一种放射性皮肤损伤防治药物的制作方法

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种用于激活β-catenin信号转导通路而治疗放射性皮肤损伤的药物。

背景技术：

随着放射物理、计算机技术以及医学影像技术的发展，肿瘤的放射治疗技术迅猛发展，许多先进的放疗技术如igrt、imrt、3d-crt等逐渐应用于临床，尽管放疗技术越来越精确，然而正常组织仍然会不可避免地受到照射。此外核事故的潜在可能性依然存在。放射性皮肤损伤(radiation-inducedskininjury)是肿瘤放射治疗、放射性核事故以及骨髓移植预处理之后常见的并发症，其主要的原因包括核辐射事故、肿瘤放射治疗以及职业暴露等等。如在1986年发生在前苏联的切尔诺贝利事故中，有50％以上的受照射患者存在不同程度的放射性皮肤损伤。在肿瘤放疗中，放射性皮肤损伤的发病率也呈现逐渐上升的趋势，大约有85％的肿瘤患者在放疗结束后出现不同程度的皮肤损伤[brandrmetal.jinvestdermatol.2017；137(3):576-586.]。严重的放射性皮肤损伤的患者会出现毛细血管扩张、疼痛、溃疡、皮肤感染，影响了放疗的顺利进行以及患者的生活质量。

与其他因素导致的皮肤损伤相比，放射性皮肤损伤具有潜伏期、时效性、潜在性、进行性、迁延性等特点。不同于一般的烧伤和溃疡，射线直接作用于皮肤及其深部组织细胞，造成辐射区的皮肤干燥、弹性消失、色素沉着、软组织纤维化、毛细血管扩张以及放射性皮炎等。射线导致皮肤组织中微血管和小血管内皮细胞的不可逆性损伤，造成患者受损的皮肤长期不愈合继而易发感染，病变最后发展为皮肤组织的纤维化改变甚至发生癌变，严重影响患者的生活质量。

目前，尽管在放射性皮肤损伤的防治上取得了一些进步，但仍然存在着很多问题。例如如何促进放射性皮肤损伤的功能性的再生修复的而非纤维化的修复。因此，寻找新的放射性皮肤损伤防治药物具有现实意义。

wnt是一类分泌型糖蛋白，通过自分泌或旁分泌发挥作用，目前认为它包括三个分支：经典wnt信号通路，通过β-catenin激活基因转录；wnt/pcp通路，通过小g蛋白激活jnk来调控细胞骨架重排；wnt/ca²⁺通路，通过释放胞内ca²⁺来影响细胞粘连和相关基因的表达。

β-catenin信号转导通路(也称wnt/β-catenin信号通路)广泛存在于无脊椎动物和脊椎动物中，是一类在物种进化过程中高度保守的信号通路。在β-catenin信号通路中在，β-catenin的活性调控处于中心地位。当无wnt配体存在时，gsk-3β与胞内的apc、axin、cki形成降解复合体降解β-catenin，使胞质中的β-catenin维持在较低的浓度，阻断了其对下游靶基因的激活，该通路处于关闭状态。当wnt蛋白与受体结合后，通路开启，wnt蛋白结合膜受体frz，使gsk-3β磷酸化，从而破坏降解复合体，导致β-catenin不能正常降解而在胞浆内聚集，大量游离的β-catenin进入核内，与转录因子tcf/lef结合而激活wnt信号转导通路下游靶基因的转录[clevershetal.cell.2012；149:1192-1205.leeyetal.labinvest.2016；96(2):137-150.]。

电离辐射作用于皮肤细胞从而发生凋亡并产生自由基及活性氧是其导致皮肤损伤的主要因素。wnt/β-catenin信号通路在动物胚胎的早期发育、器官形成、组织再生等生理过程具有至关重要的作用，这条信号通路中关键蛋白发生的突变会导致信号传导异常，就可能引起发育或组织再生的异常[maletal.oncotarget.2015；6:25390-25401.gilesrhetal.biochimbiophysacta.2003；1653:1-24.]。

wnt/β-catenin信号通路对哺乳动物皮肤组织辐射损伤的影响及机制仍未见报道。

技术实现要素：

为解决上述技术问题，本发明的目的是提供一种用于激活β-catenin信号转导通路而防治放射性皮肤损伤的药物。本发明的药物采用wnt3a蛋白作为主要有效成分，用以激活β-catenin信号转导通路，对人皮肤细胞和小鼠皮肤组织放射性损伤具有至关重要的防治作用，并增强了抗氧化和抗凋亡能力。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种有效量wnt3a蛋白或其可药用盐在制备一种治疗放射性皮肤损伤防治药物中的应用，其中该wnt3a蛋白的氨基酸序列如seqidno:1所示。

本发明还提供了一种有效量wnt3a蛋白或其可药用盐在制备一种抗氧化抗凋亡促迁移药物中的应用，其中该wnt3a蛋白的氨基酸序列如seqidno:1所示。

进一步地，上述两种药物能够激活β-catenin信号转导通路。

进一步地，上述两种药物还包括药学上可接受的辅料，该药物辅料为药学可接受的盐，赋形剂或载体。

进一步地，上述两种药物的剂型为水浸剂、粉剂、洗剂、酊剂、油剂、乳剂、软膏、硬膏或气雾剂中的任一种或多种。

进一步地，该药物的辅料包括磷酸缓冲溶液，其中wnt3a的浓度为0.025-1μg/μl。优选地，体外治疗的最佳浓度为1μg/μl，体内治疗的最佳浓度为0.025μg/μl，0.05μg/μl。

本发明的有益效果在于：

本发明以wnt3a蛋白作为主要成分制备了一种药物，该药物用于激活由wnt3a蛋白介导的β-catenin信号转导通路，该通路活化之后能够有效降低自由基，促进细胞增殖与组织再生，抑制辐射引起的凋亡；并且能够促进受辐射后的皮肤细胞的迁移，加速动物模型中皮肤伤口的愈合，该药物对于放射性皮肤损伤的修复具有重要意义。

上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合附图详细说明如后。

附图说明

图1为本发明通过wnt3a药物激活皮肤细胞ws1，hacat中β-catenin信号转导通路的免疫荧光鉴定结果。

图2是本发明通过wnt3a药物激活ws1，hacat细胞中β-catenin信号转导通路，皮肤细胞辐射前后的自由基水平。

图3是本发明所制备的药物降低辐射引起的细胞凋亡的结果。

图4是本发明所制备的药物促进受照后ws1，hacat细胞迁移的结果。

图5是本发明所制备的药物促进辐射-机械复合皮肤损伤愈合的结果。

具体实施方式

本发明公开了基于激活β-catenin信号转导通路作为放射性皮肤损伤防治的药物及其用途，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明提供的实施例中所用细胞、试剂盒、仪器等均可由市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1通过wnt3a激活皮肤细胞ws1，hacat中β-catenin信号转导通路的验证

将处于指数生长期的人皮肤成纤维细胞ws1以及人永生化上皮角质形成细胞hacat接种于玻璃底细胞培养皿中，待细胞贴壁生长使用x射线照射细胞，照射后加入wnt3a蛋白(1μg/ml)以及β-catenin通路抑制剂xav-939(50μmol/l)，于37℃、5％co2的培养箱内继续培养24h。采用共聚焦显微镜观察细胞中β-catenin的荧光强度以及定位情况。如图1所示，结果表明：在ws1，hacat细胞中wnt3a明显增强细胞中β-catenin的荧光强度，且使β-catenin向细胞核内的聚积。wnt3a能够激活皮肤细胞中β-catenin信号转导通路。

实施例2激活β-catenin信号转导通路降低辐射引起的自由基的实验

将处于指数生长期的人皮肤成纤维细胞ws1以及人永生化上皮角质形成细胞hacat接种于96孔板，待细胞贴壁生长后分别给以吸收剂量为0，5，10，20gyx射线照射，之后加入wnt3a和xav-939，于37℃、5％co2的培养箱内继续培养24h。每组设4个平行样，实验重复3次。吸去培养基，每孔加入1ml稀释好的dcfh-da(按照1:1000用无血清培养基稀释dcfh-da，使终浓度为10μmol/l)，在培养箱内孵育20min。用无血清培养基洗涤三次，以充分去除未进入细胞内的dcfh-da。采用酶标仪检测。如图2所示，结果表明：wnt3a激活β-catenin信号转导通路显著降低受照射后ws1，hacat细胞中自由基的水平(p<0.05)。

实施例3激活β-catenin信号转导通路抑制电离辐射对皮肤细胞的凋亡实验

将处于指数生长期的人皮肤成纤维细胞ws1以及人永生化上皮角质形成细胞hacat接种于6孔板中，待细胞贴壁生长后分别给以不同吸收剂量的x射线照射，之后加入wnt3a和xav-939，于37℃、5％co2的培养箱内继续培养24h。每组设3个平行样，实验重复3次。收集细胞，设置死活参半，7aad和pe染色，于流式细胞仪下检测两种细胞的凋亡率。如图3所示，结果表明：wnt3a激活β-catenin信号转导通路能够明显抑制电离辐射引起的皮肤细胞的凋亡。

实施例4激活β-catenin信号转导通路促进受照后皮肤细胞迁移实验

将处于指数生长期的人皮肤成纤维细胞ws1以及人永生化上皮角质形成细胞hacat接种于6孔板中，待细胞贴壁生长密度达到70％左右时，进行划痕实验，之后以不同吸收剂量的x射线照射，并加入wnt3a和xav-939，同时换为无血清培养基于37℃、5％co2的培养箱内继续培养。分别于处理后24h，48h在显微镜下进行拍照。如图4所示，结果表明：受照后加入wnt3a进一步激活皮肤细胞内β-catenin信号转导通路明显促进细胞的迁移速率。

实施例5激活β-catenin信号转导通路对小鼠皮肤组织抗辐射作用实验

6～8周龄雄性balb/c小鼠购于上海斯莱克实验动物有限公司，按每只小鼠体重的1％给予4％水合氯醛腹腔注射进行麻醉后，以4gy的剂量进行全身照射，受照后使用工具制造皮肤的机械损伤伤口。将小鼠随机分为4组，每组4只，每天分别于辐射-机械复合伤口位置涂抹pbs以及wnt3a(0.025μg/μl，0.05μg/μl)并进行拍照观察。如图5所示，与对照组相比，在复合伤伤口处涂抹wnt3a的小鼠的皮肤损伤愈合速度明显较快。结果表明：通过wnt3a激活β-catenin信号转导通路在皮肤损伤的动物模型中具有防治作用。

综上所述，本发明应用一系列生物学和分子生物学方法系统地阐明了本发明所提供的一种治疗放射性皮肤损伤及抗氧化抗凋亡促迁移的药物用于激活皮肤细胞与组织中的β-catenin信号转导通路从而对辐射皮肤与组织起到治疗与防护的作用。因此，本发明所提供的该药物为一种可用于防治人类急性皮肤辐射损伤的新型有效药，这对于提高我国应对核与辐射事故、核突发事件的医学应急能力以及降低肿瘤放射患者的皮肤辐射损伤作用具有重要意义和应用价值。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110>苏州大学

<120>一种放射性皮肤损伤防治药物

<130>b-2019cn547-i

<160>1

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>352

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<213>wnt3a

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