本发明涉及植物提取技术领域，具体涉及一种从辣木籽中提取酪氨酸酶抑制剂的方法、由其制得的酪氨酸酶抑制剂及其应用。
背景技术：
酪氨酸酶(tyrosinase，ec1.14.18.1)是一种分子量为75kd的含铜酶，来源于胚胎神经鞘细胞，是黑色素代谢和儿茶酚胺的关键酶。spritz等人证实tyr是一种铜结合蛋白，有铜a和铜b位点。离子铜特异性能与人tyr结合，一个位点的铜结合可以促进另一个位点的铜结合。组氨酸在铜b位点协调其结合。
酪氨酸酶是生物体黑色素合成的关键酶，兼有加氧酶和氧化酶的双重功能，它能够把单酚催化成二酚，并把二酚氧化成醌；醌在非酶促条件下形成最终的反应产物黑色素。酪氨酸酶抑制剂就是通过抑制酪氨酸酶活性从而抑制黑色素生成。对于人体健康而言，酪氨酸酶的异常过量表达可导致人体的色素沉着性疾病；对于果树加工而言，由酪氨酸酶引起的酶促褐变不仅影响产品的色泽、外观，而且会破坏必需产品的氨基酸、降低其营养和消化吸收，并最终严重影响产品的营养价值和市场价值。在医药领域，酪氨酸酶抑制剂就是通过抑制酪氨酸酶活性从而抑制黑色素生成，因此酪氨酸酶抑制剂通过破坏酪氨酸酶活性，从而达到减少皮肤中黑色素的目的，进而用于治疗目前常见的色素沉着疾病如雀斑、黄褐斑、老年斑和黑色素瘤等，可广泛应用于医药和化妆品行业。
辣木为辣木科辣木属植物，原产于印度北部喜马拉雅区域，辣木不仅可以食用，在热带、亚热带地区还用作植物药材而备受重视。近年来，辣木在我国广东、云南和海南等都有引种栽培，其产品的开发成为热点，现有研究表明，长期服用辣木籽可以有效地起到抗衰老的作用。然而，尚未有研究将辣木籽提取物用于抑制酪氨酸酶的活性。
cn103520373a公开了一种从茶果皮中提取酪氨酸酶抑制剂的方法，该方法通过极性区别提取并通过酶法结合超声提取，大大提高了提取的效率，适用于产业化生产，但总体来说，其制备方法复杂，工艺控制存在困难，且该发明公开的提取方法只适用于茶果皮中酪氨酸酶抑制剂的提取，应用范围窄。
因此，尝试从辣木籽中提取酪氨酸酶抑制剂以及探索其最适合的提取方式是目前需要攻克的难题。
技术实现要素：
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种从辣木籽中提取酪氨酸酶抑制剂的方法、由其制得的酪氨酸酶抑制剂及其应用。所述方法操作简单、成本低，提取得到的酪氨酸酶抑制剂中有效物质含量高、杂质少，对酪氨酸酶的抑制率高，并且该酪氨酸酶抑制剂来自天然植物，温和不刺激，具有很高的实用价值。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供了一种从辣木籽中提取酪氨酸酶抑制剂的方法，所述方法以辣木籽为原料，先利用水萃取，而后进行有机溶剂反萃取，得到所述酪氨酸酶抑制剂。
本发明所述方法以辣木籽为原料，先通过水萃取，再通过有机溶剂进行反萃取，实现了辣木籽中酪氨酸酶抑制剂的有效提取。上述提取方法操作简单、成本低，提取得到的酪氨酸酶抑制剂中有效物质含量高、杂质少，对酪氨酸酶的抑制率高，并且该酪氨酸酶抑制剂来自天然植物，温和不刺激，具有很高的实用价值。
优选地，所述有机溶剂为氯仿和正丁醇。
优选地，所述氯仿和所述正丁醇的体积比为(1-4):1，例如可以是1:1、1.5:1、2:1、2.5:1、3:1、3.5:1或4:1等。
本发明所述有机溶剂特异性地选择氯仿和正丁醇，并优选两者的体积比在上述范围内，是为了保证最大程度地脱除水萃取后，萃取物中仍然残存的脂溶性成分，进而提高酪氨酸酶抑制剂中有效物质的含量，降低酪氨酸酶抑制剂中的杂质含量。
优选地，所述方法还包括：在水萃取前先对辣木籽进行预处理。
优选地，所述预处理的方法包括：将辣木籽清洗，在80-110℃的温度下烘干24-48h，粉碎，过40-150目筛，得到所述辣木籽粉。
所述80-110℃，例如可以是80℃、85℃、90℃、95℃、100℃、105℃或110℃等。
所述24-48h，例如可以是24h、28h、30h、32h、36h、40h、42h、45h或48h等。
所述40-150目，例如可以是40目、50目、60目、70目、80目、90目、100目、110目、120目、130目、140目或150目等。
优选地，所述辣木籽粉的粒径为40-150目，例如可以是40目、50目、60目、70目、80目、90目、100目、110目、120目、130目、140目或150目等。
优选地，所述水萃取包括：将辣木籽和水混合，将得到的混合物进行超声萃取、过滤和第一次浓缩，得到浓缩物。
优选地，所述辣木籽与所述水的质量比为1:(5-40)，例如可以是1:5、1:6、1:8、1:10、1:12、1:15、1:18、1:20、1:23、1:25、1:28、1:30、1:32、1:35、1:38或1:40等。
优选地，所述混合的温度为27-60℃，例如可以是27℃、30℃、32℃、35℃、38℃、40℃、42℃、45℃、50℃、55℃或60℃等。
优选地，所述混合的时间为0.5-4h，例如可以是0.5h、1h、1.5h、2h、2.5h、3h、3.5h或4h等。
本发明优选上述混合的温度和时间，是为了保证辣木籽颗粒可以充分溶胀，进而提高辣木籽颗粒中的酪氨酸酶抑制剂的提取效率。
优选地，所述超声萃取的温度为30-110℃，例如可以是30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃、100℃或110℃等。
优选地，所述超声萃取的时间为0.5-6h，例如可以是0.5h、1h、1.5h、2h、2.5h、3h、3.5h、4h、4.5h、5h、5.5h或6h等。
优选地，所述超声萃取的功率为200-500w，例如可以是200w、250w、300w、350w、400w、450w或500w等。
优选地，所述超声萃取的频率为35-60khz，例如可以是35khz、38khz、40khz、42khz、45khz、48khz、50khz、55khz或60khz等。
本发明在利用水萃取的过程中优选采用超声波辅助提取，强化了萃取力度，提高了萃取效率，并且通过控制超声萃取的温度、时间、功率和频率在上述范围内，实现了最大程度地提取出辣木籽中含有的酪氨酸酶抑制剂。
优选地，所述水萃取还包括：在所述过滤之前，先对超声萃取后的混合物进行冷却。
优选地，所述冷却的温度为18-25℃，例如可以是18℃、19℃、20℃、21℃、22℃、23℃、24℃或25℃等。
优选地，所述第一次浓缩为真空浓缩。
优选地，所述真空浓缩的气压为-0.08～-0.09mpa，例如可以是-0.09mpa、-0.089mpa、-0.088mpa、-0.086mpa、-0.085mpa、-0.083mpa或-0.08mpa等。
优选地，所述真空浓缩的温度为50-75℃，例如可以是50℃、52℃、55℃、57℃、60℃、63℃、65℃、68℃、70℃、72℃或75℃等。
优选地，所述有机溶剂反萃取包括：将利用水萃取后得到的浓缩物和有机溶剂混合，静置，取下层溶液进行第二次浓缩和干燥。
优选地，所述辣木籽与所述有机溶剂的质量比为1:(100-200)，例如可以是1:100、1:110、1:120、1:130、1:140、1:150、1:160、1:170、1:180、1:190或1:200等。
优选地，所述混合的温度为20-30℃，例如可以是20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃或30℃等。
优选地，所述混合的时间为10-30min，例如可以是10min、11min、12min、13min、14min、15min、20min、25min或30min等。
优选地，所述混合的方式为震荡混合。
优选地，所述静置的温度为20-30℃，例如可以是20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃或30℃等。
优选地，所述静置的时间为10-40min，例如可以是10min、15min、20min、25min、30min、35min或40min等。
优选地，所述第二次浓缩为真空浓缩。
优选地，所述真空浓缩的气压为-0.08～-0.09mpa，例如可以是-0.09mpa、-0.089mpa、-0.088mpa、-0.086mpa、-0.085mpa、-0.083mpa或-0.08mpa等。
优选地，所述真空浓缩的温度为10-30℃，例如可以是10℃、15℃、20℃、25℃或30℃等。
优选地，所述干燥为冷冻干燥。
优选地，所述冷冻干燥的温度为-40～0℃，例如可以是-40℃、-35℃、-30℃、-25℃、-20℃、-15℃、-10℃、-5℃或0℃等。
优选地，所述冷冻干燥的时间为1-8h，例如可以是1h、2h、3h、4h、5h、6h、7h、8h或9h等。
优选地，所述方法包括以下步骤：
1)将辣木籽清洗，在80-110℃的温度下烘干24-48h，粉碎，过40-150目筛，得到辣木籽粉，将得到的辣木籽粉和水在27-60℃下混合0.5-4h，将得到的混合物在30-110℃下进行超声萃取0.5-6h，其中，超声萃取的功率为200-500w，频率为35-60khz，萃取完成后，冷却至18-25℃，过滤，在气压为-0.08～-0.09mpa，温度为50-75℃下进行真空浓缩，得到浓缩物；
2)向步骤1)得到的浓缩物中加入氯仿和正丁醇的混合物，其中，氯仿和正丁醇的体积比为(1-4):1，混合，静置，取下层溶液在气压为-0.08～-0.09mpa，温度为10-30℃下再进行真空浓缩，在-40～0℃的温度下进行冷冻干燥1-8h，得到所述酪氨酸酶抑制剂。
第二方面，本发明还提供了一种酪氨酸酶抑制剂，所述酪氨酸酶抑制剂由如第一方面所述的方法制得。
第三方面，本发明还提供了一种化妆品，所述化妆品包括如第二方面所述的酪氨酸酶抑制剂。
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
本发明所述方法以辣木籽为原料，先通过水萃取，再通过有机溶剂进行反萃取，实现了辣木籽中酪氨酸酶抑制剂的有效提取。上述提取方法操作简单、成本低，提取得到的酪氨酸酶抑制剂中有效物质含量高、杂质少，对酪氨酸酶的抑制率高，并且该酪氨酸酶抑制剂来自天然植物，温和不刺激，具有很高的实用价值。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
实施例1
本实施例提供了一种从辣木籽中提取酪氨酸酶抑制剂的方法，所述方法包括以下步骤：
1)将辣木籽清洗后，置于鼓风干燥箱中，在105℃下烘干48h，粉碎，过60目筛，得到辣木籽粉，其中，辣木籽粉的粒径为60目；将上述得到的辣木籽粉100g和水3000g(辣木籽和水的质量比为1:30)在30℃下浸泡2h，将得到的混合物在100℃下进行超声萃取1h，其中，超声萃取的功率为200w，频率为40khz，萃取完成后，冷却至20℃，过滤，在气压为-0.09mpa，温度为60℃下进行真空浓缩，得到浓缩物；
2)向步骤1)得到的浓缩物中加入氯仿和正丁醇的混合物10000g(辣木籽与有机溶剂质量比为1:100)，其中，氯仿和正丁醇的体积比为1:1，在20℃下混合10min，再在20℃下静置10min，取下层溶液，在气压为-0.09mpa，温度为10℃下再进行真空浓缩，在-40℃的温度下进行冷冻干燥6h，得到所述酪氨酸酶抑制剂。
实施例2
本实施例提供了一种从辣木籽中提取酪氨酸酶抑制剂的方法，所述方法包括以下步骤：
1)将辣木籽清洗后，置于鼓风干燥箱中，在105℃下烘干48h，粉碎，过40目筛，得到辣木籽粉，其中，辣木籽粉的粒径为40目；将上述得到的辣木籽粉100g和水1000g(辣木籽和水的质量比为1:10)在40℃下浸泡1h，将得到的混合物在90℃下进行超声萃取1h，其中，超声萃取的功率为300w，频率为40khz，萃取完成后，冷却至25℃，过滤，在气压为-0.09mpa，温度为60℃下进行真空浓缩，得到浓缩物；
2)向步骤1)得到的浓缩物中加入氯仿和正丁醇的混合物11000g(辣木籽与有机溶剂质量比为1：110)，其中，氯仿和正丁醇的体积比为3:1，在21℃下混合15min，再在25℃下静置15min，取下层溶液，在气压为-0.09mpa，温度为20℃下再进行真空浓缩，在-40℃的温度下进行冷冻干燥8h，得到所述酪氨酸酶抑制剂。
实施例3
本实施例提供了一种从辣木籽中提取酪氨酸酶抑制剂的方法，所述方法包括以下步骤：
1)将辣木籽清洗后，置于鼓风干燥箱中，在105℃下烘干48h，粉碎，过60目筛，得到辣木籽粉，其中，辣木籽粉的粒径为60目；将上述得到的辣木籽粉100g和水500g(辣木籽和水的质量比为1:5)在27℃下浸泡2h，将得到的混合物在60℃下进行超声萃取2h，其中，超声萃取的功率为250w，频率为40khz，萃取完成后，冷却至18℃，过滤，在气压为-0.09mpa，温度为60℃下进行真空浓缩，得到浓缩物；
2)向步骤1)得到的浓缩物中加入氯仿和正丁醇的混合物13000g(辣木籽与有机溶剂质量比为1：130)，其中，氯仿和正丁醇的体积比为2:1，在25℃下混合20min，再在25℃下静置20min，取下层溶液，在气压为-0.09mpa，温度为25℃下再进行真空浓缩，在-40℃的温度下进行冷冻干燥6h，得到所述酪氨酸酶抑制剂。
实施例4
本实施例提供了一种从辣木籽中提取酪氨酸酶抑制剂的方法，所述方法包括以下步骤：
1)将辣木籽清洗后，置于鼓风干燥箱中，在110℃下烘干36h，粉碎，过60目筛，得到辣木籽粉，其中，辣木籽粉的粒径为60目；将上述得到的辣木籽粉100g和水4000g(辣木籽和水的质量比为1:40)在60℃下浸泡0.5h，将得到的混合物在50℃下进行超声萃取4h，其中，超声萃取的功率为500w，频率为35khz，萃取完成后，冷却至23℃，过滤，在气压为-0.08mpa，温度为75℃下进行真空浓缩，得到浓缩物；
2)向步骤1)得到的浓缩物中加入氯仿和正丁醇的混合物18000g(辣木籽与有机溶剂质量比为1：180)，其中，氯仿和正丁醇的体积比为4:1，在20℃下混合17min，再在28℃下静置35min，取下层溶液，在气压为-0.08mpa，温度为25℃下再进行真空浓缩，在-20℃的温度下进行冷冻干燥8h，得到所述酪氨酸酶抑制剂。
实施例5
本实施例提供了一种从辣木籽中提取酪氨酸酶抑制剂的方法，所述方法包括以下步骤：
1)将辣木籽清洗后，置于鼓风干燥箱中，在80℃下烘干48h，粉碎，过60目筛，得到辣木籽粉，其中，辣木籽粉的粒径为60目；将上述得到的辣木籽粉100g和水2000g(辣木籽和水的质量比为1:20)在50℃下浸泡3h，将得到的混合物在80℃下进行超声萃取6h，其中，超声萃取的功率为200w，频率为60khz，萃取完成后，冷却至25℃，过滤，在气压为-0.085mpa，温度为50℃下进行真空浓缩，得到浓缩物；
2)向步骤1)得到的浓缩物中加入氯仿和正丁醇的混合物17000g(辣木籽与有机溶剂质量比为1：170)，其中，氯仿和正丁醇的体积比为3:1，在29℃下混合29min，再在20℃下静置18min，取下层溶液，在气压为-0.085mpa，温度为20℃下再进行真空浓缩，在-30℃的温度下进行冷冻干燥7h，得到所述酪氨酸酶抑制剂。
实施例6
与实施例1的区别仅在于，氯仿和正丁醇的体积比为5:1。
实施例7
与实施例1的区别仅在于，氯仿和正丁醇的体积比为0.5:1。
实施例8
与实施例1的区别仅在于，水的用量为5000g，即辣木籽和水的质量比为1:50。
实施例9
与实施例1的区别仅在于，水的用量为300g，即辣木籽和水的质量比为1:3。
实施例10
与实施例1的区别仅在于，氯仿和正丁醇的总质量为30000g。
实施例11
与实施例1的区别仅在于，氯仿和正丁醇的总质量为5000g。
实施例12
与实施例1的区别仅在于，使用单一氯仿替代氯仿和正丁醇的混合物。
实施例13
与实施例1的区别仅在于，使用单一正丁醇替代氯仿和正丁醇的混合物。
实施例14
与实施例1的区别仅在于，使用乙醇替代正丁醇。
实施例15
与实施例1的区别仅在于，使用乙醇替代氯仿。
对比例1
本对比例提供了一种从辣木籽中提取酪氨酸酶抑制剂的方法，所述方法包括以下步骤：
将辣木籽清洗后，置于鼓风干燥箱中，在80℃下烘干48h，粉碎，过80目筛，得到辣木籽粉，其中，辣木籽粉的粒径为80目；将上述得到的辣木籽粉100g和水2000g(辣木籽和水的质量比为1:20)在50℃下浸泡3h，将得到的混合物在80℃下进行超声萃取6h，其中，超声萃取的功率为200w，频率为60khz，萃取完成后，冷却至25℃，过滤，在气压为-0.085mpa，温度为50℃下进行真空浓缩，得到酪氨酸酶抑制剂。
性能测试：
1、酪氨酸酶活性抑制试验：
对本发明实施例和对比例提取的酪氨酸酶抑制剂进行酪氨酸酶活性抑制试验，具体试验方法如下：
受试药物：将实施例1-15和对比例1制得的酪氨酸酶抑制剂，分别溶解于dmso中，制得浓度为25mg/ml母液；同时将熊果苷、曲酸溶解于dmso中，制得浓度为25mg/ml母液。
实验方法：在96孔板中的每孔都加入30μl25μg/ml酪氨酸酶及30μl上述制得的受试药物，混合，25℃下孵育10min，每孔加入50μl5mm的l-dopa启动反应，25℃避光孵育5min，于475nm处读取吸光度值(每孔均做空白对照<以缓冲液代替酪氨酸酶>以扣除提取物颜色对吸光度值的影响)。
酪氨酸酶抑制率的计算方法如下：
酪氨酸酶抑制率(％)＝[(a-b)-(c-d)]/[a-b]×100％；
a：未加酪氨酸酶抑制剂而加酪氨酸酶的混合液所测的吸光度；
b：未加酪氨酸酶抑制剂也未加酪氨酸酶的混合液所测的吸光度；
c：加酪氨酸酶抑制剂和酪氨酸酶的混合液所测的吸光度；
d：加酪氨酸酶抑制剂而未加酶的混合液所测的吸光度。
具体测试结果如表1所示：
表1
从实施例和性能测试的结果可知，本发明实施例1-5制备得到的酪氨酸酶抑制剂的得率可以达到2％，其对酪氨酸酶抑制率最高可达50％以上。这说明利用本发明所述方法得到的酪氨酸酶抑制剂对酪氨酸酶的抑制率高，具有很高的实用价值。
与实施例1相比，实施例6中氯仿和正丁醇的体积比高于实施例1，其制备得到的酪氨酸酶抑制剂对酪氨酸酶的抑制率低于实施例1，实施例7中氯仿和正丁醇的体积比低于实施例1，其制备得到的酪氨酸酶抑制剂对酪氨酸酶的抑制率也低于实施例1，这说明只有将氯仿和正丁醇的体积比在(1-4):1的范围内，才能保证制得的酪氨酸酶抑制剂对酪氨酸酶的抑制率高。
与实施例1相比，实施例8中辣木籽和水的质量比高于实施例1，其制备得到的酪氨酸酶抑制剂对酪氨酸酶的抑制率低于实施例1，实施例9中辣木籽和水的质量比低于实施例1，其制备得到的酪氨酸酶抑制剂对酪氨酸酶的抑制率也低于实施例1，这说明只有将辣木籽和水的质量比在1:(5-40)的范围内，才能保证制得的酪氨酸酶抑制剂对酪氨酸酶的抑制率高。
与实施例1相比，实施例10中辣木籽和有机溶剂的质量比高于实施例1，其制备得到的酪氨酸酶抑制剂对酪氨酸酶的抑制率低于实施例1，实施例11中辣木籽和有机溶剂的质量比低于实施例1，其制备得到的酪氨酸酶抑制剂对酪氨酸酶的抑制率也低于实施例1，这说明只有将辣木籽和有机溶剂的质量比在一定范围内，才能保证制得的酪氨酸酶抑制剂对酪氨酸酶的抑制率高。
与实施例1相比，实施例12和13利用单一组分的氯仿或正丁醇替换两者的混合物，其制备得到的酪氨酸酶抑制剂对酪氨酸酶的抑制率低于实施例1，这说明氯仿和正丁醇之间可以相互配合，协同增效，两者复配使用可以提高酪氨酸酶抑制剂中的有效成分，进而提高酪氨酸酶抑制剂对酪氨酸酶的抑制率。
申请人声明，以上所述仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，所属技术领域的技术人员应该明了，任何属于本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。