专利名称：厚朴酚及和厚朴酚在蛋白质酪氨酸磷酸酶1b抑制剂中的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于酪氨酸磷酸酶抑制剂筛选领域，特别涉及厚朴酚及和厚朴酚混合物在蛋白质酪氨酸磷酸酶IB抑制剂方面的应用，进而用于制备治疗及预防与蛋白质酪氨酸磷酸酶IB活力过高或过表达相关疾病的食品、药物或食品及药物组合物。
背景技术：
蛋白质酪氨酸磷酸酶(PTPs)大家族，是信号转导中的重要调节因子，酪氨酸磷酸化过度或不足，是许多与信号转导失调相关疾病的特征。蛋白质酪氨酸磷酸酶lB(Pr0tein Tyrosine PhosphataselB, PTP1B)是美国华盛顿大学爱德蒙德·费舍尔(Edmond H-Fischer)教授于1988年发现的，是第一个被成功分离的蛋白质酪氨酸磷酸酶。该酶为一个37KD的胞内酶，通过含有35个氨基酸残基的C末端被定位于细胞内质网上，在第215位的Cys是PTPlB的催化活性中心。PTPlB广泛存在人类和动物体内，在细胞生长、组织分化、细胞间信号传导、免疫反应及代谢方面发挥着非常重要的作用。研究发现PTPlB能够调节许多凋亡蛋白的磷酸化程度、可调节神经发育及免疫应答并与多种生长因子有相互作用。PTPlB在体内的活力过高或过表达是许多疾病的重要特征，如帕金森病、慢性髓系白血病等疾病都与其密切相关。近年来，国内外的很多研究人员一直都在寻找选择性的PTPlB抑制剂，虽然特异的、有效的和安全的非肽类抑制剂尚未发现，但PTPlB抑制剂的研究已经取得了一定的进展。目前已发现的大多数PTPlB抑制剂为肽类或毒性较强的物质，例如非选择性的PTP抑制剂钒酸盐和过钒酸盐等，无法作为药物进行开发。其它如中国专利CN1794989A，所提到的 PTPlB抑制剂为N-(((((l，3-噻唑-2-基)氨基)羰基)苯基)磺酰基)苯丙氨酸衍生物及相关化合物，需要通过多步化学合成得到，生产工艺复杂。从传统中药资源中筛选PTPlB抑制剂是最有希望的方法之一，现已有从中药等天然植物中分离提取得到的PTPlB抑制剂， 如中国专利CN1521157A，在植物紫金牛和小连翘中分离得到了一系列PTPlB抑制物对苯醌类化合物及其衍生物。但尚未发现厚朴酚及和厚朴酚抑制PTPlB的专利。
发明内容
本发明的目的是提供厚朴酚及和厚朴酚在蛋白质酪氨酸磷酸酶IB(PTPlB)抑制剂方面的新用途。厚朴酚及和厚朴酚是存在于中药厚朴中的多酚类化合物。本发明所涉及的厚朴酚
及和厚朴酚，其结构式如下所示
厚朴酚
和厚朴酚本发明的厚朴酚及和厚朴酚是通过萃取的方法从厚朴中获得的天然产物。该厚朴酚及和厚朴酚制剂在体外能抑制PTPlB的活性，而且无毒副作用。可以在PTPlB抑制剂方面得到应用，进而可以用于制备治疗及预防与PTPlB活力过高或过表达相关疾病的食品、 药物或食品及药物组合物。厚朴酚及和厚朴酚提取方法方法一1)将干燥厚朴皮装入三角烧瓶中，然后用甲醇与水混合提取液在45 55°C水浴温度下冷凝水回流提取，提取3 5次，将最后得到的提取液在40 50°C水浴温度下浓缩得甲醇提取物；干燥厚朴皮与混合提取液的用量比例为W V = Ikg 10 15L，甲醇与水组成的混合提取液中，按体积百分比计算Vw V水=90 95 10 5 ；2)将步骤1)的甲醇提取物溶解在W V= 1 1 3倍量的蒸馏水中，再加入与蒸馏水等体积的正己烷进行萃取，萃取3 5次，保留水相；3)在步骤幻的水相体系中，加入与水相体系等体积的二氯甲烷进行萃取，萃取 3 5次，保留水相；4)在步骤幻的水相体系中加入与水相体系等体积的乙酸乙酯进行萃取，萃取3 5次，然后在40 50°C水浴温度下旋转蒸发脱去乙酸乙酯，从而得到乙酸乙酯层浓缩物，即为厚朴酚及和厚朴酚的混合物，其中^mm W和厚朴1.5-2.5 1。方法二1)将厚朴干燥后研磨粉碎，通过40 60目筛过滤，得到厚朴干粉；2)将厚朴干粉与体积分数为70% 95%的乙醇水溶液按W V=I 10 20 进行浸泡并搅拌1 3小时，搅拌速度为60 300转/分，然后过滤去除残渣，得到厚朴的乙醇浸泡液；再将浸泡液中的乙醇蒸发去除，得到粘稠的厚朴浸膏；3)将厚朴浸膏加热80 100°C，干燥去除剩余乙醇，得到厚朴干粉；再将厚朴干粉与蒸馏水、纯净水或去离子水按W V = Ikg 10 20L进行浸泡并搅拌1 3小时，搅拌速度为60 300转/分，然后过滤去除残渣，得到厚朴水煎剂；4)将厚朴水煎剂加热至90 100°C去除水分，完全干燥后，将干燥产物粉碎；再按比例W V = Ikg 10 20L将干燥产物溶于体积分数为2% 10%的吐温(如Tween20) 中，即得到厚朴酚及和厚朴酚的混合物，其中Wiwffi W糖朴1.5 3.0 1。高效液相色谱检测(HPLC)对本发明制备的厚朴制剂(实例1厚朴酚及和厚朴酚的混合物)进行高效液相色谱检测，检测条件如下流动相为体积分数50%乙腈的水溶液，C18色谱柱，柱温40°C，检测波长为^4nm。通过比较厚朴酚及和厚朴酚标准品(中国药品生物制品检定所)与本发明制备的厚朴制剂样品的HPLC检测结果曲线，证明该厚朴制剂的主要成分为厚朴酚及和厚朴酚，按HPLC峰面积计算，厚朴酚及和厚朴酚混合物占提取物总量的68. 7%。与厚朴酚及和厚朴酚标准品对比，图1 (C)的峰1为杂质峰、峰2为和厚朴酚峰、峰3为厚朴酚峰。PTPlB抑制性的测定抑制性的测定原理PTPlB是一种去磷酸化酶，它可以使磷酸化的蛋白质去磷酸化。对硝基苯磷酸二钠盐(pNPP)可以被PTPlB去磷酸化，变成对硝基苯酚，颜色呈黄色。检测405nm处光吸收值的变化来间接检测酶活性的变化情况。测定体系如下25mM吗啉代丙烷磺酸(MOPS)，ImM牛血清白蛋白(BSA)，ImM 二硫苏糖醇(DTT)，0. ImM乙二胺四乙酸二钠盐(EDTA)，20mM对-硝基苯磷酸(p-NPP)，5ηΜΡΤΡ1Β，在 37°C 反应 30min，加入 100 μ 1 0. 2Μ NaHCO3 终止反应，在 405nm处测定光吸收的变化值。抑制性的测定方法各种物质对PTPlB的抑制性的考察是通过测定半数抑制浓度(IC5tl)来衡量。将抑制组分按梯度进行稀释，将稀释后的各个梯度加入如上面所说的反应体系中，于405nm测定37°C，30min内光吸收的变化值之后，将各个梯度的吸收值与未加抑制组分的相除，得出的数值为抑制百分数，当抑制率达到50%时，所对应的稀释梯度的倍数做为IC5(I。抑制性的考察标准将厚朴酚及和厚朴酚混合物、厚朴酚标准品、和厚朴酚标准品、厚朴酚及和厚朴酚标准品混合物(W厚朴 ^mm= 2 1)用体积分数为50%乙醇的水溶液配制成25mg/ml 的贮液。按梯度用蒸馏水稀释，测定每个稀释浓度对PTPlB的抑制率，以抑制剂的浓度(ug/ ml)为横坐标，以抑制剂对PTPlB的抑制率为纵坐标作图，得到抑制剂对PTPlB的IC5tl值。
图1 厚朴提取物的高效液相色谱检测图(针对实施例1)；其中图A为厚朴酚标准品，图B为和厚朴酚标准品，图C厚朴提取物；图2 实施例1制备的厚朴酚及和厚朴酚混合物对PTPlB的抑制率曲线；图3 厚朴酚标准品对PTPlB的抑制率曲线；图4 和厚朴酚标准品对PTPlB的抑制率曲线；图5 厚朴酚及和厚朴酚标准品混合物(Wffttffi 2 1)对PTPlB的抑制
率曲线。
具体实施例方式实施例1 厚朴酚及和厚朴酚提取实例将干燥厚朴皮Ikg装入三角烧瓶中，然后用V￥e V7k= 95 5的混合提取液 IOL在50°C水浴温度下，冷凝水回流提取，提取3次，在45°C水浴温度下浓缩得甲醇提取物140mg ；然后将甲醇提取物溶解在250ml蒸馏水中，在水相中按体积比1 1的比例加入正己烷250ml萃取，萃取3次，保留水相。在水相中按体积比1 1的比例加入二氯甲烷 250ml，萃取3次，保留水相。在水相中按体积比等于1 1的比例加入乙酸乙酯250ml，萃取3次；在45°C水浴温度下旋转蒸发脱去乙酸乙酯，得乙酸乙酯层浓缩物6. 8g，即为厚朴酚及和厚朴酚的混合物，收率为0. 68%，经高效液相色谱检测，其中厚朴酚含量为0.四％，和厚朴酚的含量为0. 18%。
实施例2 将厚朴干燥后研磨粉碎，通过40目筛过滤，得到厚朴干粉。将厚朴干粉Ikg加入到 10L、体积浓度为95%的乙醇的水溶液中浸泡并搅拌，搅拌速度为200转/分，搅拌2小时， 过滤去除残渣，得到厚朴的乙醇浸泡液约10L。将溶液中的乙醇蒸发去除，得到粘稠的厚朴浸膏。将浸膏加热100°C干燥以去除剩余乙醇，得到厚朴干粉120mg ；再将厚朴干粉与蒸馏水按W V=Ikg IOL进行浸泡并搅拌，搅拌转数为200转/分，2小时后，过滤去除残渣， 得到厚朴水煎剂。将上述厚朴水煎剂加热至100°C去除水分；完全干燥后，将干燥的水提取物粉碎，称重为6. 2g，收率为0. 62%，经高效液相色谱检测，其中厚朴酚含量为0. 33%，和厚朴酚的含量为0. 12%。按比例W V = Ikg IOL溶于体积浓度为4%的吐温20水溶液中，该液体即为厚朴酚及和厚朴酚的混合物。实施例3 厚朴酚及和厚朴酚对PTPlB抑制效果检测将厚朴酚及和厚朴酚混合物(针对实施例1)、厚朴酚标准品、和厚朴酚标准品、厚朴酚及和厚朴酚标准品混合物(Wffttffi ^mm= 2 1)用体积浓度为50%乙醇的水溶液配制成25mg/ml的贮液。再用蒸馏水稀释成不同浓度的溶液(1000ug/ml、800ug/ml、500ug/ ml、300ug/ml、200ug/ml、150ug/ml、lOOug/ml、50ug/ml、20ug/ml、lOug/ml、5ug/ml)，测定每个稀释浓度对PTPlB的抑制率，以抑制剂的浓度(ug/ml)为横坐标，以抑制剂对PTPlB 的抑制率为纵坐标作图，得到厚朴酚及和厚朴酚混合物(针对实例1)对PTPlB的IC5tl为 60. 77ug/ml、厚朴酚标准品对PTPlB的IC5tl为203. ^ug/ml、和厚朴酚标准品对PTPlB的IC5tl 为95. 14ug/ml、厚朴酚及和厚朴酚标准品混合物(Wiwffi Wwffttffi= 2 1)对PTPlB的IC5tl 为58. 70ug/ml。说明厚朴提取物中对PTPlB酶活具有抑制效果的确实是厚朴酚及和厚朴酚的混合物，而单一的厚朴酚或和厚朴酚标准品对PTPlB酶活的IC5tl值均较二者混合后的 IC5tl值要高，将厚朴酚与和厚朴酚标准品按Wffi卜 ^mm= 2 1混合后，所测得的IC5tl 值与实例1所得混合物对PTPlB IC5tl值相当，这说明厚朴酚及和厚朴酚对PTPlB的抑制存在一定的协同效应，将二者混合后对PTPlB酶活具有更好的抑制效果。
权利要求
1.厚朴酚及和厚朴酚在蛋白质酪氨酸磷酸酶IB抑制剂方面的应用。
2.如权利要求1所述的厚朴酚及和厚朴酚在蛋白质酪氨酸磷酸酶IB抑制剂方面的应用，其特征在于用于制备治疗和预防与蛋白质酪氨酸磷酸酶IB活力过高或过表达相关疾病的食品、药物或食品及药物组合物。
3.如权利要求1所述的厚朴酚及和厚朴酚在蛋白质酪氨酸磷酸酶IB抑制剂方面的应用，其特征在于，厚朴酚及和厚朴酚是由如下步骤制备1)将干燥厚朴皮装入三角烧瓶中，然后用甲醇与水混合提取液在45 55°C水浴温度下冷凝水回流提取，提取3 5次，将最后得到的提取液在40 50°C水浴温度下浓缩得甲醇提取物；2)将步骤1)的甲醇提取物溶解在是其体积1 3倍量的蒸馏水中，再加入与蒸馏水等体积的正己烷进行萃取，萃取3 5次，保留水相；3)在步骤幻的水相体系中，加入与水相体系等体积的二氯甲烷进行萃取，萃取3 5 次，保留水相；4)在步骤幻的水相体系中加入与水相体系等体积的乙酸乙酯进行萃取，萃取3 5 次，然后在40 50°C水浴温度下旋转蒸发脱去乙酸乙酯，从而得到乙酸乙酯层浓缩物，即为厚朴酚及和厚朴酚的混合物，其中^mm W和厚朴1.5-2.5 1。
4.如权利要求1所述的厚朴酚及和厚朴酚在蛋白质酪氨酸磷酸酶IB抑制剂方面的应用，其特征在于干燥厚朴皮与混合提取液的用量比例为W V = Ikg 10 15L，甲醇与水组成的混合提取液中，按体积百分比计算Vmi V水=90 95 10 5。
5.如权利要求1所述的厚朴酚及和厚朴酚在蛋白质酪氨酸磷酸酶IB抑制剂方面的应用，其特征在于，厚朴酚及和厚朴酚是由如下步骤制备1)将厚朴干燥后研磨粉碎，通过40 60目筛过滤，得到厚朴干粉；2)将步骤1)厚朴干粉与体积分数为70% 95%的乙醇水溶液按W V = Ikg 10 20L进行浸泡并搅拌1 3小时，搅拌速度为60 300转/分，然后过滤去除残渣，得到厚朴的乙醇浸泡液；再将浸泡液中的乙醇蒸发去除，得到粘稠的厚朴浸膏；3)将步骤2)厚朴浸膏加热80 100°C，干燥去除剩余乙醇，得到厚朴干粉；再将厚朴干粉与蒸馏水、纯净水或去离子水按W V = Ikg 10 20L进行浸泡并搅拌1 3小时， 搅拌速度为60 300转/分，然后过滤去除残渣，得到厚朴水煎剂；4)将步骤幻厚朴水煎剂加热至90 100°C去除水分，完全干燥后，将干燥产物粉碎； 再按比例W V = Ikg 10 20L将干燥产物溶于体积分数为2% 10%的吐温中，即得到厚朴酚及和厚朴酚的混合物，其中^mm W和厚朴1.5-3.0 1。
全文摘要
厚朴酚及和厚朴酚在蛋白质酪氨酸磷酸酶1B抑制剂中的应用，属于酪氨酸磷酸酶抑制技术领域。本发明所述的厚朴酚及和厚朴酚是以厚朴为原料，通过萃取的方法从厚朴中提取得到的天然产物；经体外实验证明其可以抑制人蛋白质酪氨酸磷酸酶1B的生物活性，可用于PTP1B活力过高或过表达所引起的相关疾病的辅助治疗，从而用于制备治疗和预防与蛋白质酪氨酸磷酸酶1B活力过高或过表达相关疾病的食品、药物或食品及药物组合物。
文档编号A23L1/30GK102240274SQ20111012282
公开日2011年11月16日 申请日期2011年5月13日 优先权日2011年5月13日
发明者付学奇, 尹艳春, 李婉南, 胡鑫, 邢述, 马俊锋 申请人:吉林大学