂盒（批号：a21090121）、il-17aelisa检测试剂盒（批号：a21780741）、mcp-1elisa检测试剂盒（批号：a28780431）、总igeelisa检测试剂盒（批号：a27581115）购于杭州联科生物技术有限公司；ova-ige检测试剂盒（批号：0544983）购于艾美捷科技有限公司；il-8elisa检测试剂盒（批号：m181106-104α）购于欣博盛生物科技有限公司。

2、仪器：超声雾化器(inquanebplus，德国百瑞公司)；多功能酶标仪（spectramaxplus384，倍捷科技）；台式高速冷冻离心机（hr/t16m，湖南赫西仪器装备有限公司）；-80℃超低温冰箱（8920，赛默飞世尔）；电子分析天平（ar224cn，奥豪斯仪器有限公司）。

3、实验方法：

[1]实验动物与分组：清洁级雌性balb/c小鼠30只，体重18-22g，由辽宁长生生物技术股份有限公司提供。小鼠适应性喂养一周后，随机分为正常组、模型组、地塞米松组、renifolinf高剂量组、renifolinf低剂量组，每组6只。

[2]哮喘模型制备与给药：于实验1，8，15天均腹腔注射模型组、地塞米松组、renifolinf高剂量组、renifolinf低剂量组0.2mlova混悬液（含ova0.2mg，氢氧化铝1mg），正常组以0.2ml生理盐水代替。于实验21-27天，正常对照组和模型组均给予生理盐水0.01ml/g灌胃，地塞米松组给予地塞米松1mg/kg灌胃，renifolinf高、低剂量组分别给予renifolinf3g/kg、1.5g/kg灌胃，1小时后，将小鼠置于雾化激发装置内，除正常组给予生理盐水外其余各组给予2%ova生理盐水雾化激发，每天一次，每次30分钟。将小鼠呼吸急促，搔鼻抓痒、呛咳烦躁、点头运动等作为哮喘小鼠模型成功的标准。

[3]标本采集

①血清的收集：小鼠腹腔注射1%的戊巴比妥钠进行麻醉，剂量为0.01ml/g。75%乙醇消毒，摘眼球取血，室温静置1h后，800×g，4℃离心10min，-80℃保存。

②小鼠肺泡灌洗液的收集：小鼠采血完成后，将小鼠固定于泡沫板上，胸腹腔消毒后暴露胸腔，行气管插管术，用动脉夹夹闭右主支气管，并用pbs灌洗左肺2次，每次0.3ml，反复抽吸3次，合并2次灌洗液，4℃，800×g离心10min，-80℃保存。

③肺组织的收集：小鼠肺组织灌洗完后，取下右肺动脉夹，取右肺中叶，经pbs冲洗后放入4%的多聚甲醛中，用脱脂棉球压入液面以下固定48h后用石蜡包埋。

[4]肺组织病理学检测

①肺组织病理学检测（he染色）：无菌取出肺组织块固定在10%福尔马林中，制作石蜡切片，二甲苯脱蜡，依次用苏木精染液、0.1%-0.3%伊红染色，二甲苯处理后用中性树脂封片。观察小鼠肺组织的病理变化，如炎细胞浸润、管腔狭窄、气道上皮受损等病理变化；

②肺气道杯状细胞的观察（pas染色）：取肺叶于10%中性福尔马林中固定24h，制作石蜡切片，依次用1%高碘酸钠水溶液氧化、schiff液染色、苏木精染核、1%盐酸乙醇分化，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。观察小鼠气道的杯状细胞增生情况；

[5]相关细胞因子的检测（elisa法）

于-80℃取出冰冻的肺泡灌洗液及血清，恢复至室温。准备所有的试剂和标准品，按照elisa试剂盒所示方法配制标准品，分别设置空白孔、标准品孔及样品孔空白孔加入100μl标准品稀释液，标准品孔加入2倍比稀释的标准品溶液，样本孔加入l00ul稀释的样本，每孔再加入50μl稀释的检测抗体，在15分钟内完成加样过程，室温孵育1.5小时，洗涤6次，每孔加入100μl稀释的辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素，室温孵育30分钟，洗涤6次，每孔加入100μl显色底物，避光，室温孵育5-30分钟，每孔加入100μl终止液，30分钟内，于在450nm波长检测od值。以od值为横坐标坐，以标准品浓度为纵坐标，绘制标准曲线，根据样品的od值确定肺泡灌洗液中eotaxin、il-4、il-5、il-13、il-25、il-33、inf-γ、muc5ac、tslp、il-2、il-6、il-7、il-8、il-9、il-10、il-17a、mcp-1及血清中总ige和ova-ige的水平。

[6]统计学处理

采用spss20.0统计学软件进行统计分析，实验数据以均数±标准差(x±s)表示，组间比较采用t检验(方差齐时采用t检验，方差不齐时采用t'检验)。检验结果以p＜0.05为差异有统计学意义。

4、实验结果

control为正常对照组，model为模型组，dex为地塞米松组（1.0mg/kg），renifolinf-h为renifolinf高剂量组（3.0mg/kg），renifolinf-l为renifolinf低剂量组（1.5mg/kg）。正常组小鼠肺组织结构完整，粘膜上皮完整，气管平滑肌和基底膜无明显增厚，气管周围无杯状细胞增生现象；模型组组小鼠气管、肺泡及肺间质周围有大量炎性细胞浸润，上皮增生，基底膜增厚明显，气管周围有大量杯状细胞增生，并分泌大量粘液。renifolinf高低剂量组同模型组相比，炎性细胞浸润及基底膜增厚均得到不同程度缓解（图2），杯状细胞增生明显的减轻（图3），说明renifolinf能明显减轻哮喘气道炎症程度，改善气道黏液高分泌。对相关细胞因子水平检测发现，renifolinf能明显抑制血清中总ige（图4）和ova-特异性ige（图5）的产生，显著降低哮喘小鼠肺泡灌洗液中eotaxin（图6）、il-33（图7）、il-25（图8）、tslp（图9）、il-4（图10）、il-5（图11）、il-13（图12）、il-2（图13）、il-6（图14）、il-7（图15）、il-8（图16）、il-9（图17）、il-17a（图18）、mcp-1（图19）和muc5ac（图20）的水平，升高ifn-γ（图21）和il-10（图22）水平，表明renifolinf对哮喘有效。其中^##表示与正常对照组相比p＜0.01，**表示与模型组相比p＜0.01，*表示与模型组相比p＜0.05。

由此可见，renifolinf具有较强的拮抗哮喘的活性，可用于制备防治哮喘的药物。

本发明所述的小鼠哮喘模型实验中，renifolinf低剂量为1.5mg/kg，高剂量为3.0mg/kg。换算为人（以成人体重60kg计算）剂量为9-18mg。考虑到人的体重及其他生理病理情况，推荐剂量为5-25mg/d。

本发明所涉及的实施例仅用于说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。