本发明属于基因工程领域，特别涉及mdm-2干扰序列在制备逆转非小细胞肺癌对吉非替尼耐药药物中的应用。
背景技术：
：：肺癌是目前世界上罹患癌症的男性和女性中导致死亡的最主要的病因，非小细胞肺癌(nonsmallcelllungcancer,nsclc)占据了所有肺癌患者的85％。目前在全球范内非小细胞肺癌每年的新增病例及死亡人数都在不断的攀升，也广大的医务工作人员也带来了严峻的考验。而治愈性的手术切除通常只适用于早期发病。各种分期的肺癌五年生存率只有15％。对于检查出的疾病为局限期的患者来说，生存率也仅为49％，这说明，即使是早期的诊断，该疾病的复发和死亡也是很普遍的，因此，为肺癌患者寻找新的治疗方法十分关键。吉非替尼是一种可逆性小分子酪氨酸激酶抑制剂，结构与atp类似，通过与atp竞争可逆性的与egfr结合，达到阻断其下游信号通路的目的，目前已经被多个国家批准用于治疗晚期非小细胞肺癌(nsclc)。酪氨酸激酶催化下游分子磷酸化，随即启动一系列下游的信号通路，包括plcγ、pi3k、小的g蛋白、p21ras、rasgtp酶激活蛋白(gap)、生长因子受体结合蛋白2(grb2)和src激酶家族等。其中研究较明确的主要有两条途径：一条是ras/erk/mapk途径。另一条是pi3k-akt-pkc-ikk途径，导致nfκb移位至核内，而将信息传递入细胞核。egfr活化后经过上述信号传导途径最终引起一系列相关基因活化，导致肿瘤细胞持续增殖，凋亡抑制，以及包括血管形成因子在内的多种细胞因子合成，促使肿瘤细胞转移并导致放化疗抗拒。对于egfr突变型的非小细胞肺癌患者有着较高的有效率，并且由于其毒性反应低，耐受性良好已经成为非小细胞肺癌治疗最有力武器之一，但是多数患者在使用吉非替尼一段时间后(通常为8-10个月)会出现疾病再次进展，根本原因是由于肿瘤细胞由于长期暴露于吉非替尼后产生了对吉非替尼的获得性耐药，目前已知的两种肺癌吉非替尼获得性耐药的重要机制是“egfr19外显子缺失且发生t790m突变或其他继发性突变”和“met扩增旁路激活通路”，但这两种机制尚不足以完全解释egfr-tki获得性耐药，仍有大约30％左右的患者产生吉非替尼获得性耐药但仍机制不明。因此探索除egfr突变状态外的其它吉非替尼耐药机制，逆转肺癌细胞对吉非替尼的耐药显得尤为重要。mdm2作为p53的经典抑制因子为人们所熟知，它通过阻断p53介导的基因转录和降解p53来实现其癌蛋白功能。对mdm2的研究已广泛而深入，但多局限于癌细胞凋亡、抗增殖以及细胞周期停滞等方面。然而逐渐有越来越多的证据显示mdm2可以不依赖于p53发挥其癌蛋白的功能。无野生型p53而mdm2表达增高的肿瘤细胞仍然具有高侵袭潜能，且患者往往出现化疗失败的情况。本研究关注于mdm2在肺癌耐吉非替尼的组织样本和细胞株中表达水平，分析mdm2作为预测吉非替尼耐药分子标志物和逆转吉非替尼耐药的可能性。发明人进行进一步研究首次发现p-mdm2蛋白的表达水平egfr-tki耐药密切相关，可作为吉非替尼耐药的分子标志物，通过设计p-mdm2特异性的干扰序列下调肺癌细胞中p-mdm2蛋白的表达水平可以部分逆转肺癌细胞对吉非替尼的耐药性，为制备逆转非小细胞肺癌对吉非替尼耐药药物提供基础和实验依据。技术实现要素：发明目的本发明的目的是提供mdm2及其干扰序列的新用途。技术方案mdm2在制备作为非小细胞肺癌对吉非替尼耐药标志物中应用。mdm2干扰序列在制备逆转非小细胞肺癌对吉非替尼耐药药物中的应用，所述mdm2干扰序列为：seqidno：1，即gaagttattaaagtctgtt。具体来说：1、应用免疫组化的方法检测51例口服egfr-tki患者肺癌组织样本中p-mdm2表达水平，发现：p-mdm2的高表达与egfr-tki耐药与较短的生存时间相关。rna干扰的方法，将mdm2的干扰序列转染至耐吉非替尼的pc-9/g细胞中可以在细胞水平均起到逆转pc-9/g细胞对吉非替尼耐药的效应。有益效果吉非替尼是一种表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(egfr-tkis)，其作用机制有：竞争表皮生长因子受体酪氨酸激酶催化区域上的mg-atp结合位点，阻断其信号传递；抑制肿瘤血管生成；抑制有丝分裂原活化蛋白激酶的活化，促进细胞凋亡。目前在临床实验中已证实吉非替尼对局部晚期非小细胞肺癌、转移性非小细胞肺癌等具有抗肿瘤效应并可改善疾病相关症状；适用于治疗接受过化疗或不适于化疗的局部晚期或转移性非小细胞肺癌(nsclc)。然而，即使是治疗有效者，多数也会在治疗后6～12个月发生不同程度的耐药现象。最终将导致肿瘤进展，药物的疗效降低，所以研究其耐药机制尤为重要。本发明通过合成mdm2的干扰序列并rna干扰的方法可以显著的下调耐吉非替尼的肺癌细胞中mdm2蛋白的表达水平从而起到逆转耐药的作用。p-mdm2蛋白的表达水平与egfr-tki的耐药及不良预后相关提示：p-mdm2蛋白可以作为新的分子标志物在预防非小细胞肺癌对egfr-tki的耐药性方面应用。附图说明图1.免疫组化的方法检测口服egfr-tki患者肺癌组织样本中p-mdm2表达水平的代表性图片。图2.p-mdm2蛋白表达水平与口服egfr-tki疗效的关系的结果.pd:egfr-tki耐药的患者；(pr+sd)：egfr-tki敏感的患者；*p<0.05,**p<0.01图3.高表达p-mdm2的非小细胞肺癌患者与低表达p-mdm2的非小细胞肺癌患者在口服egfr-tki后生存曲线。图4.蛋白免疫印迹实验检测非小细胞肺癌吉非替尼敏感的pc-9细胞株和吉非替尼耐药的pc-9/g细胞株中p-mdm2和mdm2的表达水平。图5.cck-8方法检测在应用simdm2干扰后pc-9/g细胞对吉非替尼敏感性的影响。图6.蛋白免疫印迹实验检测非小细胞肺癌吉非替尼耐药的pc-9/g细胞株在应用mdm2干扰后凋亡水平的变化。具体实施方式以下通过实施例对本发明作进一步的阐述，但不限制本发明。一般性说明：实施例中末注明具体条件的的实验方法，基本上都按照sambrook，j等人编著的《分子克隆实验指南(第3版)》(molecularcloning:alaboratorymanual,3rded.黄培堂等译，科学出版社.2002.8)中所述的条件及方法或按照材料提供商所建议的条件及方法进行，其它没有详细描述的技术相应于本领域人员来说是熟知的标准方法。本发明的材料：本申请中提及的细胞株、脂质体以及培养基均有商品供应或以别的途径能为公众所得，它们仅作举例，对本发明不是唯一的，可分别用其它适合的工具和生物材料来代替。p-mdm2-shrna慢病毒制备方法：1.p-mdm2干扰序列由本研究团队设计，其序列为：gaagttattaaagtctgtt。2.p-mdm2干扰序列的合成及慢病毒包装由吉凯基因有限公司完成。基本知识介绍：疾病进展(pd,progressivedisease)靶病灶最大径之和至少增加≥20％，或出现新病灶疾病稳定(sd,stabledisease)靶病灶最大径之和缩小未达pr，或增大未达pd部分缓解(pr,partialresponse)靶病灶最大径之和减少≥30％，至少维持4周完全缓解(cr,completeresponse)所有靶病灶消失，无新病灶出现，且肿瘤标志物正常，至少维持4周。应用egfr-tki治疗后，通过评判cr，pr，sd则视为治疗有效果，而评判为pd则视为治疗无效或者说是耐药。实施例1免疫组化的方法检测51例口服egfr-tki患者肺癌组织样本中p-mdm2表达水平并分析与egfr-tki药物敏感性及预后的关系(一)：免疫组化的方法检测51例口服egfr-tki患者肺癌组织样本中p-mdm2表达水平：1.方法：操作步骤固定、脱水与透明：样本先用4％甲醛固定，将固定后的标本按以下次序依次脱水处理。脱水时需经常晃动组织块，以保证组织块可以充分与乙醇或二甲苯接触，每一步骤之后充分滤干组织块，用纸吸干组织块上的液体。脱水和透明顺序如下：浸蜡、包埋：事先将石蜡置入68℃恒温箱内以充分溶解，待组织脱水与透明结束后，将组织块转入石蜡里。过三道石蜡，每次1小时，随后将组织放入包埋框内成包埋。切片：切片厚约5μm，将切片在蒸馏水中展片，贴于防脱片剂处理过的载玻片，68℃烘3-4小时，该切片用于免疫组化。免疫组化：1)、脱蜡、水化；2)、抗原修复；3)、切片用pbs洗3×5min；4)、去内源性过氧化物酶：用pbs新鲜配制3％过氧化氢，加到玻片上，室温下30分钟以灭活内源性酶；5)、ddh2o洗3×5min；6)、封闭：用5％胎牛血清封闭切片，室温下封闭20分钟，吸去多余液体，不洗；7)、一抗：用bsa稀释一抗，稀释倍数1:200，4℃孵育过夜；8)、pbs洗3×5min；9)、二抗：用pbs稀释二抗(1:200)，室温孵育1小时；10)、pbs洗3×5min；11)、abc试剂盒(武汉博士德)中a，b和c液各取等体积，1:20稀释至ddh2o中，显色1-3min，镜下控制反应时间，最后用ddh2o洗涤，镜下观察；12)、苏木素复染3-5min，ddh2o洗涤；13)、加1％盐酸酒精分色液分色，分色时间约1以内，ddh2o冲洗，镜下可见细胞核着蓝色；14)、脱水，透明；15)、中性树脂封片，显微镜下观察拍照。2.免疫组化结果：如图1所示。3结果分析：p-mdm2蛋白表达水平在egfr-tki耐药的患者肺癌组织中的表达水平要显著高于egfr-tki敏感的患者。(二)：分析p-mdm2表达水平与口服egfr-tki患者疗效的关系：1.方法：比较口服egfr-tki治疗后疗效不同的患者肺癌组织中p-mdm2蛋白表达水平的差异；生存曲线法分析高表达p-mdm2的非小细胞肺癌患者与低表达p-mdm2的非小细胞肺癌患者在口服egfr-tki后生存时间的差异。2.结果测定：p-mdm2蛋白表达水平与口服egfr-tki疗效的关系的结果：如图2所示。.p-mdm2蛋白表达水平与口服egfr-tki后生存时间关系的结果：如图3所示。.3结果分析：p-mdm2蛋白表达水平在egfr-tki耐药的患者(pd)肺癌组织中的表达水平要显著高于egfr-tki敏感(pr+sd)的患者。高表达p-mdm2的非小细胞肺癌患者在口服egfr-tki后生存时间要显著短于低表达p-mdm2的非小细胞肺癌患者。实施例2蛋白免疫印迹实验检测非小细胞肺癌吉非替尼敏感的pc-9细胞株和吉非替尼耐药的pc-9/gr细胞株中p-mdm2的表达水平：1.方法：提取细胞总蛋白；sds-page电泳；半干式转膜；免疫印迹；ecl检测2.结果测定：如图4所示。3.结果分析：吉非替尼耐药的pc-9/g细胞株中p-mdm2和mdm-2的表达水平要显著高于吉非替尼敏感的pc-9细胞株。实施例3cck-8方法检测在应用simdm2(gaagttattaaagtctgtt)干扰后pc-9/g细胞对吉非替尼敏感性的影响：1)接种细胞：用0.25％胰蛋白酶消化单层培养细胞，用含10％胎牛血清的1640培养液配成单个细胞悬液，以每孔2500个细胞接种于96孔培养板中，每孔体积200ul。2)培养细胞：将培养板移入co2孵箱中，在37℃、5％co2：及相对湿度条件下，培养3天。3)呈色：培养第1—3天后，每孔加入cck-8溶液20ul，37℃，继续孵育4h。4)比色：490nm波长处测定光密度值(od)，每组3个复孔,重复三次实验。计算生存率。生存率＝实验组od值/对照组od值×100％。按如上方法将分别由奥西替尼及奥西替尼+pf-4708671处理的hcc-827/or种在96孔板上，3500个细胞/孔。每组给予不同浓度的吉非替尼处理，给药3天后cck-8染色法检测细胞活力，进而计算各自的药物ic50。5)结果测定:如图结果测定:如图5。6)结果分析:simdm2干扰可以逆转pc-9/g细胞对吉非替尼的耐药性。实施例4蛋白免疫印迹实验检测非小细胞肺癌吉非替尼耐药的pc-9/g细胞株在应用：simdm2干扰后凋亡水平的变化：1)pc-9/g经过奥西替尼及奥西替尼+pf-4708671处理，培养一定时间后，经胰酶消化、pbs润洗。2)然后加入annexinv和7-aad标记，孵育15分钟后。3)通过流式细胞仪(facs)检测。annexinv阳性、7-aad阴性的细胞判断为凋亡细胞。4)结果测定:如图结果测定:如图6。5)结果分析：simdm2干扰联合吉非替尼可以促进的pc-9/g细胞的凋亡率，逆转耐药性。序列表<110>南京医科大学附属逸夫医院<120>mdm-2及其干扰序列在制备逆转非小细胞肺癌对吉非替尼耐药药物中的应用<160>1<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>19<212>dna<213>人工序列(2ambystomalateralexambystomajeffersonianum)<400>1gaagttattaaagtctgtt19当前第1页12当前第1页12