七叶皂苷类化合物在制备药物中的应用的制作方法

本发明涉及一种天然药物化合物的应用，特别涉及七叶皂苷类化合物在治疗亨廷顿舞蹈症及帕金森症中的应用，属于天然药物化合物制药应用领域。

背景技术：

七叶皂苷(escinsaponins)为七叶树科植物天师粟的干燥成熟种子提取得到的皂苷化合物，是一种天然植物药化合物成分。动物实验证明，七叶皂苷类化合物具有多种生物活性，包括消炎、抗渗出、增加静脉张力、改善血液循环以及纠正脑功能失常等作用。

神经退行性疾病是许多疾病的总称，如阿尔茨海默病(ad)，帕金森病(pd)和亨廷顿氏病(hd)，主要是由于人脑中的神经元损伤所致神经疾病。其中，亨廷顿疾病主要表现为进行性运动和认知功能障碍，其发病机理是由4号染色体上亨廷顿蛋白(htt)基因的扩增cag重复扩增(>36)引起变异亨廷顿蛋白(mhtt)上多聚谷氨酰胺(polyq)长突变。mhtt易于在神经元中聚集，并在细胞和动物模型中引起导致细胞毒性。因此，mhtt的清除已成为治疗hd的最希望的治疗策略。

帕金森病(parkinson'sdisease，pd)是一种老年人常见神经性病变病症，临床表现主要包括静止性震颤、运动迟缓、肌强直和姿势步态障碍。pd的主要病理改变是纹状体多巴胺(dopamine，da)含量显著性减少，导致神经元变性死亡而致病。帕金森病会随着年龄增长而逐渐变得严重，如果不能及时的对帕金森症进行治疗控制，患者会逐渐出现智能减退、情感障碍，带来严重的社会负担。

自噬通过降解细胞中受损或不必要的物质，对于维持细胞稳态发挥着重要作用。在细胞实验和动物模型实验表明，一旦自噬功能受损，胞质内易聚集的蛋白质如β-淀粉样蛋白(aβ)，异常磷酸化修饰的tau蛋白，突变体α-突触核蛋白和亨廷顿蛋白就会加速积累。另外，这些聚集蛋白的积累与它们在神经元中的细胞毒性高度相关。因此，必须通过增强自噬作用来降解毒性聚集蛋白质以恢复神经元活力。丁苯那嗪(tetrabenazine)是一种多巴胺消耗剂，目前是用于治疗hd的最有效的药物，但是存在诸多副作用，例如抑郁、嗜睡和帕金森综合征等。据最新研究表明，许多化合物或天然化合物能够通过自噬降解mhtt。例如，美国fda批准的药物利美尼定(rilmenidin)，能够诱导自噬并减弱mhtt的细胞毒性。海藻糖(trehalose)是一种天然产物，可通过mtor非依赖途径促进α-突触核蛋白和mhtt的降解。此外，我们之前已经确定了传统中草药(tcms)中的成分，如远志和洋常春藤(radixpolygalaandhederahelix)中分离得到的天然皂苷(saponins)，石莲子(nelumbonuciferagaerth)中分离得到的莲心碱(neferine)，可通过ampk/mtor通路诱导自噬，加速mhtt的降解并抑制其对于pc-12细胞的细胞毒性。然而，在临床上仍然没有任何有效的自噬诱导剂用于治疗hd。因此，迫切需要能够有效清除mhtt且具有较少副作用的高效自噬诱导剂。

传统中草药(tcms)具有超过2000年的使用历史，其中大多数已被证明是安全、有效的。七叶树(aesculuschinesisbge，acb)是一种常用的中药，具有抗炎、消肿、抗癌、抗高血糖、防肥胖和抗溃疡作用。最新研究表明，acb中的主要成分三萜皂苷具有神经保护作用，例如对于慢性mptp/p诱导的pd小鼠模型具有抗氧化和抗凋亡作用。此外，它还可以减少氧化应激、减轻因短暂性全脑缺血导致的小鼠认知缺陷和海马体损伤。然而，却没有关于acb中三萜皂苷具有自噬诱导作用的报道，如促进mhtt的聚集蛋白的降解。

综上所述，目前临床上亨廷顿症的主要治疗药物存在诸多副作用，近期研究发现诸多化合物具有诱导自噬而缓解亨廷顿疾病的作用，也有研究报道部分传统中草药也具有诱导细胞自噬作用的特点。如果能够开发出更多的具有治疗神经退行性疾病的药物，那么可以为广大神经退行性疾病患者提供更多的治疗备选药物，降低医疗成本，提高治疗效果。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有技术中所存在的亨廷顿舞蹈症和帕金森病严重影响人类生命健康，缺乏良好的治疗方法的问题，提供一种七叶皂苷类化合物(escinsaponins)在制备药物中的应用，特别是应用于治疗亨廷顿舞蹈症、帕金森病的药物制备中的应用，为帕金森症、亨廷顿舞蹈症提供新的治疗选项。

为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：

七叶皂苷类化合物在制备药物中的应用。

优选地，在治疗神经退行性疾病药物中的应用。

进一步，七叶皂苷类化合物在制备用于治疗亨廷顿舞蹈症、帕金森病的药物中的应用。

进一步，所述七叶皂苷类化合物是七叶树种子提取得到的三萜皂苷。优选地，所述七叶皂苷类化合物是escinia、escinib、isoescinia中的任意一种或几种。可以是单独使用其中一种作为药物活性成分，也可以使用多种进行组合作为药物活性成分。

所述七叶皂苷类化合物escinia、escinib、isoescinia的分子结构如下：

进一步，所述七叶皂苷类化合物通过抑制mhtt的蛋白表达水平发挥作用。

进一步，所述七叶皂苷类化合物通过促进lc3-ii和抑制p62的表达发挥激活细胞自噬的作用。

进一步，所述七叶皂苷类化合物通过抑制pi3k/akt并激活ampk，然后抑制mtor的活性，下调p70s6k和ulk表达水平，发挥诱导自噬作用。

进一步，所述七叶皂苷类化合物通过激活erk信号通路发挥作用。

进一步，所述七叶皂苷类化合物通过mtor和erk信号传导通路激活atg7依赖的细胞产生自噬作用

进一步，所述七叶皂苷类化合物通过降解mhtt，降低mhtt对ht22细胞的细胞毒性，发挥细胞保护作用。

进一步，所述七叶皂苷类化合物通过a53t-α-突触核蛋白的降解作用，发挥对帕金森症细胞模型的保护作用。

本发明应用七叶皂苷类化合物中escinia、escinib、isoescinia作为药物活性成分，引导激活细胞自噬作用，提高细胞存活能力，改善亨廷顿舞蹈症和帕金森病患者的健康状态，提高生活质量，延长患者的生命。因此七叶皂苷具有神经细胞保护作用，能够防止神经细胞凋亡，具有治疗神亨廷顿舞蹈症和帕金森的潜力，可以作为新药候选天然药物化合物活性成分使用。

本发明的另一目的是提供一种提取得到上述七叶皂苷类化合物的方法，更好的从天然药材原料药材中提取获得具有相应活性的七叶皂苷类化合物成分，满足七叶皂苷类化合物作为药物活性成分应用、研究的需求。

一种七叶皂苷类化合物提取方法，包括以下步骤：

s1、取七叶树种子，干燥，加入5-20倍体积的甲醇超声提取1-3小时，重复两次；合并提取液。

s2、将提取液过滤，真空旋转蒸发浓缩至干；将干燥的提取物重新悬浮分散在水中，加入大孔树脂吸附。

s3、用4-6倍体积的50-70％甲醇洗涤大孔树脂，收集洗脱液，真空旋转蒸发，浓缩至其体积的1/10；静置结晶，过滤，得到粗结晶，重复结晶2-3次，得到精制结晶品，即为七叶树种子总皂苷(es)。

进一步，还包括s4、将七叶树种子总皂苷(es)重新溶解在甲醇中，然后用pre-hplc进行分离；收集三个主峰化合物，浓缩，分别得到escinia、escinib、isoescinia。

与现有技术相比，本发明的有益效果：

1、本发明通过实验研究证明七叶皂苷类化合物可以作为活性成分，具有增强瞬时转染的egfp-htt74和egfp-a53tα-突触核蛋白ht22细胞中mhtt和a53tα-突触核蛋白的清除速率的作用；可以激发ht22细胞中有效自噬作用。增强细胞抗凋亡能力，降解mhtt，保护神经细胞，具有治疗神亨廷顿舞蹈症和帕金森的潜力，可以用于药物制备。

2、本发明应用七叶皂苷类化合物作为活性成分，通过mtor和erk信号传导通路激活自噬作用，并且该信号传导通路依赖于atg7基因。其中，mhtt的降解作用被证明与ht22细胞中这些皂苷的自噬诱导作用密切相关。

3、本发明还提供了一种通过天然植物药材分离提取得到上述七叶皂苷类化合物的方法，由现有的天然植物药材原料通过超声回流提取以及色谱分离获得高品质的七叶皂苷类化合物纯净品。

附图说明：

图1a是七叶树科植物七叶树aesculuschinesisbge.的种子，又名娑罗子，别名苏罗子、棱罗子。图1b是七叶皂苷类化合物escinsaponins总得质谱总离子流图tic、紫外光谱流图uv图谱。图1c是escinia的tic、uv、ms图谱。图1d是escinib的tic、uv、ms图谱。图1e是isoescinia的tic、uv、ms图谱。

图2a是es(七叶皂苷总皂苷化合物)的24小时毒性实验。图2b是ea(escinia)、eb(escinib)、iea(isoescinia)24h毒性实验。图2c是ea(escinia)、eb(escinib)、iea(isoescinia)48h毒性实验。图2d是分别使用5、10、20μg/ml等浓度es、ea、eb、iea进行annexinv-pe细胞凋亡实验图，以及对照组的细胞活性试验结果。

图3a-3e是对照组、es、ea、eb、iea实验组，测试细胞egfp-htt74、β-actin实验结果。图3f是实验中egfp-htt74信号计数结果。图3g是细胞荧光照片，比较对照组、ea、eb、iea实验组的egfp-htt74、dapi染色比较。

图4a是对照组、es实验组(2.5、5、10、20μg/ml)的细胞gfp-lc3荧光斑点图。图4b是转染lc3质粒的ht22细胞在es实验组(2.5、5、10、20μg/ml)条件下，p62，lc3i、lc3ii、β-actin表达响应。图4c对照组、ea、eb、iea实验组(2.5、5、10、20μg/ml)的细胞gfp-lc3荧光斑点图。图4d-4f是ea、eb、iea作用影响lc3i、lc3ii、β-actin蛋白表达响应。

图5a是eb作用下细胞中p70s6k、β-actin、p-mtor、p-akt、mtor、akt、p-p70s6k、ulk、p-ulk、p-pi3k、pi3k、p-ampk、ampk蛋白表达检测结果。图5b是eb作用下细胞中p-mek、p-erk、β-actin、mek、erk、p-raf、raf蛋白表达检测结果。

图6a是ea、eb、iea作用，gfp-lc3荧光斑点图。图6b是eb、sch协同作用下lc3i、lc3ii、β-actin表达响应。图6c是eb、cc协同作用下lc3i、lc3ii、β-actin表达响应。图6d是eb、3ma协同作用下lc3i、lc3ii、β-actin表达响应。图6e是eb、baf协同作用下lc3i、lc3ii、β-actin表达响应。

图7a是检测细胞在eb、sch、cc、3ma等作用下egfp-htt74、dapi荧光表达图。图7b是eb、cc协同作用下，细胞gfp、β-actin表达响应。图7c是eb、3ma协同作用下，细胞gfp、β-actin表达响应。图7d是eb、baf协同作用下，细胞gfp、β-actin表达响应。

图8a-8b是ea、eb、iea对于mefatg7^+/+、mefatg7^-/-基因细胞的gfp-lc3斑点染色图。

图9a-9d是es、ea、eb、iea对于mefatg7^+/+、mefatg7^-/-基因细胞的lc3i、lc3ii、egfp-htt74、β-actin蛋白表达影响。图9e是ea、eb,iea对于转染lc3-gfp的mefatg7^+/+、mefatg7^-/-基因细胞的gfp-lc3斑点图。

图10a是流式检测药物ea,eb，iea对转染htt-74-gfp的ht22细胞的pe表达的影响。图10b是htt74阴性组、htt74阳性组，ea、eb、iea分别作用下，对于caspase-3、bcl-2、bax、β-actin、caspase-9表达的影响。

图11a是野生型wt和a53t+组细胞，在ea、eb、iea作用下的表达情况。图11b是野生型wt和a53t+组细胞，在ea、eb、iea作用下相应的荧光表达图。

具体实施方式

下面结合试验例及具体实施方式对本发明作进一步的详细描述。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例，凡基于本发明内容所实现的技术均属于本发明的范围。本发明未特别说明的溶液百分比一般是指重量百分比。

亨廷顿舞蹈病(hd)是一种遗传性进行性神经退行性疾病，其特征在于亨廷顿蛋白(htt)蛋白中的长突变体聚谷氨酰胺束。自噬在降解与神经发生性疾病密切相关的聚合蛋白如β-淀粉样蛋白(aβ)，α-突触核蛋白和突变htt(mhtt)中起关键作用。在该研究中，三萜皂苷包括从七叶树(aesculuschinesisbge.)的种子中分离的七叶素ia(ea)，七叶素ib(eb)和异七叶素ia(iea)。我们(acb)可以抑制ht22细胞中mhtt的蛋白质水平。此外，这三种皂苷被证实为新型自噬增强子，其上调lc3ii蛋白和gfp-lc3斑点形成，并下调p62表达。机制研究发现具有最佳自噬诱导作用的eb可通过mtor和erk信号通路激活自噬，这些通路依赖于atg7基因。此外，ea，eb和iea诱导的自噬被证明与mhtt的降解和ht22细胞凋亡的抑制密切相关。总之，我们首先报道了ea，eb和iea等皂苷可以在体外降解mhtt，体内验证在未来是有价值的。因此，acb中的三萜皂苷可能是治疗hd的有希望的候选者。

本发明实验过程中，使用到的原料和试剂如下：

3-甲基腺嘌呤(3-ma，t1879)，sch772984(sch，t6066)购自topscienceco.，ltd。(中国上海)。巴弗洛霉素(baf，b101389)购自aladdinbio-chemtechnologyco.，ltd。(中国上海)。compoundc(cc)获自calbiochem(sandiego，ca，usa)。egfp-htt74质粒是来自davidc.rubinsztein(剑桥大学，剑桥，英国)的赠送。pegfp-lc3质粒由tamotsuyoshimori(大阪大学，日本大阪)友情提供。细胞计数试剂盒-8(cck-8)购自dojindolaboratories(kumamoto，japan)。本研究中使用的抗体包括p-pi3激酶(p-pi3k，4228)，pi3激酶(pi3k，4249)，p-akt(4060)，akt(4691)，p-mtor(5536)，bax(14796)，bcl-2(3498)，gfp(2955)，p-ampk(2535)，p-ulk1(6888)，p-mek1/2(9154)，mek1/2(4694)，p-erk(4370)，erk(4695)，p-raf(2696)，raf(14814)，p-p706k(9205)，β-肌动蛋白(4970)和抗兔igg(4414)购自cellsignalingtechnology(danvers，ma，usa)。lc3b(pm036)，caspase-3(m097)，caspase-9(m054)购自mbl(nagoya，japan)。p706k抗体(14485-1-ap)获自proteinch公司(中国武汉)，ulk(d1718)来自santa(texas，america)。ampk(sh030221e)和mtor(sa080117ah)购买与abgent(sandiego,california,usa)

试验仪器及设备

采用配备有dad检测器的安捷伦agilent6230质谱仪，通过电喷雾电离(esi)飞行时间(tof)，检测得到七叶皂苷类化合物的tic、uv、ms图谱。

首先，以填充硅胶(40-60μm，)柱进行色谱分离得到七叶皂苷类化合物es、ea、eb、iea初步分离，并进行成分验证。

然后，通过配备有1200型四元泵和1200型二极管阵列检测器的制备型高效液相色谱(pre-hplc，安捷伦)，c18柱(250mm×10mm，粒径：5μm)，分离纯化七叶皂苷类化合物纯净品。

二、原料药材

七叶皂苷是从七叶树科植物七叶树的干燥成熟种子提取得，经过高效液相色谱分离得到escinia、escinib、isoescinia的纯净品。

三、提取和分离

取风干七叶树种子(acb)2kg，粉碎成粗粉，用10倍体积的甲醇超声提取1小时，重复两次。合并提取液，过滤，真空旋转蒸发浓缩至干。将干燥的提取物重新悬浮分散在水中，加入大孔树脂吸附。然后，用4-6倍体积的50-70％甲醇洗涤大孔树脂，收集洗脱液，真空旋转蒸发，浓缩至其体积的1/10。静置结晶，过滤，得到粗结晶，重复结晶2-3次，得到精制结晶品(235mg)，即为es(七叶树种子总皂苷)。为了进一步分离ea，eb和iea，将es重新溶解在甲醇中，然后用pre-hplc进行分离。收集三个主峰化合物，浓缩，用于进一步的质谱(ms)和核磁共振(nmr)研究分析，确认其结构。

四、色谱条件

将七叶树种子总提取物、总皂苷(es)，ea，eb和iea的所有样品，用配备有lc-3ad溶剂调节系统，sil-30acxr自动进样器，cto-的shimadzu系统(日本京都)上进行分析，cto-30ac柱温箱，dgu-20a3脱气机和cbm-20a控制器。

色谱柱：agilentzorbaxeclipseplusc18柱(100mm×2.1mm，1.8μm，流速：0.35ml/min)。

温度：柱温箱温度设定为40℃。

梯度洗脱程序：流动相由a(0.1％甲酸水溶液)和b(0.1％甲酸的乙腈溶液)组成：0-8分钟，5-70％b；8-11分钟，70-100％b；11-12分钟，100％b；12-15分钟，5％b。

uhplc-qtof-ms/ms分析采用具有负电喷雾离子模式(absciex，fostercity，ca，usa)的duo喷雾源的三重toftmx500r系统上进行。电喷雾电离以负模式应用，具有以下参数：离子喷射电压，-4500v；离子源温度，500℃；窗帘气体，25psi；喷雾器气体(gs1)，50psi；加热器气体(gs2)，50psi；和去聚电位(dp)，-100v。对于tof-ms扫描，质量范围设定在m/z60-2000da。使用peakview1.4软件(absciexfostercity，ca，usa)分析lc-ms/ms数据。

五、细胞培养

本发明实验中使用的小鼠海马神经元细胞系ht22购自americantypeculturecollection(atcc；rockville，md，usa)。

野生型atg7(atg7^+/+)和atg7缺陷型(atg7^-/-)小鼠胚胎成纤维细胞(mef)由masaakikomatsu(juntendouniversity，schoolofmedicine，tokyo，japan)提供。

所有细胞均在补充有10％fbs，青霉素(100u/ml)和链霉素(100μg/ml)的dmem中，在37℃湿润的5％co2气氛培养箱中培养。

六、细胞毒性测定

通过cck-8测定检测es、ea、eb和iea对ht22细胞的细胞毒性。简而言之，将细胞接种于96孔板上，密度为5×10³细胞/孔，过夜，然后用es(0-200μg/ml)，ea、eb和iea(1.25-80μm)分别处理24小时、48小时。处理完成后，将培养基替换为含有10％cck-8的dmem溶液的100μl，培育1小时。使用thermoscientificmicroplatereader在450nm下测量溶液的吸光度值。使用以下公式计算细胞存活率的百分比：细胞存活率(％)＝细胞数处理组/细胞数dmso对照组×100。每个样品设置三个平行样。

使用annexinv-fitc/pi凋亡染色/检测试剂盒(4abiotechco.，ltd，beijing，china)通过流式细胞术测量细胞活性。简而言之，在处理后，将ht22细胞用胰蛋白酶消化并与annexinv溶液和pe溶液孵育15分钟。按照设备实验手册规范进行实验。然后，通过使用facsverse流式细胞仪(bdbiosciences，newjersey，usa)进行流式细胞术分析。使用flowjo7.6软件(flowjollc。，oregon，usa)进行数据分析。每个样品设置三个平行样。

七、gfp-lc3荧光亮斑检测

按照文献(wuag,wongvk,xusw,chanwk,ngci,liul,etal.onjisaponinbderivedfromradixpolygalaeenhancesautophagyandacceleratesthedegradationofmutantalpha-synucleinandhuntingtininpc-12cells.intjmolsci.2013；14(11):22618-41.)所述的方法测定gfp-lc3。

为了检测自噬的诱导，将ht22或mef的细胞悬液以2.5×10⁵个细胞/孔的密度接种到6孔板中的盖玻片上。培育24小时，将细胞用pegfp-lc3转染12小时。然后弃去上清，将不同浓度的药物干预细胞24小时。处理后，用pbs洗涤细胞，并在室温下用4％多聚甲醛(pfa)固定15分钟。然后，将盖玻片用pbs洗涤三次并取出进行空气干燥，并用fluorsavetm封固剂(calbiochem，sandiego，ca，usa)进行荧光显微镜分析。在olympus显微镜下捕获代表性图像，并计数gfp阳性细胞和具有gfp-lc3斑点形成的细胞的数量。通过计算具有点状gfp-lc3荧光的细胞对gfp阳性细胞的百分比来定量自噬诱导。对来自3个随机选择的区域的至少300个细胞进行评分。

八、蛋白质印迹(westernblot)

在使用试验药物处理后，收集细胞，用不含edta的蛋白酶抑制剂混合物(targetmol，shanghai，china)的1×ripa裂解缓冲液(cellsignalingtechnology，beverly，ma，usa)裂解。然后，将细胞裂解物在4℃以12000rpm离心10分钟，取上清液，转移至1.5ml管中，并使用quickstarttmbradford1×dyereagent(bio-rad，hercules，ca，usa)定量蛋白质浓度。将每种样品的30μg蛋白质加载到sds-page上，80v，30分钟，调整电压为120v，电泳分离60分钟。电泳完成后，将蛋白质转移到膜上(millipore，darmstadt，germany)，然后在室温下用10％脱脂奶粉封闭1小时。封闭完成后得到膜状样品，膜与第一抗体在4℃培育过夜，然后在室温下与hrp偶联的第二抗体培育1小时。使用ultrasignal^tmecl蛋白质印迹检测试剂(4abiotechco.，ltd，beijing，china)成像，并通过chemidocmp成像系统(bio-rad)检测。使用imagej软件(imagej1.46r；nationalinstitutesofhealth，bethesda，md，usa)定量分析成像条带强度，并计算目的蛋白与β-actin的比值。

九、检测突变亨廷顿蛋白和包涵体

如前所述，使用exfecttransfectionreagent(vazymebiotechco.，ltd，nanjing，china)，将egfp-htt74质粒转染ht22或mef细胞12小时。然后，用指定的药物(es，ea，eb，ie)处理细胞24小时。处理完成后，收集细胞用针对gfp的抗体进行免疫印迹检测htt水平。同时，还使用流式细胞术检测gfp信号来量化gfp。对于细胞质亨廷顿包合物形成的荧光显微镜分析，在olympus荧光显微镜下观察在盖玻片上生长的细胞。通过计算egfp包含物对egfp阳性细胞总数的细胞数量来定量具有egfp-htt74包含物的细胞百分比。在3个随机选择的区域选择至少300个gfp阳性细胞进行评分。

十、数据统计分析

使用graphpadprism5软件(graphpadsoftware，inc.，lajolla，ca，usa)通过单向单变量方差分析(anova)分析组间的统计学显著性。*p<0.05；**p<0.01，***p<0.001被认为是显着的。

实验结果

1、七叶皂苷类化合物(es、ea、eb和iea)成分鉴定

从七叶树(acb)的种子中(图1a)，分离出本发明研究中使用的总皂苷和单一化合物。用甲醇溶液超声提取七叶树种子，得到总皂苷提取物，然后用uhplc-qtof-ms/ms分析acb的总提取物。如图1b所示，总离子色谱图(tic)和uv色谱图显示acb中的皂苷如ea，eb，iea和isoescinib(ieb)出峰时间在9-11分钟之间。然后，将acb总提取物中的皂苷分离，使用大孔树脂柱层析法和结晶法进行纯化。

uhplc-qtof-ms/ms分析后，图1b显示皂苷，如ea、eb、iea和ieb，在acb中占很高比例。然后，进一步分离纯化其中的单一皂苷，成功分离得到三种化合物，包括ea、eb和iea，它们的响应tic和uv显示如图1c、图1d和图1e所示。通过化合物的hr-esi-msm/z值在1129.5367[m-h]^-，1129.5351[m-h]^-和负模式下的1129.5354测试结果，确定化合物的分子式为c55h86o24。化合物的¹hnmr(cdcl3,600mhz)和¹³cnmr(cdcl3,150mhz)核磁共振图谱显示如图1c、图1d和图1e中最下层图所示，nmr数据与文献中报道的化合物一致。因此，所得化合物分别命名为ea、eb和iea，它们的结构分别如图1c、图1d和图1e中右侧结构式所示。

2、ht22细胞中七叶皂苷类化合物es、ea、eb和iea的安全浓度

在研究七叶皂苷类化合物的mhtt降解作用之前，通过cck-8测定法测量ht22细胞中es、ea、eb和iea的安全浓度。如图2a和图2b所示，ht22细胞分别用1.56-200μg/mles和1.25-80μmea、eb和iea处理24小时。七叶皂苷es、ea、eb和iea对ht22细胞的ic50值分别为47.36μg/ml、46.60μm、23.72μm和43.49μm。此外，对于ea，eb和iea，针对ht22细胞进行48小时处理的ic50值分别为42.49μm，19.47μm和69.17μm(图2c)。此外，使用annexinv-fitc/pi凋亡检测试剂盒，测定不同浓度的es、ea、eb和iea处理后ht22细胞的细胞活力。如图2d和统计图2e所示，没有观察到明显的细胞毒性。试验结果表明es、ea、eb和iea的安全浓度分别低于40μg/ml、20μm、10μm和40μm。

3、七叶皂苷类化合物ea、eb和iea降低ht22细胞中htt74的表达

亨廷顿病(hd)是一种常染色体显性遗传性神经退行性疾病，主要是由于4号染色体上亨廷顿基因cag三核苷酸重复序列的过度扩增，导致htt蛋白n端附近聚谷氨酰胺的异常积累。此外，神经元中mhtt聚集体累积是亨廷顿症的病理标志物。mhtt可以形成核周细胞质聚集体和核内包涵体，进而导致神经元死亡。因此，将egfp-htt74质粒瞬时转染到ht22细胞中以建立亨廷顿症(hd)细胞模型，并评估es、ea、eb和iea对egpf-htt74的降解作用。如图3a所示，40μg/mles、20μmea、10μmeb和40μmiea可显着抑制egfp-htt74的蛋白表达水平。然后，试验研究了es、ea、eb和iea的抑制作用的浓度依赖效应，图3b、图3c、图3d和图3e分别显示梯度浓度es、ea、eb和iea可显着降解htt74。其中，在相同浓度条件下，eb表现出最强的降解作用。此外，流式细胞仪结果显示，ea、eb和iea可以降低ht22细胞中egfp-htt74过表达的gfp阳性细胞百分比。最后，通过使用免疫荧光显微镜观察ht22细胞中的细胞质egfp-htt74荧光包涵体，图3g显示ea、eb和iea可显着降低ht22细胞中egfp-htt74含量。总之，试验结果表明七叶树皂苷，如ea、eb和iea，是七叶树种子中促进突变疾病蛋白质降解的主要生物活性成分。

4、七叶皂苷类化合物ea、eb和iea诱导ht22细胞自噬

越来越多的证据表明，细胞自噬在降低与hd相关的mhtt水平中起重要作用。因此，本发明研究了es、ea、eb和iea对于ht22细胞的自噬诱导作用。lc3作为特异性标记蛋白在调节自噬中起重要作用，自噬基质p62可作为自噬活性的报告基因。在自噬诱导下，细胞内lc3i主要转化为lc3ii，并在自噬体膜上积累。可以观察到增强的绿色荧光蛋白微管相关蛋白轻链3(egfp-lc3)在细胞质中均匀分散的斑点形成，并且p62的蛋白质水平被下调。因此，在本发明研究中，主要通过观察gfp-lc3斑点形成、lc3ii转化和p62的蛋白质表达来监测自噬。通过将pegfp-lc3质粒瞬时转染到ht22细胞中，图4a显示es可以剂量依赖性地改善gfp-lc3斑点形成。western蛋白印迹分析显示，lc3ii的蛋白质表达随剂量增大而增加，而p62表达相应地降低(图4b)。因为ea、eb和iea是es中的主要成分，因此还研究了它们在ht22细胞中自噬的激活作用。如图4c所示，ea，eb和iea还可显着增加瞬时转染的pegfp-lc3质粒ht22细胞中gfp-lc3斑点的形成。与荧光显微镜结果一致，与对照组相比，ea、eb和iea还以剂量相关方式显着增加lc3ii的蛋白质表达，并降低p62的蛋白质水平(图4d、图4e、图4f)。因此，这些结果表明ea、eb和iea是七叶树种子中的生物活性化合物，具有诱导ht22细胞中的自噬作用。

5、eb通过mtor和erk信号通路诱导细胞自噬

mtor(雷帕霉素的哺乳动物靶标)激酶在细胞生长和增殖中起关键作用。作为中枢调节因子的mtor在细胞条件下受到抑制，在诸如饥饿、生长因子剥夺和应激条件下，mtor自噬作用被激活。mtor受ampk的负调节，并受pi3k/akt通路的正调节。mtor的下游，如ulk1被激活，p70s6k被抑制。在本发明中，由于ea、eb和iea具有相似的结构，因此选择在自噬诱导和mhtt降解中具有强效作用的eb用于进一步研究ht22细胞中自噬诱导的调节机制。如图5a所示，eb可以显着抑制pi3k/akt途径并增加ampk的活性，然后抑制mtor的活性。相应地，下游蛋白质如ulk1，p70s6k被抑制。因此，mtor在eb诱导的ht22细胞自噬中起重要作用。除了经典的mtor信号通路，细胞外信号调节激酶(erk1/2)信号通路促进细胞增殖以响应生长因子，也可以上调自噬和溶酶体基因的表达。因此，我们还研究了在ht22细胞中eb诱导的自噬中mem/erk途径的调节。如图5b所示，eb可显着增加raf、mek和erk的磷酸化，表明eb可激活raf/mek/erk信号传导通路。

为了进一步证明上述由eb调节的信号通路是否与ht22细胞中的自噬激活相关，ampk和erk、sch和cc的特异性抑制剂，以及分别抑制起始的3-ma和baf的特异性自噬抑制剂被应用于本发明的试验研究中。如图6a所示，sch、cc和3-ma显著降低了由eb所致gfp-lc3斑点形成的细胞的百分比增加比例。而baf可以通过影响溶酶体的功能和损害自噬通量，来进一步增加具有gfp-lc3斑点形成的细胞的百分比(图6a)。因此，通过使用蛋白质印迹法检测lc3ⅱ蛋白质表达，图6b、图6c和图6d显示sch、cc和3-ma可显着降低eb增加的lc3ii表达，而baf增加lc3ii表达。总之，结果表明七叶树中的天然植物皂苷化合物ea、eb、iea等具有相似的结构，且具有相似通过mtor和erk信号传导通路诱导ht22细胞自噬的作用。

6、eb通过mtor和erk信号通路调节自噬作用增强mhtt的清除

在本发明中，为了进一步证明ea、eb和iea诱导的自噬作用，与瞬时转染egfp-htt74质粒的ht22细胞中mhtt抑制作用的密切联系，使用自噬抑制剂，如3-ma和baf，erk和ampk抑制剂(包括sch和cc)进行试验研究。如图7a中的荧光图像所示，3ma、baf、sch和cc可显著抑制eb对egfp-htt74包含物的降解作用。另外，蛋白质印迹结果显示cc(图7b)，3-ma(图7c)和baf(图7d)可以逆转已经被eb抑制的代表mhtt的gfp的蛋白质表达水平。因此，上述结果表明，七叶树种子中具有相似结构的ea、eb、iea等通过erk和mtor信号传导通路调节自噬作用降低mhtt蛋白表达水平。

7、eb通过atg7调节增强mhtt的清除率

自噬相关基因(atgs)包括atg5和atg7被认为是自噬诱导必需的关键分子。atg7作为e1样酶是atg12与atg5的结合所必需的，并且磷脂酰乙醇胺(pe)与lc3-i的缀合由atg3和atg5-atg12复合物的作用介导。然后，lc3-i从细胞质转移到分离膜并变成膜结合的lc3-ii，其被认为是自噬诱导的可靠标记。因此，为了进一步证实eb通过atg7依赖性自噬增强mhtt的清除，使用野生型(mefatg7^+/+)和atg7缺陷型mef细胞(mefatg7^-/-)作为研究样本。首先，研究使用ea、eb和iea处理后mef细胞的自噬激活作用。如图8a所示，ea、eb和iea可以显著促进mefatg7^+/+细胞中的gfp-lc3斑点形成，但不能促进mefatg7^-/-细胞中的gfp-lc3斑点形成。此外，westernblotting结果显示，es、ea、eb和iea可以剂量依赖性地增加lc3ii的蛋白表达水平，相应地降低mefatg7^+/+细胞中mhtt的蛋白表达水平，而不能改变用gfp-htt74瞬时转染mefatg7^-/-细胞中的蛋白水平(图9a-9d)。如荧光显微结果所示(图9e)，ea、eb和iea可以降低mefatg7^+/+细胞中egfp-htt74包涵体的形成，但mefatg7^-/-细胞没有显着降低。总之，这些结果表明atg7作为激活自噬作用的关键分子是eb促进mhtt自噬降解作用所必需的。

8、ea、eb和iea降低ht22细胞中mhtt的细胞毒性作用

细胞内积累的mhtt在神经元细胞中具有毒性作用。除了ht22细胞中mhtt的降解研究外，本发明还进一步研究了ea、eb和iea对ht22细胞中mhtt细胞毒性的降低作用。通过在ht22细胞中过表达egfp-htt74，并随后进行药物处理，然后收集细胞并用pe溶液染色，流式细胞术分析。如图10a所示，egfp-htt74过表达的ht22细胞中pe信号增加，通过ea、eb和iea的处理可以降低相应的pe信号；表明ea、eb和iea可以恢复ht22细胞活力。大量证据表明，mhtt通过改善氧化应激诱导细胞毒性，并导致细胞凋亡信号通路的激活，包括bax和bcl2，在调节线粒体介导的细胞凋亡途径中发挥着重要作用。作为凋亡信号通路下游的caspase-3和caspase-9是蛋白水解酶，其作为促进细胞凋亡的关键蛋白起作用。本发明研究了，在ea、eb和iea作用下，细胞凋亡相关蛋白中的表达水平。如图10b所示，与正常细胞相比，egfp-htt74过表达的ht22细胞中bax/bcl-2，caspase3和caspase9的蛋白质水平增加，并且通过ea、eb和iea处理可以降低这些蛋白质表达水平。因此，ea、eb和iea通过抑制mhtt诱导的细胞凋亡来降低mhtt对ht22细胞的细胞毒性。

讨论

沉积在大脑特定区域的聚集蛋白被认为是神经退行性疾病的常见病理特征，包括阿尔茨海默病(ad)，帕金森病(pd)和亨廷顿病(hd)。对于hd，有研究表明死后hd脑样品和转基因hd小鼠模型中存在具有增加的polyq的mhtt，并且mhtt累积对神经元表现出强烈的细胞毒性，并加速脑组织的变性。因此，降解mhtt的核周细胞聚集体和细胞内包涵体成为最具潜力的治疗hd策略。众所周知，自噬介导的溶酶体降解和遍在蛋白-蛋白酶体系统是通过降解受损细胞器，大分子和错误折叠的蛋白质(例如aβ，tau，α-突触核蛋白和mhtt)来维持细胞稳态的两种主要途径。据报道，自噬作用在转基因敲入小鼠中被激活，该小鼠表现人工修饰突变所致的缺乏多聚谷氨酰胺重复的亨廷顿症，并且关键自噬基因的表达增加减缓了神经元损伤的年龄依赖性累积损伤，并延长了黑腹果蝇的寿命。自噬增强子-67(enhancer-67)可降低hd果蝇大脑中(128q)hhtt蛋白表达水平。此外，tqb在hdq^175/q7小鼠纹状体中，tfeb的表达可以增加自噬作用和溶酶体的活性，进而降解mhtt。因此，自噬诱导在降解mhtt中起重要作用。在本发明中，我们研究了体外es、ea、eb和iea的自噬诱导的降解作用。初步mhtt检测显示，4种成分可显着降低gfp-htt74过表达的ht22细胞中gfp-htt74和p62的蛋白质水平，尽管lc3被激活。在随后试验中，证实了eb对细胞凋亡的明显抑制作用。这些结果进一步表明，通过自噬降解聚集的蛋白质的药物具有神经细胞保护潜力。

目前，许多有症状缓解药物处方都是为hd患者开的，但这些处方药只能降低多巴胺积累或中断大脑中的多巴胺能受体来缓解症状。以丁苯那嗪为例，其通过抑制中枢神经系统(cns)中的囊泡单胺转运蛋白2(vmat-2)发挥作用，并可防止血清素、多巴胺和去甲肾上腺素从细胞质进入突触前囊泡。然而，多巴胺、去甲肾上腺素和血清素的减少会加重了抑郁和焦虑。传统中草药具有多种成分、多靶点和多功效的特点，副作用少。到目前为止，已经证实有许多中草药对高亨廷顿症细胞模型和动物模型有治疗效果。天麻(gastrodiaelata)，通过线粒体的形态控制减弱突变亨廷顿蛋白诱导的蛋白质聚集。另外，远志(radixpolygalae)和洋常春藤(hederahelix)中的天然皂苷和莲子心(nelumbonucifera)中的莲心碱(neferine)通过mtor-ampk依赖通路诱导自噬，来减弱mhtt在pc-12细胞中的蛋白质离去和细胞毒性。然而，没有任何对mhtt具有降解作用的自噬增强剂被开发成临床中使用的新药，并且进一步鉴定降解mhtt的自噬诱导剂是必需的。在本发明中，研究发现了es(从七叶树种子种分离的总三萜皂苷)具有诱导自噬并降解mhtt的功效。

mtor作为经典信号通路在自噬调节中起重要作用。包括pi3k/akt和ampk的上游化合物可以正向和负向介导mtor的活性。在本发明中，从es种分离得到的ea、eb和iea可以抑制pi3k/akt并激活ampk，然后抑制mtor的活性，其下调p70s6k、ulk表达水平。除mtor信号通路外，本发明还研究了erk信号通路，发现ea、eb和iea可激活erk信号通路。此外，sch和cc(ampk和erk的特异性抑制剂)可以显著抑制lc3ii和gfp-lc3斑点形成的表达。此外，atg7是一种自噬相关基因，在自噬诱导和神经退行性疾病的进展中发挥着关键作用。在本发明研究中，通过使用野生型和atg7缺陷型mef细胞，证实了es、ea、eb和iea在ht22细胞中的自噬作用是atg7依赖性的。总之，七叶树种子中的天然皂苷(包括ea、eb和iea)可以通过mtor和erk信号传导通路激活atg7依赖的细胞自噬作用。

从娑罗子(semenaesculi)中提取的总皂苷es具有抗炎、抗水肿活性、抗癌、高血糖，抗肥胖和抗溃疡作用。此外，es还可以通过减弱线粒体功能障碍、氧化应激和细胞凋亡来减轻慢性mptp/p诱导的多巴胺能毒性。然而，es中的生物活性成分，及其对于pd和hd细胞模型中的作用机理和分子机制尚不明确。在本发明中，通过分离和鉴定，在es中分离并确认了ea、eb和iea。通过在ht22细胞中过表达egfp-htt74，es中的这些皂苷可降解mhtt并降低其对ht22细胞的细胞毒性。进一步的研究表明，降解效应与其诱导的自噬密切相关。除mhtt外，本发明还研究了a53t-α-突触核蛋白(pd中常见的突变体聚集蛋白)的降解作用。如图11所示，ea、eb和iea可以降低瞬时转染的egfp-a53t-α-突触核蛋白ht22细胞中具有gfp信号的细胞百分比。总之，七叶树种子中的天然皂苷通过自噬作用加速错误折叠的蛋白质如mhtt和a53t-α-突触核蛋白的清除速度，而产生神经保护作用。因此，本研究的发现首先确定了七叶树具有细胞自噬增强子作用，及其错误折叠蛋白的清除作用，表明七叶树中的天然皂苷(包括ea、eb和iea)对于体内进一步研究具有重要价值，并具有发展成神经退行性疾病的新药的潜力，如hd和pd治疗药物。

结论

总之，这是第一次证明七叶树种子中的七叶皂苷(包括ea、eb、iea等)具有增强瞬时转染的egfp-htt74和egfp-a53tα-突触核蛋白ht22细胞中mhtt和a53tα-突触核蛋白的清除速率的作用。这些皂苷可以激发ht22细胞中有效自噬作用。其中，与其他皂苷具有相似结构的eb通过mtor和erk信号传导通路激活自噬作用，并且该信号传导通路依赖于atg7基因。此外，mhtt的降解作用被证明与ht22细胞中这些皂苷的自噬诱导作用密切相关。另外，ea、eb和iea可以抑制mhtt诱导的ht22细胞凋亡。总之，七叶树中的天然皂苷可以通过诱导自噬促进mhtt的降解，并抑制其(mhtt)诱导的ht22细胞凋亡。因此，本发明研究发现，提供了七叶树中天然组分的新药理学作用，并具有进一步体内实验研究和开发成为新型神经变性疾病候选药物的潜力，如hd和pd治疗药物。