本发明涉及化合物的新的制药用途，具体来说，涉及金线莲苷或其药学上可接受的盐在制备清除脑部β淀粉样蛋白斑块的药物中的用途。
背景技术：
阿尔茨海默病(alzheimer’sdisease，ad)俗称老年性痴呆，是一种以进行性神经退行疾病，主要以认知功能减退，短期记忆下降，直至逐渐丧失自理能力为主要临床症状。据人口统计学的预测，到2050年，全世界的阿尔茨海默病患者数将超过1亿，全球经济负担预计达到9万亿美元。然而，由于阿尔茨海默病病情的复杂性，其发病机制尚不明确，临床上尚无有效的治疗方法。因此，研发有效防治阿尔茨海默病的药物仍然是当前亟待解决的难题。
小胶质细胞是一类大脑中驻留的免疫细胞，来源于胚胎时期的卵黄囊，其功能和大脑发育、微环境维持、损伤修复等息息相关。许多研究表明，小胶质细胞在阿尔茨海默病（ad）的发生发展中发挥着重要作用。在ad的起始阶段，小胶质细胞能通过吞噬作用降低β淀粉样蛋白（aβ）水平，抑制ad的病理进程。但随着ad的发展，小胶质细胞功能紊乱，吞噬清除能力下降，导致aβ不能被及时有效清除，造成aβ累积，进而加剧ad的病理进程。
实际上，小胶质细胞在发挥吞噬和清除aβ过程中需要大量的能量（atp）。许多研究表明，能量代谢紊乱与ad的病理进程密切相关。在小胶质细胞吞噬aβ过程中，为了响应细胞对于能量的需求，细胞会通过增强糖酵解途径来快速获取能量，而相应地会抑制线粒体氧化磷酸化（oxphos）水平。在ad模型小鼠和ad病人的脑片中也发现，小胶质细胞（尤其是aβ斑块周围的小胶质细胞）的hif1-
目前临床研究中，许多针对aβ的抗体药物的研制正在如火如荼地进行中。然而，这些药物难以兼顾aβ斑块的清除和抑制神经炎症，神经炎症反应强烈，且效果不佳。
金线莲苷是从兰科开唇兰属植物金线莲中提取得到的化学成分，药理研究表明其具有降血糖、降血脂、保肝护肝、改善骨质疏松等作用，但未见其对β淀粉样蛋白具有任何作用的报道。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供金线莲苷或其药学上可接受的盐的新的制药用途。金线莲苷或其药学上可接受的盐能够用于制备清除脑部β淀粉样蛋白斑块的药物，且能够有效抑制神经炎症，因而可用于防治脑部β淀粉样蛋白斑块所致的相关疾病。
一方面，本发明提供金线莲苷或其药学上可接受的盐在制备清除脑部β淀粉样蛋白斑块的药物中的用途。
根据本发明的用途，优选地，所述药物为改善阿尔茨海默病患者学习认知功能的药物。
根据本发明的用途，优选地，所述药物能够抑制神经炎症。具体地，本发明提供金线莲苷或其药学上可接受的盐在制备清除脑部β淀粉样蛋白斑块且抑制神经炎症的药物中的用途。
另一方面，本发明提供金线莲苷或其药学上可接受的盐在制备防治阿尔茨海默病的药物中的用途。
根据本发明的用途，优选地，所述药物能够抑制神经炎症。具体地，本发明提供金线莲苷或其药学上可接受的盐在制备防治阿尔茨海默病且抑制神经炎症的药物中的用途。
根据本发明的用途，优选地，所述药物为改善阿尔茨海默病患者学习认知功能的药物。
根据本发明的用途，优选地，所述药物含有：
a.金线莲苷或其药学上可接受的盐，和
b.药学上可接受的辅料。
根据本发明的用途，优选地，所述药物以所述金线莲苷或其药学上可接受的盐作为唯一药学活性成分。
根据本发明的用途，优选地，所述药物除了含有金线莲苷或其药学上可接受的盐，还含有其他用于治疗阿尔茨海默病的药学活性成分。
根据本发明的用途，优选地，所述药物的剂型为口服剂型。
本发明的金线莲苷或其药学上可接受的盐能够有效清除脑部β淀粉样蛋白斑块，用于治疗β淀粉样蛋白斑块相关的疾病，如阿尔茨海默病。实验证明，本发明的金线莲苷或其药学上可接受的盐能够有效防治阿尔茨海默病，特别是能够有效改善阿尔茨海默病患者的学习认知功能。另外，与其他用于清除β淀粉样蛋白斑块的药物相比，本发明的金线莲苷或其药学上可接受的盐能够有效抑制神经炎症，具有很好的临床应用前景。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施方式作进一步的说明。
本发明中，金线莲苷的化学结构如式ⅰ所示：
本发明中，金线莲苷的药学上可接受的盐可以为糖苷上的羟基氢被金属离子部分或全部取代后形成的盐。优选地，所述金属离子为钠离子或钾离子。
本发明中，金线莲苷或其药学上可接受的盐能够改善线粒体能量代谢，增强小胶质细胞吞噬清除β淀粉样蛋白斑块的能力。因此，本发明提供金线莲苷或其药学上可接受的盐可以用于制备清除脑部β淀粉样蛋白斑块的药物。进一步地，所述金线莲苷或其药学上可接受的盐用于治疗由于脑部存在β淀粉样蛋白斑块而导致的疾病。
本发明还提供金线莲苷或其药学上可接受的盐用于制备防治阿尔茨海默病的药物的用途。
根据本发明的一个优选的实施方式，本发明的金线莲苷或其药学上可接受的盐可以用于制备改善阿尔茨海默病患者的学习认知功能的药物。
本发明中，所述药物能够有效防治阿尔茨海默病，且能够抑制神经炎症。
本发明中，所述药物含有金线莲苷或其药学上可接受的盐，以及药学上可接受的辅料。
根据本发明的一个实施方式，所述药物以所述金线莲苷或其药学上可接受的盐作为唯一的药学活性成分。
根据本发明的另一个实施方式，所述药物除了含有金线莲苷或其药学上可接受的盐，还含有其他用于治疗阿尔茨海默病的药学活性成分。
本发明中，所述药物剂型不限，例如可以为口服剂型或注射剂型，并优选为口服剂型，如片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂等。
β淀粉样蛋白（aβ）在细胞基质沉淀聚积后具有强烈的神经毒性作用，与多种疾病相关。特别是，β淀粉样蛋白与阿尔茨海默病密切相关，通常被认为是阿尔茨海默病的标志性特征。本发明发现，金线莲苷或其药学上可接受的盐能够有效清除脑内β淀粉样蛋白斑块，对于β淀粉样蛋白斑块所致的相关疾病具有防治作用。实验显示，本发明的金线莲苷或其药学上可接受的盐能够有效改善线粒体能量代谢，增强小胶质细胞吞噬清除β淀粉样蛋白斑块的能力。与其他用于清除β淀粉样蛋白斑块的药物（如bace1抑制剂、β-分泌酶抑制剂、γ-分泌酶抑制剂等）相比，金线莲苷或其药学上可接受的盐能够有效抑制神经炎症，因而用于临床治疗阿尔茨海默病的前景非常好。另外，通过对阿尔茨海默病动物模型进行学习认知功能实验发现，金线莲苷或其药学上可接受的盐能够有效改善其学习认知功能，对阿尔茨海默病防治作用确切。
以下通过具体实施例对本发明做进一步说明。
实施例1金线莲苷改善小胶质细胞线粒体能量代谢实验
小胶质细胞老化的一个重要标志是细胞有氧呼吸减少，导致atp生成降低和吞噬清除能力下降。
通过seahorsexfmitostresstestkit（安捷伦科技公司）检测金线莲苷处理后细胞的基础耗氧能力（ocr）。具体步骤为：①先将bv2小胶质细胞接种至xf96孔细胞培养板（5000个/孔），平均分成两组，每组6个孔；②12h时向两组细胞中分别加入溶剂对照dmso和金线莲苷溶液（终浓度为20μm），分别作为对照组和金线莲苷组，每个处理6个复孔，继续培养24h；③弃去培养基，并用pbs洗两遍，然后加入xf培养基，用xfe96extracellularfluxanalyzer（安捷伦科技公司）检测细胞基础耗氧能力（ocr），连续记录5min，取平均值进行结果分析。
通过celltiterglo试剂盒（普洛麦格生物科技有限公司）检测金线莲苷处理后细胞的atp含量。具体步骤为：①将bv2小胶质细胞接种至xf96孔细胞培养板（5000个/孔），平均分成两组；②12h后向两组细胞中分别加入溶剂对照dmso和金线莲苷溶液（终浓度为20μm），分别作为对照组和金线莲苷组，每个处理4个复孔，继续培养24h；③24h时，弃去培养基，加入100μlcelltiterglo试剂盒（普洛麦格生物科技有限公司）中的检测液，室温避光反应15min；④每个孔取50μl反应液至96孔白板中，用酶标仪检测自发荧光强度，即atp的浓度。
如表1所示，与对照组相比较，金线莲苷处理过的细胞基础耗氧能力极显著增加，金线莲苷处理后细胞内atp的含量极显著高于对照组。
表1两组小胶质细胞atp生成和细胞耗氧量比较（x̅±sd）
注：**表示与对照组相比，差异极显著（p<0.01）。
实施例2金线莲苷抑制小胶质细胞炎症实验
采用脂多糖（lps）刺激小胶质细胞诱导m1型炎症反应，作为小胶质细胞炎症模型。
将bv2小胶质细胞接种在12孔细胞培养板内，10万个细胞/孔，12h后用终浓度为20μm的金线莲苷（储液摩尔浓度为80mm）先预处理1h，另取不用金线莲苷预处理的细胞作为对照组，然后加入lps（终浓度为1μg/ml）分别处理12h和24h，再用trizol试剂裂解细胞，提取rna。提取rna之后，每个样品取1μg总rna，用反转录酶以随机引物进行反转录，得到cdna。将所述cdna通过实时荧光定量pcr检测内参基因β-actin和m1型炎症因子il-6、tnf-α和inos的表达，通过2-△△ct法计算表达量。
结果如表2、表3和表4所示，其中，各组数据以未经lps刺激的对照组的数值的倍数来表示。与相应的lps刺激的对照组相比，金线莲苷加lps处理组（即金线莲苷组）的il-6、tnf-α和inos的表达均极显著下降。
表2金线莲苷抑制炎症因子il6表达
注：**表示与对照组相比，差异极显著（p<0.01）。
表3金线莲苷抑制炎症因子tnf-α表达
注：**表示与对照组相比，差异极显著（p<0.01）。
表4金线莲苷抑制炎症因子inos表达
注：**表示与对照组相比，差异极显著（p<0.01）。
实施例3-金线莲苷增强小胶质细胞吞噬淀粉样蛋白实验
采用原代小胶质细胞吞噬清除寡聚化淀粉样蛋白aβ1-42（ad标志物）作为模型。
将原代小胶质细胞接种于放置有细胞爬片的24孔板内，12h后用终浓度为20μm的金线莲苷（储液摩尔浓度为80mm）预处理1h，另取未用金线莲苷预处理的细胞作为对照组，然后加入fitc标记的淀粉样蛋白aβ1-42寡聚物，反应6h后用预冷pbs缓冲液清洗细胞3遍，除去未被吞噬的淀粉样蛋白，然后用4%甲醛溶液固定细胞，然后通过免疫荧光染色标记小胶质细胞。
免疫荧光染色步骤为：①500μl0.5%tritonx-100室温孵育20min透膜；②pbs洗3遍，2min/遍；③500μl5%胎牛血清室温封闭1h；④兔抗小胶质细胞分子标记iba1抗体1:400稀释，然后加到细胞爬片上，4度孵育过夜；⑤用pbs洗细胞5遍，2min/遍；⑥将tritc标记的山羊抗兔二抗1:400稀释，然后加到细胞爬片上，室温孵育1h；⑦用pbs洗细胞3遍，2min/遍；⑧将细胞核染料dapi以1:1000稀释，然后加到细胞爬片上，室温孵育10min；⑨用pbs洗细胞3遍，2min/遍；⑩滴加20μl抗荧光淬灭封片剂到载玻片上，然后将细胞爬片用镊子小心取出，倒扣在载玻片上，用高亮指甲油封片。完成后用激光共聚焦显微镜进行观察和图像采集，用imagej进行图像分析。
如表5所示，采用金线莲苷预处理小胶质细胞后，细胞中fitc标记的淀粉样蛋白aβ1-42寡聚物极显著高于对照组，表明金线莲苷可以促进小胶质细胞吞噬淀粉样蛋白aβ1-42寡聚物。
表5两组小胶质细胞吞噬aβ能力比较（x̅±sd）
注：**表示与对照组相比，差异极显著（p<0.01）。
实施例4-小鼠模型验证金线莲苷对ad的防治作用实验
采用morris水迷宫试验法，取5xfad转基因小鼠（ad模型小鼠）30只，随机分为3组，每组10只。在小鼠4月龄通过灌胃给予金线莲苷，连续给药1个月，给药剂量分别为0、20mg/ml和50mg/ml。连续给药一个月后通过水迷宫实验检测小鼠的空间学习记忆能力，模拟金线莲苷对ad的治疗作用。
morris水迷宫试验主要步骤如下：
①水迷宫由一个圆形不锈钢水池构成，其直径为120cm，逃生平台直径为10cm，注入水之后，添加钛白粉使水呈乳白色，并将平台隐藏在水面下1cm(固定在人为划分好的四个象限的其中一个中间)。水池深60cm，其边缘设定四个小鼠入水起始点(东、西、南、北)，并在壁上贴不同形状（三角形、圆形、正方形和梯形）和颜色（红、黄、蓝、黑）的物体给小鼠空间定位提供视觉线索。实验中水温保持在22在壁℃，整个实验过程中平台位置、视觉线索位置等均保持不变。
②实验中，小鼠放入水池后，连接于电脑摄像头开始记录下小鼠在水迷宫中寻找隐藏平台的游泳潜伏期（首次到达平台时间）、路程（运动距离）及路径（运动轨迹）。小鼠每天训练两次，每次1分钟，对于找到平台的小鼠，让其待在平台上30秒后拿出迷宫，休息两个小时后再进行下次训练；对于找不到平台的小鼠，将其引导到平台上，同样在平台上待30秒后拿出，休息两个小时后再进行下次训练。
③根据小鼠的训练情况，连续训练6天并记录每次训练时第一次到达平台的时间，可以统计分析每组小鼠每天首次到达平台的平均时间，以初步评价小鼠的学习认知能力。
④在最后一次训练结束24小时后测试小鼠的学习记忆能力。
测试过程为：将隐藏在水面下的平台取出，让小鼠在迷宫中自由探索1分钟，记录分析小鼠首次到达平台区域的时间、穿越平台所在位置的次数、和在平台所在象限停留时间，并进行统计分析，以评价小数的学习认知能力。首次到达平台时间越少，在平台区域穿梭次数越多，在平台所在象限停留时间越长，则表明小鼠记忆能力越强。
实验结果见表6。表6中，各指标的t1表示金线莲苷组（20mg/kg）与对照组相比的检验值，t2表示金线莲苷组（50mg/kg）与对照组相比的检验值；各指标的p1表示金线莲苷组（20mg/kg）与对照组相比的显著性水平，p2表示金线莲苷组（50mg/kg）与对照组相比的显著性水平。
表6结果显示，金线莲苷组（20mg/kg）和金线莲苷组（50mg/kg）小鼠首次到达平台区域的时间极显著低于对照组，平台区域穿越次数极显著多于对照组，在平台所在象限停留时间极显著长于对照组，且差异均具有统计学意义。因此，金线莲苷可以显著提高阿尔茨海默病模型小鼠的空间学习记忆能力，对阿尔茨海默病有明显的预防和治疗作用。
表624小时后各组小鼠学习记忆能力比较（x̅±sd）
注：**表示与对照组相比，差异极显著（p<0.01）。
本发明并不限于上述实施方式，在不背离本发明的实质内容的情况下，本领域技术人员可以想到的任何变形、改进、替换均落入本发明的范围。