一种从土丁桂中提取总树脂糖苷的方法及其用途与流程

本发明属于医药
技术领域：
，具体涉及总树脂糖苷在土丁桂中的提取技术，以及在制备抗肿瘤药物中的应用技术。
背景技术：
：土丁桂(evolvulusalsinoides)，又名过饥草，为旋花科土丁桂属植物。土丁桂在我国主要分布在广西、广东、福建等地。根据《中华本草》中记载，土丁桂以全草药用，有散瘀止痛，清湿热之功能。该植物在印度、中南半岛、马来亚及菲律宾等国家均有分布，且有药用价值。药理研究表明，土丁桂具有抗肿瘤、抗氧化、抗抑郁、抗痴呆等多种生物活性。目前，土丁桂的成分研究主要集中在生物碱、黄酮、甾体等化学成分，但这些研究并未能有效地解释土丁桂的生物活性。在前期研究中发现，土丁桂中含有大量树脂糖苷类化合物。此类化合物组成通常包括一个寡糖链及一个长链羟基脂肪酸，羟基脂肪酸作为苷元并与寡糖链形成内酯，同时在寡糖链上存在多个小分子有机酸作为取代基。由于糖基种类及连接方式，内酯键位置、取代基种类位置的变化，使树脂糖苷类化合物结构丰富多样。此外，树脂糖苷类化合具有多种显著的生物活性，包括抗肿瘤作用、血管舒张、镇静、抗抑郁及抗菌等，是一类重要的活性物质。自土丁桂中分离的树脂糖苷类化合物存在的形式为两个单体树脂糖苷类化合物，具有细胞毒活性。但土丁桂中尚存在大量的树脂糖苷类化合物，且单体树脂糖苷类化合物分离难度较大。虽然中国专利文献cn106361798a公开了一种树脂糖苷类化合物的提取方法，但是该工艺主要是针对极性较小、可用二氯甲烷溶解的树脂糖苷类成分，并不适用于土丁桂中树脂糖苷类成分的提取分离。经研究还发现土丁桂的总树脂糖苷部位极性较大，且具有显著的抗肿瘤活性。技术实现要素：针对现有技术不足，为了得到相应的土丁桂总树脂糖苷提取物，本发明第一目的是提出一种从土丁桂中提取总树脂糖苷的方法。本发明技术方案包括以下步骤：a)将土丁桂粉碎后，以醇或者醇的水溶液为提取溶剂，经冷浸、渗入、超声或热回流提取，取得提取液，将提取液减压浓缩，取得提取液的浓缩液；b)将提取液的浓缩液以水分散后，依次用乙酸乙酯、正丁醇萃取，取得正丁醇萃取液，经减压回收得到浸膏；c)将浸膏以硅胶进行柱色谱分离，采用氯仿和甲醇的混合液或者二氯甲烷和甲醇的混合液洗脱，收集洗脱液，浓缩至浸膏状，得到洗脱液浸膏；d)将洗脱液浸膏采用凝胶吸附树脂柱分离，以甲醇洗脱，收集洗脱的液相，即为土丁桂总树脂糖苷提取物。本发明建立了土丁桂中总树脂糖苷类成分的提取富集方法，该方法操作简单、条件温和、成本较低。研究发现，土丁桂总树脂糖苷部位具有显著的抗肿瘤活性，可用于制备抗肿瘤药物。本发明所提供的土丁桂总树脂糖苷提取物是从中药土丁桂中提取的，土丁桂是旋花科土丁桂属植物土丁桂的全草。上述方法中，所述步骤a)中，醇为乙醇或甲醇。乙醇与甲醇极性较大，能更充分地提取土丁桂中大极性的树脂糖苷类成分。此外，乙醇与甲醇价格低廉，利于工业化生产。所述步骤c)中，所述氯仿和甲醇的混合液中氯仿与甲醇的混合体积比为2～10∶1。更优选的氯仿与甲醇的混合体积比为2∶1。由于土丁桂中树脂糖苷类成分极性较大，因此采用大极性的混合溶剂能使树脂糖苷类成分富集地更为充分。所述步骤c)中，所述二氯甲烷和甲醇的混合液中二氯甲烷与甲醇的混合体积比为2～10∶1。更优选的二氯甲烷与甲醇的混合体积比为2∶1。由于土丁桂中树脂糖苷类成分极性较大，因此采用大极性的混合溶剂能使树脂糖苷类成分富集地更为充分。本发明还提供以上总树脂糖苷的用途。即，本发明以上方法制备得到的总树脂糖苷用于制备抗肿瘤药物。由于土丁桂总树脂糖苷部位具有显著的抗肿瘤活性，因此，本发明还提出从土丁桂中提取得到的土丁桂总树脂糖苷提取物可用于制备抗肿瘤药物。附图说明图1为发明方法取得的总树脂糖苷提取物的1h核磁共振图谱。具体实施方式下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为市售。一、制备土丁桂总树脂糖苷提取物。1.取干燥的土丁桂全草100g，粉碎后，采用300ml的95％(v/v)乙醇水溶液冷浸、渗入，经超声或热回流提取3小时，过滤后，分别取得提取液和药渣。以上乙醇也可以采用甲醇。将药渣再经300ml的95％(v/v)乙醇水溶液冷浸、渗入，经超声或热回流提取3小时，再过滤后，分别取得提取液和药渣。合并两次提取液，真空浓缩至无醇味，取得提取液的浓缩液。2.采用500ml水分散提取液的浓缩液，用500ml乙酸乙酯萃取3次后，再用500ml正丁醇萃取3次，回收萃取剂，得取得正丁醇萃取液，经减压回收得到浸膏。3.将浸膏采用硅胶进行柱色谱分离，依次用混合体积为10:1、5:1和2:1的二氯甲烷和甲醇的混合液，或者氯仿和甲醇的混合液作为洗脱剂。收集二氯甲烷和甲醇的混合体积比为2:1取得的洗脱液，浓缩至浸膏状，得到洗脱液浸膏，备用。4.将洗脱液浸膏采用凝胶吸附树脂柱进行分离，用甲醇进行洗脱，合并收集洗脱的液相，经减压浓缩干燥，即得0.378g土丁桂总树脂糖苷提取物。5.将土丁桂总树脂糖苷提取物进行1h核磁共振图谱分析：如图1所示，1hnmr谱图中，信号主要集中3.4-6.5之间的糖残基信号段、0.6-2.2的脂肪链残基信号段以及2.5-3.0之间的内酯环的亚甲基信号段，符合树脂糖苷类成分的信号分布，说明该提取物中主要成分为树脂糖苷类成分。二、树脂糖苷类化合物的定性试验一。1.试验对象：以上实施例所得的产物。2.试验方法：对以上实施例所得的产物进行糖苷类、黄酮类化合物、生物碱及蒽醌类化合物的检测试验。2.1.糖苷类检识反应：在以上实施例所得的产物中加入molish试剂。2.2.黄酮检识反应：在以上实施例所得的产物的甲醇溶液中加入少量镁粉，并滴加几滴浓盐酸。2.3.生物碱检识反应：在以上实施例所得的产物中加入碘化铋钾试剂。2.4.蒽醌检识反应：在以上实施例所得的产物中加入醋酸镁甲醇溶液。3.试验结果：3.1.糖苷类检识反应：molish反应，阴性对照液无紫红色环，葡萄糖阳性对照液反应出现紫红色环，以上实施例所得的产物反应出现紫红色环。证明产物中含有糖苷化合物。3.2.黄酮检识反应：盐酸－镁粉反应，芦丁阳性对照液反应呈现红色，阴性对照液无红色，以上实施例所得的产物溶液反应也无红色产生。证明以上实施例所得的产物不含有黄酮类化合物。3.3.生物碱检识反应：碘化铋钾反应，阴性对照液无沉淀，盐酸小檗碱作为阳性对照液反应出现棕黄色沉淀，以上实施例所得的产物反应也无沉淀产生。证明以上实施例所得的产物不含有生物碱类化合物。3.4.蒽醌检识反应：醋酸镁反应，阴性对照液无橙红色，大黄素阳性对照液反应呈现橙红色，以上实施例所得的产物反应也无橙红色产生。证明以上实施例所得的产物不含有蒽醌类化合物。根据以上定性分析，本发明提供的工艺方法提纯的产物中含有树脂糖苷类化合物，并且不含有其性质相似的黄酮类、生物碱及蒽醌类化合物，说明本发明提纯的产物为树脂糖苷类化合物，而且纯度较高。三、抗肿瘤活性测试。利用mtt法测定土丁桂总树脂糖苷提取物对人肿瘤细胞的细胞毒活性。取实施例1所得土丁桂总树脂糖苷提取物适量，dmso溶解后，利用mtt法分别测定对人非小细胞肺癌a549细胞，人肝癌bel-7402细胞，人宫颈癌hela细胞和人乳腺癌mcf-7细胞的抑制率。实验方法：将状态良好的a549，bel-7402，hela和mcf-7细胞接种于96孔板，每孔90μl培养基，37℃培养12h后，加入不同浓度的待测化合物(1.5625-50μg/ml)，每个浓度设3个平行孔。孵育48h后，每孔加入mtt20μl(5mg/ml)，继续孵育4h，之后弃掉培养基，每孔加入dmso150μl，将结晶充分震荡摇匀后，利用酶标仪测定570nm下的吸光度，实验重复三次取平均值，计算不同浓度下的抑制率及ic50值。实验重复三次取平均值。结果见下表。细胞类型ic50(μg/ml)a5495.40bel-740212.79hela13.66mcf-715.93通过上表可看见：采用本发明方法取得的土丁桂总树脂糖苷提取物对多种肿瘤细胞均具有较好的抑制作用，因此，本发明方法制得的总树脂糖苷可以用于制备抗肿瘤药物。四、对比试验：采用中国专利cn106361798a公开的《一种树脂糖苷类化合物的提取方法》对土丁桂药材进行处理。具体步骤如下：1、取土丁桂100g，粉碎后，粉碎至20目，得粗粉，用氯仿-水混合液加热回流提取，氯仿-水混合液的用量与粗粉的料液比为4ml:1g，加热回流提取2次，每次3小时，过滤，将提取液减压浓缩，冷冻干燥得到粗品a。2、将粗品a加入甲醇完全溶解后，甲醇与粗品a液固比为4ml：1g，在600转/分钟的条件下离心15分钟，取上清液减压浓缩，冷却干燥，得细粉，将细粉加入氯仿完全溶解，氯仿与粗品a液固比为4ml：1g，在600转/分钟的条件下离心10分钟，取上清液b。3、将上清液b进行活性炭脱色处理20分钟，所述活性炭粒度为20目，过滤，将滤液减压浓缩，冷冻干燥得到粉末c。4、将粉末c进行硅胶柱层析，硅胶柱层析中拌样硅胶与粉末c重量比为3:1，装柱硅胶与粉末c重量比为500:1，硅胶粒度为100目，采用氯仿-甲醇混合液混合液洗脱，收集洗脱液，氯仿-甲醇混合液中氯仿与甲醇的体积比为5:1，将洗脱液减压浓缩，冷冻干燥后再进行凝胶层析，采用甲醇洗脱，收集第一和第二柱体积的洗脱液，合并两柱洗脱液，减压浓缩冷冻干燥，得到浸膏备用。5、将取得的浸膏进行定性试验。试验方法：在浸膏中加入molish试剂，进行糖苷类化合物的检测试验。实验结果：阴性对照液无紫红色环，葡萄糖阳性对照液反应出现紫红色环，浸膏进行molish反应未出现紫红色环。证明浸膏中不含糖苷类化合物，即不含有树脂糖苷类成分。以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本
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的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。当前第1页1 2 3