用于原发性线粒体疾病的线粒体增强疗法的制作方法

1.本发明涉及哺乳动物干细胞，更特别是富集有外源功能性人类线粒体的人类干细胞。本发明还涉及它们的生产方法和利用此类富集细胞的治疗方法。


背景技术：

2.线粒体是存在于大多数真核细胞中，直径在0.5至1.0μm范围内的膜约束的细胞器。线粒体存在于几乎所有真核细胞中，其数目和位置随着细胞类型而变。线粒体含有它们自己的dna(mtdna)和自己的用于合成rna和蛋白质的机制。mtdna仅含有37个基因，因此哺乳动物体内的大多数基因产物由核dna编码。
3.线粒体在真核细胞中执行大量必不可少的任务，例如丙酮酸氧化、克雷布斯循环以及氨基酸、脂肪酸和甾类的代谢。然而，线粒体的主要功能是利用电子传递链和氧化磷酸化系统(“呼吸链”)产生作为三磷酸腺苷(atp)的能量。线粒体参与的其他过程包括产热、钙离子储存、钙信号传导、程序化细胞死亡(凋亡)和细胞增殖。因此，在本领域中已知许多与线粒体的功能障碍或功能紊乱相关的需要治疗的疾病和障碍。
4.细胞内的atp浓度通常为1
–
10mm。atp可以使用单糖和复合糖(碳水化合物)或脂类作为能源通过氧化还原反应来生产。对于将要用于合成atp的复杂燃料来说，首先需要将它们分解成更小的、更简单的分子。复杂的碳水化合物被水解成单糖例如葡萄糖和果糖。脂肪(甘油三酯)被代谢以给出脂肪酸和甘油。
5.将葡萄糖氧化成二氧化碳的总过程被称为细胞呼吸，并且从单个葡萄糖分子可以产生约30个atp分子。atp可以通过大量不同的细胞过程产生。在真核生物体中用于产生能量的三个主要途径是糖酵解和柠檬酸循环/氧化磷酸化(两者均为细胞呼吸的组分)以及β
‑
氧化。非光合好氧真核生物的这种atp生产大部分发生在线粒体中，所述线粒体可以占典型细胞总体积的接近25％。
6.线粒体疾病是由功能障碍的线粒体引起的一类疾病。原发性线粒体疾病可能由线粒体dna中影响线粒体功能的突变或由核dna的基因(所述基因的产物被输入到线粒体中(线粒体蛋白))中的突变引起。线粒体疾病具有独特的特征，这既因为所述疾病的方式通常是遗传性的，也因为线粒体对细胞功能至关重要。这些疾病的具有神经肌肉疾病症状的亚类通常被称为线粒体肌病。不同于原发性线粒体疾病，也被称为获得性线粒体功能障碍的继发性线粒体功能障碍可以由核dna的不直接参与线粒体氧化磷酸化级联的基因引起。受影响的基因既不编码线粒体蛋白，也不通过影响运行氧化磷酸化(oxphos)过程所需的复杂机构的生产而影响oxphos。继发性线粒体功能障碍可能伴随许多疾病或障碍例如脂肪性肝病、心肌梗塞和中风，并且也可能是在可以造成氧化胁迫的不利环境或药物相关的效应之后获得的。后者可能造成mtdna改变和/或功能障碍的线粒体，正如在不利地影响线粒体的各种其他过程例如衰老、炎性反应、线粒体毒性药物等中所看到的。
7.在受影响的线粒体数目达到某个水平后，线粒体疾病可能变得临床上明显；这种现象被称为“异质性阈值”。由于不高效的错误检查能力，并且由于dna是裸露的且没有像核
组蛋白那样的保护，线粒体dna突变频繁地发生。这意味着线粒体dna障碍可能自发且相对经常地发生。控制线粒体dna复制的酶(它们都由核dna中的基因编码)中的缺陷也可能引起线粒体dna突变。大多数线粒体功能和生物发生由核dna控制。人类线粒体dna仅编码13种呼吸链的蛋白，而靶向线粒体的据估计1,500种蛋白和组分中的大多数是核编码的。核编码的线粒体基因中的缺陷与包括贫血、痴呆、癫痫、糖尿病、肌病、高血压、淋巴瘤、视网膜病、癫痫发作和神经发育障碍在内的广范围的临床疾病表型相关。
8.皮尔逊综合症(ps)是一种以骨髓失效、贫血和胰腺功能障碍为特征的线粒体疾病。其他临床特点是成长停滞、伴有胰岛素依赖型糖尿病和外分泌型胰腺缺乏症的胰腺纤维化、肾功能不全、肌肉和神经系统损伤。存活到成年的少数患者经常出现kearns
‑
sayre综合征(kss)的症状。
9.肾范可尼综合征或范可尼综合征是一种肾的近端肾小管重吸收不足的综合征。所述综合征可以由各种不同的潜在先天性或获得性疾病、毒性或药物不良反应引起。这导致代谢的各种不同小分子通行进入到尿液中，而不是从肾小管液中重吸收。
10.kss是一种线粒体肌病，是慢性进行性眼外肌麻痹(cpeo)的更严重的综合征变型，是一种以孤立地涉及控制眼和眼睑移动的肌肉为特征的综合征。kss引起上睑下垂和眼肌麻痹。kss包括眼中的cpeo和色素性视网膜病以及心脏传导异常的组合。其他症状可能包括小脑共济失调、近端肌无力、耳聋、糖尿病、生长激素缺乏症和甲状旁腺功能减退。
11.leber遗传性视神经病变(lhon)或leber视神经萎缩是一种视网膜神经节细胞(rgc)和它们的轴突的线粒体遗传(从母亲传递到子代)的变性，其引起中央视力的急性或亚急性丧失，主要影响年轻的成年男性。然而，lhon只通过母亲传递，因为它主要由线粒体(而非核)基因组中的突变所致，并且只有卵子将线粒体贡献给胚胎。lhon通常由三种致病性线粒体dna(mtdna)点突变之一造成。这些突变分别是线粒体中氧化磷酸化链的复合物i的nd4、nd1和nd6亚基基因中的第11778位核苷酸从g突变为a、第3460位核苷酸从g突变为a和第14484位核苷酸从t突变为c。这些突变可以导致细胞能量产生的减少，进而导致细胞损伤和某些视神经细胞的死亡。目前，专家无法确定哪些家庭成员会出现症状，尽管平均有50％的具有lhon突变的男性和15％的具有lhon突变的女性在他们的一生中会失去视力。
12.线粒体脑肌病、乳酸性酸中毒和中风样发作，缩写为melas，是也包括merrf和leber遗传性视神经病变的线粒体细胞病家族的成员之一。所述疾病可以在两种性别中均表现出来。melas由线粒体dna中的基因突变引起。在melas中受影响的一些基因(mt
‑
nd1、mt
‑
nd5)编码作为线粒体中nadh脱氢酶(也被称为复合物i)的一部分的蛋白质，所述脱氢酶有助于将氧气和单糖转化为能量。其他基因(mt
‑
th、mt
‑
tl1和mt
‑
tv)编码线粒体特异性转移rna(trna)。mt
‑
tl1中的突变引起所有melas病例中80％以上的病例。它们损害线粒体制造蛋白质、使用氧气和产生能量的能力。
13.线粒体呼吸链障碍(mrcd)是一组非均质的障碍，由于影响线粒体氧化磷酸化系统(oxphos)的分子缺陷，所述障碍共享细胞生物能机制的参与。尽管它们倾向于主要影响神经系统和骨骼肌，但在临床上它们通常涉及多个组织。心脏病表现很常见，并包括作为成人或婴儿多系统线粒体障碍的一部分的肥厚性或扩张性心肌病和心脏传导缺陷，或不太常见的情况下表现为孤立的临床病症。在某些实施方式中，所述线粒体疾病是线粒体呼吸链疾病(mrcd)。
14.干细胞总的来说是可以分化成其他类型的细胞和/或可以分裂以产生更多相同类型的干细胞的细胞。在哺乳动物中，干细胞的主要类型是胚胎干细胞和成体干细胞。在人类中存在至少三种已知来源的成体干细胞：骨髓干细胞，脂肪组织干细胞和血液干细胞。其他干细胞包括间充质干细胞(msc)、组织特异性干细胞和诱导性多能干细胞(ipsc)。
15.wo 2013/002880描述了包含生物能药剂的组合物和方法，其用于恢复衰老的卵母细胞的质量、增强卵原干细胞或改善其衍生物(例如细胞质或分离的线粒体)，以用于增强生育力的程序中。
16.属于本发明人的wo 2013/035101涉及线粒体组合物和使用它们的治疗方法，并公开了部分纯化的功能性线粒体的组合物和使用所述组合物的方法，所述方法包括通过将所述组合物给药到需要的对象以治疗从线粒体功能的提高获益的病症。
17.wo 2016/008937涉及将从供体细胞群体分离的线粒体细胞间转移到受体细胞群体中的方法。所述方法对一定量的线粒体显示出提高的转移效能。
18.us 2012/0107285涉及细胞的线粒体增强。某些实施方式包括但不限于修饰干细胞的方法或将修饰的干细胞给药到至少一个生物组织的方法。
19.wo 2016/135723涉及功能性线粒体至少被富集50％的人类骨髓细胞、它们的生产方法和利用此类细胞的治疗方法。
20.在本领域中，对在受到各种不同原发性线粒体疾病和障碍影响的细胞和器官中提高线粒体功能的新方法，仍存在着需求。


技术实现要素：

21.线粒体增强疗法首次被用于在遭受由缺陷的线粒体引起的严重效应的儿童中改善各种生理参数的不足。尽管已假设线粒体增强疗法的积极作用能够恢复缺陷的线粒体的功能，但它从未在人类少年患者中成功地实施。值得注意的是，现在公开了即使是低水平的健康线粒体的富集也可以成功地为患者的健康提供非常有益的长期持久的改善，并显着改善各种不同器官和组织的生理参数。
22.以前使用动物模型系统已显示，很容易使宿主细胞的线粒体含量提高超过50％或100％以上。正如在下文中示例的，现在已发现即使是从供体到受体的线粒体的小幅增加也可以实现所需的临床结果。
23.本发明提供了富集有外源功能性线粒体的哺乳动物干细胞和治疗各种不同原发性线粒体疾病的方法。具体来说，本发明提供了组合物，其包含已富集有从健康供体获得的功能性线粒体的人类干细胞。本发明还提供了使用同种异体或自体的“线粒体富化”的干细胞治疗患有原发性线粒体疾病的对象的方法。
24.提供患有线粒体疾病的对象的干细胞、离体处理并返回到同一对象，与涉及同种异体细胞疗法的其他方法相比提供了极大益处。例如，本文中提供的方法消除了对筛查人群并找出与所述患者人类白细胞抗原(hla)匹配的供体这个长且高成本并且不总是成功的过程的需求。所述方法还有利地消除了对用于防止同种异体细胞群体排斥的终生免疫抑制疗法的需求。因此，本发明有利地提供了一种离体矫正疗法的独特方法，其中从患者身体收获细胞，将其用外源(例如同种异体)线粒体离体处理，并返回到同一患者。此外，本发明涉及干细胞的给药，所述干细胞根据经验分布在全身的不同组织和器官中，并在这些部位提
高线粒体功能。
25.本发明部分是基于下述令人吃惊的发现，即用线粒体富化的干细胞治疗患有原发性线粒体疾病的青少年提高了靶组织和器官中的线粒体功能和含量，并改善了与线粒体功能障碍相关的广泛种类的不良病症和症状。
26.还已出人意料地发现，正如在本文中首次示例的，富集的人类干细胞在人类患者中有效地治疗各种不同疾病和症状，即使在线粒体富集后这些细胞的线粒体含量仅仅适度提高的情况下。尽管属于本发明的某些发明人的wo 2016/135723涉及骨髓细胞的至少50％的线粒体富集，但已令人吃惊地发现，人类干细胞的约5％至约45％的线粒体富集足以在人类患者中提供许多临床参数的长期持续的显著的改善。
27.本发明提供的组合物和方法可以被视为线粒体“增强疗法”的一种形式。根据本发明的原理，通过添加富集有野生型、健康的功能性线粒体的干细胞，可以缓解功能性线粒体数目的减少和/或线粒体功能的降低。使富集有完整的功能性线粒体的干细胞融合或进入到患者的组织和器官中，既增加了每个细胞/组织/器官的线粒体拷贝数，也提高了线粒体功能。此外，根据本发明的原理，可以通过添加富集有功能性线粒体的干细胞来替换表现出低水平线粒体功能的细胞。据假定，所述富集的干细胞可能分化成与已受损或低功能的细胞相同类型的细胞，从而改善功能障碍或恢复功能。
28.一方面，本发明提供了一种在需要治疗的人类患者中治疗原发性线粒体疾病、障碍或其症状的方法，所述方法包括将药物组合物肠胃外给药到所述患者的步骤，所述药物组合物包含至少约5x105至5x109个人类干细胞，其中所述人类干细胞富集有冻融过的、在线粒体dna中没有致病突变的健康的功能性人类外源线粒体，并且其中所述健康的功能性外源线粒体占线粒体富化的人类干细胞中总线粒体的至少3％并少于33％。
29.另一方面，本发明提供了一种用于在需要治疗的人类患者中治疗原发性线粒体疾病、障碍或其症状的药物组合物，所述组合物包含在能够支持细胞生存的可药用液体介质中的至少105至2x107个人类干细胞/千克患者体重，其中所述人类干细胞富集有冻融过的、在线粒体dna中没有致病突变的健康的功能性人类外源线粒体，其中所述健康的功能性人类外源线粒体占线粒体富化的人类干细胞中总线粒体的至少3％并少于33％。
30.在某些实施方式中，所述富集包括在所述干细胞中引入剂量为至少0.088直至176毫单位cs活性/百万个细胞的线粒体。
31.在另外的实施方式中，所述富集包括将所述干细胞与剂量为0.88直至17.6毫单位cs活性/百万个细胞的线粒体相接触。在某些实施方式中，将所述剂量的分离的线粒体以所需的浓度添加到所述受体细胞。线粒体供体细胞数目与线粒体受体细胞数目的比例为高于2:1(供体细胞相比于受体细胞)的比例。在典型实施方式中，所述比率为至少5或至少10或更高。在特定实施方式中，从其收集线粒体的供体细胞与受体细胞的比率为至少20、50、100或可能甚至更高。每种可能性是独立的实施方式。
32.在某些实施方式中，所述人类干细胞是cd34
+
。
33.在某些实施方式中，所述健康的功能性人类外源线粒体是同种异体线粒体。在其他实施方式中，所述健康的功能性人类外源线粒体是同系的。
34.在某些实施方式中，所述原发性线粒体疾病或障碍与线粒体dna中的突变相关。在某些实施方式中，所述与线粒体dna中的突变相关的原发性线粒体疾病或障碍选自皮尔逊
综合症(ps)，kearns
‑
sayre综合征(kss)，线粒体脑病、乳酸性酸中毒和中风样发作(melas)综合征，leber遗传性视神经病变(lhon)，神经病、共济失调和色素性视网膜炎(narp)综合征，肌阵挛性癫痫伴蓬毛样红纤维(merrf)综合征，母体遗传性糖尿病和耳聋(midd)，alpers样综合征，慢性进行性眼外肌麻痹(cpeo)，先天性乳酸性酸中毒(cla)的线粒体dna相关形式，线粒体dna耗竭综合征(mdds)和leigh综合征的线粒体dna相关形式。每种可能性代表本发明的独立实施方式。
35.在某些实施方式中，所述原发性线粒体疾病或障碍与编码线粒体功能所必需的基因产物的核dna中的突变相关。在某些实施方式中，所述与核dna中的突变相关的原发性线粒体疾病或障碍选自线粒体神经胃肠脑病(mngie)综合征，alpers综合征，弗里德希氏共济失调(fa)，进行性眼外肌麻痹(peo)，铁粒幼细胞性贫血，共济失调性神经病变综合征(ans)，孟德尔神经变性线粒体病，3
‑
甲基戊烯二酸尿症(meg)伴耳聋(d)、脑病(e)和leigh样病(l)综合征(megdel)，sengers综合征，微小病变型肾病综合征(mcns)，先天性乳酸性酸中毒(cla)的核dna相关形式，线粒体dna耗竭综合征(mdds)和leigh综合征的核dna相关形式。每种可能性代表本发明的独立实施方式。
36.在某些实施方式中，所述原发性线粒体疾病或障碍与选自肾、脑、肌肉、胰腺、眼及其任何组合的器官相关。每种可能性代表本发明的独立实施方式。
37.在某些实施方式中，所述线粒体功能受损的症状选自行走能力受损、运动技能受损、语言技能受损、记忆受损、体重增加受损、成长停滞、血液碱性磷酸酶水平低、血镁水平低、血液肌酐水平高、血液碳酸氢盐水平低、血液碱过量水平低、尿液葡萄糖/肌酐比率高、尿液氯化物/肌酐比率高、尿液钠/肌酐比率高、血液乳酸水平高、尿液镁/肌酐比率高、尿液钾/肌酐比率高、尿液钙/肌酐比率高、糖尿、镁尿、血液尿素水平高、c
‑
肽水平低、hba1c评分高、甲状旁腺功能减退、上睑下垂、听觉损失、心脏传导障碍、癫痫发作、中风样发作、eeg受损、血液ast/alt高、淋巴细胞中atp含量和氧消耗量低。每种可能性代表本发明的独立实施方式。
38.在某些实施方式中，所述药物组合物被给药到特定组织或器官。
39.在某些实施方式中，所述药物组合物通过系统性给药来给药。在某些实施方式中，所述药物组合物包含约106个线粒体富化的人类干细胞/千克患者体重。在某些实施方式中，所述药物组合物包含总共约5x105至5x109个线粒体富化的人类干细胞。
40.在某些实施方式中，线粒体富化的人类干细胞具有下述中的至少一个者：相对于线粒体富集之前的干细胞中的相应水平(i)提高的线粒体dna含量；(ii)提高的cs活性水平；(iii)提高的选自sdha和cox1的至少一种线粒体蛋白的含量；(iv)提高的o2消耗速率；(v)提高的atp生产速率；或(vi)其任何组合。每种可能性代表本发明的独立实施方式。
41.在某些实施方式中，所述人类干细胞在用所述外源线粒体富集之前获自或源自于所述患者。在某些实施方式中，所述人类干细胞在用所述外源线粒体富集之前获自或源自于与所述患者不同的供体。
42.在某些实施方式中，所述干细胞的供体与所述患者至少部分hla匹配。
43.在某些实施方式中，线粒体富化的人类干细胞是线粒体富化的人类祖细胞。在某些实施方式中，线粒体富化的人类干细胞是造血干细胞。在某些实施方式中，线粒体富化的人类干细胞是间充质干细胞。在某些实施方式中，线粒体富化的人类干细胞是多能干细胞
(psc)或诱导性多能干细胞(ipsc)。
44.在某些实施方式中，在将所述冻融过的健康的功能性人类外源线粒体引入到人类干细胞中之前，所述人类干细胞已经历至少一个冻融循环。在某些实施方式中，所述方法包括(a)冷冻所述人类干细胞，(b)融化所述人类干细胞，和(c)将冻融过的健康的功能性外源线粒体引入到所述人类干细胞中。
45.在某些实施方式中，所述人类干细胞从骨髓的细胞分离、衍生或获得。在其他实施方式中，所述人类干细胞从脂肪组织、口腔粘膜、皮肤成纤维细胞、血液或脐带血分离、衍生或获得。每种可能性代表本发明的独立实施方式。
46.在某些实施方式中，所述健康的功能性外源线粒体从胎盘、在培养物中生长的胎盘细胞或血细胞分离或获得。每种可能性代表本发明的独立实施方式。在某些实施方式中，所述健康的功能性外源线粒体从人类胎盘、在培养物中生长的人类胎盘细胞或人类血细胞分离或获得。每种可能性代表本发明的独立实施方式。
47.在某些实施方式中，所述人类干细胞在用所述健康的功能性人类外源线粒体富集之后已经历至少一个冻融循环。在某些实施方式中，上述方法在将所述富集有健康的功能性外源线粒体的人类干细胞给药到所述患者之前还包括下述另外的步骤：(a)冷冻所述富集有健康的功能性外源线粒体的人类干细胞，和(b)融化所述富集有健康的功能性外源线粒体的人类干细胞。
48.在某些实施方式中，所述健康的功能性外源线粒体占总线粒体的5％至30％之间。在某些实施方式中，所述健康的功能性外源线粒体占总线粒体的至少10％并少于30％。在某些实施方式中，所述健康的功能性外源线粒体占总线粒体的至少10％并少于25％。
49.另一方面，本发明还提供了一种使人类干细胞富集有健康的功能性人类外源线粒体的离体方法，所述方法包括下述步骤：(i)提供第一组合物，其包含来自于患有线粒体疾病、障碍或其症状的患者或来自于供体的多个分离的或部分纯化的人类干细胞；(ii)提供第二组合物，其包含从在线粒体dna中没有致病突变的供体获得的多个分离的、冻融过的健康的功能性人类外源线粒体；(iii)将所述第一组合物的人类干细胞与所述第二组合物的冻融过的健康的功能性人类外源线粒体以0.088
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176mu cs活性/106个干细胞的比率相接触，从而提供第三组合物；以及(iv)将所述第三组合物在允许所述冻融过的健康的功能性人类外源线粒体进入所述人类干细胞的条件下温育，从而使所述人类干细胞富集有所述健康的功能性人类外源线粒体，由此提供包含线粒体富化的人类干细胞的第四组合物；其中所述第四组合物的总线粒体包含至少3％并少于33％的所述健康的功能性人类外源线粒体。
50.在某些实施方式中，允许健康的功能性人类外源线粒体进入人类干细胞的所述条件包括将所述人类干细胞与所述健康的功能性人类外源线粒体在16至37℃范围内的温度下温育0.5至30小时范围内的时间。在某些实施方式中，所述允许健康的功能性人类外源线粒体进入人类干细胞的条件包括将所述人类干细胞与所述健康的功能性人类外源线粒体在培养基中，在支持细胞存活的环境下，在16至37℃范围内的温度下温育0.5至30小时范围内的时间。根据某些实施方式，所述培养基是含有人血清白蛋白的盐水。在某些实施方式中，所述用于温育的条件包括含有5％co2的气氛。在某些实施方式中，所述用于温育的条件不包括添加高于空气中存在的水平的co2。
51.在某些实施方式中，所述方法还包括在温育之前、期间或之后离心所述人类干细胞和健康的功能性外源线粒体。在某些实施方式中，在温育之前所述方法还包括将所述人类干细胞和健康的功能性人类外源线粒体以高于2500xg的离心力单次离心。
52.在某些实施方式中，与未经历冻融循环的对照线粒体相比，所述已经历冻融循环的线粒体在融化后表现出可比的氧消耗速率。
53.在某些实施方式中，上述方法还包括冷冻线粒体富化的人类干细胞，并任选地还包括融化线粒体富化的人类干细胞。
54.在另外的实施方式中，在线粒体增强之前或之后将所述人类干细胞扩增。
55.在某些方面和实施方式中，本发明提供了一种组合物，其包含通过上文描述的方法在其各种不同实施方式中获得的多个富集有健康的功能性外源线粒体的人类干细胞，其中所述健康的功能性外源线粒体占线粒体富化的人类干细胞中总线粒体的至少3％并少于33％。
56.另一方面，本发明还提供了一种在需要治疗的人类患者中治疗原发性线粒体疾病或障碍或其症状的方法，所述方法包括向所述患者给药包含上述线粒体富化的人类干细胞的药物组合物的步骤。
57.本发明的其他实施方式和完整的适用性范围将从后文中给出的详细描述变得显而易见。然而应该理解，所述详细描述和特定实例尽管指示了本发明的优选实施方式，但仅仅是为了说明而提供，因为对于本领域技术人员来说，从该详细描述，在本发明的精神和范围之内的各种不同改变和修改将变得显而易见。对于本领域技术人员来说，通过将常规和传统方法与在本申请的剩余部分中参考附图所阐述的本发明的某些方面进行比较，这些系统的其他限制和缺点将变得显而易见。
附图说明
58.图1示出了通过荧光共聚焦显微术获得的与从hela
‑
turbogfp
‑
线粒体细胞分离的gfp标记的线粒体温育过的cd34
+
细胞的显微照片。
59.图2a是条形图，示出了与未处理的细胞(nt)相比，在将fvb/n骨髓细胞与各种不同浓度(0.044、0.44、0.88、2.2、4.4、8.8、17.6毫单位cs活性)的来自于c57bl小鼠的外源线粒体温育后，所述细胞中c57bl mtdna的拷贝数。
60.图2b是条形图，示出了与未处理的细胞(nt)相比，在将fvb/n骨髓细胞与各种不同浓度(0.044、0.44、0.88、2.2、4.4、8.8、17.6毫单位cs活性)的来自于c57bl小鼠的外源线粒体温育后，所述细胞中mtdna编码的(cox1)蛋白的含量，所述含量被归一化到janus水平。
61.图2c是条形图，示出了与未处理的细胞(nt)相比，在将fvb/n骨髓细胞与各种不同浓度(0.044、0.44、0.88、2.2、4.4、8.8、17.6毫单位cs活性)的来自于c57bl小鼠的外源线粒体温育后，所述细胞中核编码的(sdha)蛋白的含量，所述含量被归一化到janus水平。
62.图3a是条形图，示出了在用增加量的gfp标记的线粒体富集后，鼠类bm细胞中cs活性的比较。
63.图3b是条形图，示出了在这些细胞中细胞色素c还原酶活性(黑色条)与gfp标记的线粒体中的活性(灰色条)的比较。
64.图4是条形图，示出了在富集有来自于c57bl小鼠的外源线粒体的骨髓细胞的iv注
射后的各个不同时间点，fvb/n小鼠的骨髓中的c57bl mtdna水平。
65.图5是点阵图，示出了在用两个不同的胎盘来源的线粒体批次(plc1和plc2)mat后，健康供体cd34
+
细胞中的胎盘单倍群百分率。
66.图6a是条形图，示出了在对照的未处理的人类bm细胞和离心或未离心的与从人类胎盘细胞分离的gfp标记的线粒体温育过的人类bm细胞中cs活性的比较。
67.图6b是条形图，示出了在对照的未处理的人类bm细胞和离心的与从人类胎盘细胞分离的gfp标记的线粒体温育过的人类bm细胞中atp水平的比较。
68.图7a是皮尔逊综合症患者脐带血细胞中mtdna缺失的图示说明以及示出了所述缺失的dna印迹分析。
69.图7b是条形图，示出了与用未增强的脐带血细胞(ucb)注射的小鼠相比，在使用富集有人类线粒体的皮尔逊综合症的脐带血细胞(ucb+mito)的线粒体增强疗法后2个月nsgs小鼠的骨髓中的人类mtdna拷贝数。
70.图8是条形图，示出了在富集有从c57/bl胎盘获得的健康功能性线粒体的干细胞给药后1个月，fvb/n小鼠的骨髓中fvb/n atp8突变的mtdna的水平。
71.图9a是本发明提供的皮尔逊综合症(ps)患者的不同治疗阶段的计划图。
72.图9b是条形图，示出了通过本发明中提供的方法治疗的ps患者的met评分在疗法之前和之后随时间的变化。
73.图9c是条形图，示出了在通过本发明中提供的方法治疗的ps患者的血液中发现的乳酸盐水平在疗法之前(b)和之后随时间的变化。
74.图9d是线图，示出了通过本发明中提供的方法治疗的ps患者的体重和身高的标准偏差评分在疗法之前和之后随时间的变化。
75.图9e是线图，示出了通过本发明中提供的方法治疗的ps患者的碱性磷酸酶(alp)水平在疗法之前和之后随时间的变化。
76.图9f是线图，示出了在本发明提供的疗法之前和之后，ps患者中血液红细胞(rbc)水平的长期升高。
77.图9g是线图，示出了在本发明提供的疗法之前和之后，ps患者中血液血红蛋白(hgb)水平的长期升高。
78.图9h是线图，示出了在本发明提供的疗法之前和之后，ps患者中血液血细胞比容(hct)水平的长期升高。
79.图9i是条形图，示出了在镁增补之前和之后，在通过本发明中提供的方法治疗的ps患者中血液镁的水平在疗法之前和之后随时间的变化。
80.图9j是线图，示出了通过本发明中提供的方法治疗的ps患者的肌酐水平在疗法之前和之后随时间的变化。
81.图9k是线图，示出了通过本发明中提供的方法治疗的ps患者的碳酸氢盐水平在疗法之前和之后随时间的变化。
82.图9l是线图，示出了通过本发明中提供的方法治疗的ps患者的碱过量水平在疗法之前和之后随时间的变化。
83.图9m是条形图，示出了在通过本发明中提供的方法治疗的ps患者的尿液中葡萄糖与肌酐的比率在疗法之前和之后随时间的变化。
84.图9n是条形图，示出了在通过本发明中提供的方法治疗的ps患者的尿液中钾与肌酐的比率在疗法之前和之后随时间的变化。
85.图9o是条形图，示出了在通过本发明中提供的方法治疗的ps患者的尿液中氯化物与肌酐的比率在疗法之前和之后随时间的变化。
86.图9p是条形图，示出了在通过本发明中提供的方法治疗的ps患者的尿液中钠与肌酐的比率在疗法之前和之后随时间的变化。
87.图10a是线图，示出了在通过本发明中提供的方法治疗的3位ps患者(pt.1、pt.2和pt.3)中正常mtdna的含量在疗法之前和之后随时间的变化，其通过数字pcr来测量被缺失区域(在每位患者中)，与代表每个细胞的正常mtdna数量的18s基因组dna进行比较，并根据基线进行归一化。
88.图10b是线图，示出了在mat后的基线处，3位ps患者(pt.1、pt.2和pt.3)中的异质性水平(存在缺失的mtdna与总mtdna相比)。虚线表示每位患者的基线。
89.图11a是由本发明进一步提供的皮尔逊综合症(ps)患者的不同治疗阶段的另一个计划图。
90.图11b是条形图，示出了在通过本发明中提供的方法治疗的ps患者的血液中乳酸盐水平在疗法之前(b)和之后随时间的变化。
91.图11c是条形图，示出了通过本发明中提供的方法治疗的ps患者的坐立试验评分在疗法之前和之后随时间的变化。
92.图11d是条形图，示出了通过本发明中提供的方法治疗的ps患者的6分钟行走试验评分在疗法之前和之后随时间的变化。
93.图11e是条形图，示出了通过本发明中提供的方法治疗的ps患者的三次连续重复(r1、r2、r3)的测力计评分在疗法之前和之后随时间的变化。
94.图11f是条形图，示出了在通过本发明中提供的方法治疗的ps患者中尿液镁与肌酐的比率在疗法之前和之后随时间的变化。
95.图11g是条形图，示出了在通过本发明中提供的方法治疗的ps患者中尿液钾与肌酐的比率在疗法之前和之后随时间的变化。
96.图11h是条形图，示出了在通过本发明中提供的方法治疗的ps患者中尿液钙与肌酐的比率在疗法之前和之后随时间的变化。
97.图11i是条形图，示出了在通过本发明中提供的方法治疗的ps患者的尿液中atp8与18s拷贝数的比率在疗法之前和之后随时间的变化。
98.图11j是条形图，示出了在通过本发明中提供的方法治疗的ps患者的淋巴细胞中atp水平在疗法之前和之后随时间的变化。
99.图12a是由本发明进一步提供的皮尔逊综合症(ps)患者和kearns
‑
sayre综合征(kss)患者的不同治疗阶段的又一个计划图。
100.图12b是条形图，说明了在通过本发明中提供的方法治疗的ps患者的血液中乳酸盐的水平在疗法之前(b)和之后随时间的变化。
101.图12c是条形图，示出了通过本发明中提供的方法治疗的ps患者的ast和alt水平在疗法之前和之后随时间的变化。
102.图12d是条形图，示出了通过本发明中提供的方法治疗的ps患者的甘油三酯、总胆
固醇和vldl胆固醇水平在疗法之前和之后随时间的变化。
103.图12e是条形图，示出了通过本发明中提供的方法治疗的ps患者的血红蛋白a1c(hba1c)评分在疗法之前和之后随时间的变化。
104.图12f是线图，示出了通过本发明提供的方法治疗的ps患者(pt.3)的坐立试验评分在疗法之前和之后随时间的变化。
105.图12g是线图，示出了通过本发明提供的方法治疗的ps患者(pt.3)的6分钟行走试验评分在疗法之前和之后随时间的变化。
106.图13是条形图，示出了在疗法之前和之后，通过本发明提供的方法治疗的kss患者的外周血中的atp含量。
具体实施方式
107.本发明提供了用于治疗显著量的外源功能性健康线粒体的靶向和/或系统性递送的细胞平台，更具体来说是干细胞平台。本发明还提供了生产此类细胞平台的方法和将它们用于治疗线粒体疾病的方法。
108.现在已首次显示，即使是适度地富集有健康的功能性外源线粒体的人类干细胞，也能在患有多样化病理的线粒体疾病和障碍的患者中实现健康的功能性线粒体向器官、组织和细胞的体内系统性递送。
109.提供适度富集有功能性线粒体的干细胞能够在人类中实现到目前为止尚未获得的原发性线粒体疾病的改进的疗法。例如，与线粒体dna中的突变相关的原发性线粒体疾病如皮尔逊综合症(ps)和kearns
‑
sayre综合征(kss)，现在可以通过将仅仅适度富集有功能性线粒体的干细胞移植到受疾病影响的组织或器官中来治疗，导致所述疾病的长期消除。在所述受疾病影响的细胞是干细胞本身的情况下，给药的经富集的干细胞可能代替所述受影响的细胞，同样导致所述疾病的长期消除。在其他实例中，在所述原发性线粒体疾病与核dna中的突变相关并且所述受影响的细胞是干细胞或源自于干细胞的情况下，给药的干细胞可以代替所述受影响的细胞，同样导致所述疾病的长期消除。应该强调的是，本发明首次提供了基于干细胞的手段和方法，用于在人类中持续矫正原发性线粒体疾病的病理状态并长期消除这些疾病，需要的仅仅是在给药之前对这些细胞进行低度到适度的线粒体富集。
110.本发明还基于几项令人吃惊的发现，其中一项发现是线粒体富化的人类干细胞的单次给药就足以使人类患者的总体生理和认知状态，包括器官例如肾、肝、脑、肌肉的胰腺的功能改善至少一年，正如由各种不同的临床参数的结果所确定的，而不需重复的干预。尽管单轮疗法足以在各种不同的器官和症状中获得长期效果，但仍存在着需要更多轮的治疗以维持至少一部分这些效果的可能性。
111.一方面，本发明提供了一种在需要治疗的对象中治疗原发性线粒体疾病、障碍或其症状的方法，所述方法包括将包含多个干细胞的药物组合物给药到所述患者的步骤，其中所述干细胞被富集有在线粒体dna中没有致病突变的健康的功能性外源线粒体。在某些实施方式中，所述对象是哺乳动物对象并且所述干细胞是哺乳动物干细胞。在某些实施方式中，所述对象是人类对象并且所述干细胞是人类干细胞。
112.另一方面，本发明提供了一种用于在需要治疗的人类患者中治疗原发性线粒体疾病、障碍或其症状的药物组合物，所述组合物包含富集有冻融过的、在线粒体dna中没有致
病突变的健康的功能性外源线粒体多个人类干细胞，其中所述健康的功能性外源线粒体占线粒体富化的人类干细胞中总线粒体的至少3％并少于33％。
113.在某些实施方式中，所述药物组合物包含至少105至4x107个线粒体富化的人类干细胞/千克患者体重。在某些实施方式中，所述药物组合物包含至少105至2x107个线粒体富化的人类干细胞/千克患者体重。在某些实施方式中，所述药物组合物包含至少5x105至1.5x107个线粒体富化的人类干细胞/千克患者体重。在某些实施方式中，所述药物组合物包含至少106至107个线粒体富化的人类干细胞/千克患者体重。在其他实施方式中，所述药物组合物包含至少105或至少106个线粒体富化的人类干细胞/千克患者体重。每种可能性代表本发明的独立实施方式。在某些实施方式中，所述药物组合物包含总共至少5x105直至5x109个线粒体富化的人类干细胞。在某些实施方式中，所述药物组合物包含总共至少106直至109个线粒体富化的人类干细胞。在其他实施方式中，所述药物组合物包含总共至少2x106直至5x108个线粒体富化的人类干细胞。
114.另一方面，本发明提供了一种组合物，其包含富集有健康的功能性外源线粒体的多个人类cd34
+
干细胞，其中所述健康的功能性外源线粒体占线粒体富化的人类cd34
+
干细胞中总线粒体的至少3％并少于33％。
115.另一方面，本发明提供了一种用于治疗原发性线粒体疾病或障碍或其症状的药物组合物，其中所述药物组合物包含富集有健康的功能性外源线粒体的多个人类cd34
+
干细胞，其中所述健康的功能性外源线粒体占线粒体富化的人类cd34
+
干细胞中总线粒体的至少3％并少于33％。当在本文中使用时，术语“方法”是指用于实现给定任务的方式、手段、技术和程序，包括那些为化学、制药学、生物学、生物化学和医学领域的从业人员已知或容易从已知的方式、手段、技术和程序开发的方式、手段、技术和程序。
116.当在本文中使用时，术语“治疗”包括与疾病或病症相关或由其引起的至少一种症状的减轻、缓和或改善。当在本文中使用时，术语“治疗”还包括预防性(例如预防)、姑息性和治愈性治疗。
117.当在本文中使用时，术语“药物组合物”是指包含至少一种生物活性药剂的任何组合物。当在本文中使用时，术语“药物组合物”还是指包含待递送到对象以例如实现治疗、预防、诊断、阻止或预后效果的活性药物成分的组合物。当在本文中使用时，术语“药物组合物”还是指包含人类干细胞，任选地还包含将其中的细胞维持在存活状态下的介质或载体的任何组合物。在某些实施方式中，所述药物组合物包含活性药物成分和可药用载体。当在本文中使用时，术语“可药用载体”包括生理上相容的任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌和抗真菌剂、等渗和吸收延迟剂等。可药用载体的实例包括水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、右旋糖、甘油、乙醇等中的一者或多者及其组合。
118.当在本文中使用时，术语“生物活性药剂”是指能够在生物系统例如活细胞、组织、器官和人类中引发响应的任何分子。根据本发明的生物活性药剂的非限制性实例包括细胞、完整线粒体、线粒体dna和线粒体蛋白。根据本发明的原理，富集有在线粒体dna中没有致病突变的健康的功能性外源线粒体的多个人类干细胞是生物活性药剂。
119.当在本文中使用时，术语“干细胞”通常是指任何类型的干细胞。干细胞是未分化的细胞，其可以分化成其他类型的细胞并且可以分裂以产生更多相同类型的干细胞。干细胞可以是全能或多能的。当在本文中使用时，术语“人类干细胞”通常是指人类中天然存在
的所有干细胞，以及离体产生或衍生并与人类相容的所有干细胞。与干细胞相同，“祖细胞”具有分化成特定类型细胞的倾向性，但已经比干细胞更加特异，并被推向分化成它的“靶”细胞。干细胞与祖细胞之间的最重要区别在于干细胞可以无限复制，而祖细胞只能分裂有限的次数。当在本文中使用时，术语“人类干细胞”还包括“祖细胞”和“未完全分化的干细胞”。
120.根据本发明的原理，在给药到需要的患者之前使干细胞富集有健康的功能性外源线粒体，以便提高它们中的线粒体的数目和/或功能。不受任何理论或机制限制，所述给药的干细胞中线粒体数目和/或功能的提高在人类患者中造成了本文中首次示例的各种不同的治疗效果。
121.术语“功能性线粒体”、“健康的线粒体”、“健康的功能性线粒体”和“健康的功能性外源线粒体”在本文中可互换使用，并且是指在线粒体dna中没有致病突变的的线粒体，它们表现出正常的、非病理性的活性水平。线粒体的活性可以通过本领域中公知的各种不同方法来度量，例如高氯酸四甲基罗丹明乙酯(tmre)染色、o2消耗量、atp产量和cs活性水平。
122.在下文中示例的实施方式中，所述线粒体是人类线粒体。
123.术语“健康供体”和“健康对象”可互换使用，并且是指未患有待治疗的疾病或病症的对象。
124.在某些实施方式中，所述健康的功能性外源线粒体是同系或同种异体的。
125.当在本文中使用时，术语“富集”是指离体进行的、提高人类细胞的线粒体含量例如完整的功能性健康线粒体的数目的任何行动。根据本发明的原理，将健康的功能性外源线粒体引入到人类干细胞中，由此使这些细胞富集有健康的功能性外源线粒体。应该理解，这种富集改变了所述人类干细胞的线粒体含量：原初人类干细胞基本上具有一个宿主/自体/内源线粒体群体，而富集有外源线粒体的人类干细胞基本上具有两个线粒体群体——一个群体是宿主/自体/内源线粒体，另一个群体是引入的线粒体(即外源线粒体)。因此，术语“富集有”是指所述细胞在接受/并入外源线粒体后的状态。确定所述两个线粒体群体的数目和/或其间的比率是直截了当的，因为所述两个群体在几个方面例如在它们的线粒体dna方面存在差异。因此，短语“富集有健康的功能性人类线粒体的人类干细胞”等同于短语“包含内源线粒体和健康的功能性外源线粒体的人类干细胞”。例如，包含总线粒体的至少1％并少于33％的健康的功能性外源线粒体的人类干细胞，被认为以99:1的比例至67:33的比例包含宿主/自体/内源线粒体和健康的功能性外源线粒体。例如，“总线粒体的3％”意味着在富集后所述原始的(内源)线粒体含量为总线粒体的97％，并且所述引入的(外源)线粒体为总线粒体的3％，这等同于(3/97＝)3.1％的富集。另一个实例“总线粒体的33％”意味着在富集后所述原始的(内源)线粒体含量为总线粒体的67％，并且所述引入的(外源)线粒体为总线粒体的33％，这等同于(33/67＝)49.2％的富集。
126.在某些实施方式中，所述健康的功能性外源线粒体占所述干细胞中总线粒体的至少1％并少于33％。在某些实施方式中，所述健康的功能性外源线粒体占总线粒体的约1％、3％、5％、7％、10％、15％或20％至约25％、27％、29％或31％之间。每种可能性代表本发明的独立实施方式。当在本文中使用时，术语“约”意味着高于或低于给定数目10％。例如，约10％意味着9％、9％至11％、或11％。通常，本文中使用的数值是指所述指定数值的
±
10％。
127.在某些实施方式中，所述健康的功能性外源线粒体占所述干细胞的总线粒体的至
少1％，其中所述干细胞不是骨髓细胞或从其衍生或得到的细胞。在某些实施方式中，所述健康的功能性外源线粒体占所述干细胞的总线粒体的约1％至约99％及其任何子范围之间，其中所述干细胞不是骨髓细胞或从其衍生或得到的细胞。在某些实施方式中，所述健康的功能性外源线粒体占所述干细胞的总线粒体的至少约1％、3％、5％、7％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％，其中所述干细胞不是骨髓细胞或从其衍生或得到的细胞。每种可能性代表本发明的独立实施方式。
128.所述干细胞富集功能性线粒体的程度可以通过功能和/或酶测定法来确定，包括但不限于氧(o2)消耗速率、柠檬酸合酶的含量或活性水平、三磷酸腺苷(atp)的生产速率。在可选方案中，所述干细胞用健康供体线粒体的富集可以通过所述供体的线粒体dna的检测来确认。根据某些实施方式，所述干细胞富集功能性线粒体的程度可以通过异质性变化的水平和/或通过每个细胞的mtdna拷贝数来确定。每种可能性代表本发明的独立实施方式。
129.tmrm(四甲基罗丹明甲酯)或相关的tmre(四甲基罗丹明乙酯)是细胞穿透性产荧光染料，常用于通过鉴定线粒体膜电位的变化来评估活细胞中的线粒体功能。根据某些实施方式，所述富集水平可以通过用tmre或tmrm染色来确定。根据某些实施方式，所述干细胞用健康的功能性线粒体的富集可以通过本领域中公知的常规测定法来确定。在某些实施方式中，线粒体富化的人类干细胞中的线粒体富集水平通过下述水平来确定：(i)宿主/内源线粒体dna和外源线粒体dna的水平；(ii)选自柠檬酸合酶(cs)、cox1、sdha的线粒体蛋白及其任何组合的水平；(iii)cs活性水平；或(iv)(i)、(ii)和(iii)的任何组合。每种可能性代表本发明的独立实施方式。在某些实施方式中，线粒体富化的人类干细胞中的线粒体富集水平通过下述中的至少一者来确定：(i)在同种异体线粒体的情况下宿主(内源)缺陷性线粒体dna和健康的外源线粒体dna的水平；(ii)柠檬酸合酶活性的水平；(iii)琥珀酸脱氢酶复合物黄素蛋白亚基a(sdha)或细胞色素c氧化酶(cox1)蛋白的水平；(iv)氧(o2)消耗速率；(v)三磷酸腺苷(atp)的生产速率；或(vi)其任何组合。每种可能性代表本发明的独立实施方式。
130.应该理解，当在本文中使用时，短语“富集有健康的功能性外源线粒体的人类干细胞”是指包含健康的功能性线粒体的人类干细胞，其中所述健康的功能性线粒体与所述人类干细胞具有不同的起源，即这些线粒体从外部来源获得/衍生/分离。人类干细胞中“外源”、“外来”或“非原始”的健康的功能性线粒体的存在充当这些细胞富集有所述线粒体的证据。本领域普通技术人员将知道如何在本领域中公知的方法的基础上确定人类干细胞包含来自于不同起源的外源线粒体(参见例如zander j.等，forensic sci.int.genet.,2017,vol.29，第242
‑
249页)。这些方法可以基于例如人类干细胞内或多个人类干细胞内不同线粒体群体之间的遗传差异。例如，在人类中，线粒体dna编码37个基因(nature.290(5806):457
–
65)，因此通过测序所述mtdna，人们可以容易地确定人类干细胞内或多个人类干细胞内1、2或更多个不同mtdna群体的存在。在某些实施方式中，线粒体富化的人类干细胞中的线粒体富集水平，通过对所述细胞中总线粒体dna的至少统计学代表性部分进行测序并确定宿主/内源线粒体dna和外源线粒体dna的相对水平来确定。在某些实施方式中，线粒体富化的人类干细胞中的线粒体富集水平通过单核苷酸多态性(snp)分析来确定。在某
些实施方式中，所述最大的线粒体群体和/或最大的线粒体dna群体是所述宿主/内源线粒体群体和/或宿主/内源线粒体dna群体；和/或所述第二大的线粒体群体和/或第二大的线粒体dna群体是所述外源线粒体群体和/或外源线粒体dna群体。每种可能性代表本发明的独立实施方式。
131.在某些实施方式中，所述干细胞用健康的功能性人类外源线粒体的富集包括在将所述人类干细胞与所述健康的功能性人类外源线粒体温育后清洗线粒体富化的干细胞。这个步骤提供了线粒体富化的干细胞的组合物，其基本上不含细胞碎片或线粒体膜残留物和未进入所述干细胞的线粒体。在某些实施方式中，清洗包括在将所述人类干细胞与所述健康的功能性人类外源线粒体温育后离心线粒体富化的干细胞。根据某些实施方式，将所述包含线粒体富化的人类干细胞的药物组合物与游离线粒体即未进入所述干细胞的线粒体或其他细胞碎片分离开。根据某些实施方式，所述包含线粒体富化的人类干细胞的药物组合物不包含可检测量的游离线粒体。
132.当在本文中和权利要求书中使用时，术语“线粒体疾病”和术语“原发性线粒体疾病”可以互换使用。当在本文中使用时，术语“原发性线粒体疾病”是指通过线粒体dna中的已知或无争议的致病突变或通过核dna的基因中的突变而诊断的线粒体疾病，所述核dna的基因产物被输入到线粒体中。根据某些实施方式，所述原发性线粒体疾病是先天性疾病。根据某些实施方式，所述原发性线粒体疾病不是继发性线粒体功能障碍。术语“继发性线粒体功能障碍”和“获得性线粒体功能障碍”在整个本申请中可互换使用。
133.根据某些实施方式，所述原发性线粒体疾病的特征在于受影响的细胞中亚正常的线粒体参数。根据某些实施方式，所述受影响的细胞具有(i)亚正常的氧(o2)消耗速率；(ii)亚正常的柠檬酸合酶含量或活性水平；(iii)亚正常的三磷酸腺苷(atp)生产速率；或(iv)(i)、(ii)和(iii)的任何组合。
134.当在本文中使用时，术语“亚正常的氧(o2)消耗速率”是指实质性低于对照氧(o2)消耗速率的氧(o2)消耗速率，所述对照氧(o2)消耗速率源自于或对应于在未患有线粒体疾病的对象或多个对象的相应细胞或相应线粒体中发现的氧(o2)消耗速率。
135.当在本文中使用时，术语“亚正常的柠檬酸合酶含量或活性水平”是指实质性低于对照柠檬酸合酶含量值或活性水平的柠檬酸合酶含量或活性水平，所述对照柠檬酸合酶含量值或活性水平源自于或对应于未患有线粒体疾病的对象或多个对象的柠檬酸合酶的含量或活性水平。
136.当在本文中使用时，术语“亚正常的三磷酸腺苷(atp)生产速率”是指实质性低于对照三磷酸腺苷(atp)生产速率的三磷酸腺苷(atp)生产速率，所述对照三磷酸腺苷(atp)生产速率源自于或对应于在未患有线粒体疾病的对象或多个对象的相应细胞或相应线粒体中发现的三磷酸腺苷(atp)生产速率。
137.在某些实施方式中，本文中使用的术语“实质性低于”是指低于正常值的在统计学上显著的降低。在某些实施方式中，本文中使用的术语“实质性低于”是指病理性降低，即降低到其中与所述实质性较低值相关的至少一种病理学症状变得显而易见的水平。
138.在某些实施方式中，本文中使用的术语“亚正常”是指比在未患有线粒体疾病的对象或多个对象的相应细胞或相应线粒体中发现的相应值低至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍或至少10倍的值。每种可能性代表本发明的独
立实施方式。
139.在某些实施方式中，所述原发性线粒体疾病或障碍与线粒体dna中的突变相关。当在本文中使用时，短语“与线粒体dna中的突变相关”通常意味着所述线粒体疾病或障碍的病因至少部分可操作地连接到线粒体dna中为线粒体分子编码的编码区中的突变或一组突变。
140.在某些实施方式中，所述与线粒体dna中的突变相关的线粒体疾病或障碍选自皮尔逊综合症(ps)，kearns
‑
sayre综合征(kss)，线粒体脑病乳酸性酸中毒和中风样发作(melas)综合征，leber遗传性视神经病变(lhon)，神经病、共济失调和色素性视网膜炎(narp)综合征，肌阵挛性癫痫伴蓬毛样红纤维(merrf)综合征，母体遗传性糖尿病和耳聋(midd)，alpers样综合征，慢性进行性眼外肌麻痹(cpeo)，先天性乳酸性酸中毒(cla)的线粒体dna相关形式，线粒体dna耗竭综合征(mdds)和leigh综合征的线粒体dna相关形式。每种可能性代表本发明的独立实施方式。
141.在某些实施方式中，所述原发性线粒体疾病或障碍与核dna中的突变相关。当在本文中使用时，短语“与核dna中的突变相关”通常意味着所述线粒体疾病或障碍的病因至少部分可操作地连接到核dna中为线粒体分子编码的编码区中的突变或一组突变。术语“线粒体分子”通常是指被递送到健康的功能性线粒体中和/或在其中有活性和/或存在于其中的任何分子。这些分子可以是核酸分子、蛋白质分子、酶分子等。在某些实施方式中，所述原发性线粒体疾病或障碍与核dna的直接编码oxphos蛋白或通过影响运转oxphos过程所需的复杂机制的产生而间接影响oxphos功能的基因中的突变相关。
142.在某些实施方式中，所述与核dna中的突变相关的原发性线粒体疾病或障碍选自线粒体神经胃肠脑病(mngie)综合征，alpers综合征，弗里德希氏共济失调(fa)，进行性眼外肌麻痹(peo)，铁粒幼细胞性贫血，共济失调性神经病变综合征(ans)，孟德尔神经变性线粒体病，3
‑
甲基戊烯二酸尿症(meg)伴耳聋(d)、脑病(e)和leigh样病(l)(megdel)综合征，sengers综合征，微小病变型肾病综合征(mcns)，先天性乳酸性酸中毒(cla)的核dna相关形式，线粒体dna耗竭综合征(mdds)和leigh综合征的核dna相关形式。每种可能性代表本发明的独立实施方式。
143.在某些实施方式中，所述ans选自线粒体隐性共济失调综合征(miras)，脊髓小脑共济失调伴癫痫(scae)，感觉共济失调神经病构音障碍和眼肌麻痹(sando)和肌阵挛性癫痫肌病感觉共济失调(memsa)。每种可能性代表本发明的独立实施方式。
144.在某些实施方式中，所述线粒体疾病或障碍与获得性线粒体功能障碍相关。当在本文中使用时，短语“与获得性线粒体功能障碍相关”通常意味着所述线粒体疾病或障碍在成年期变得有症状，随着时间推移而加重，和/或不必定可操作地连接到线粒体或核dna中为线粒体分子编码的编码区中的突变或一组突变。
145.在某些实施方式中，所述与获得性线粒体功能障碍相关的线粒体疾病或障碍在成年期变得有症状。在某些实施方式中，所述与获得性线粒体功能障碍相关的线粒体疾病或障碍随着时间推移而加重。在某些实施方式中，所述与获得性线粒体功能障碍相关的线粒体疾病或障碍不是可操作地连接到或仅仅是部分地连接到线粒体或核dna中为线粒体分子编码的编码区中的突变或一组突变。在某些实施方式中，所述患者是成年人。在某些实施方式中，所述患者的年龄超过20岁。在某些实施方式中，所述患者的年龄超过30、40、50、60或
70岁。
146.在某些实施方式中，所述线粒体疾病或障碍与选自肾、肝、脑、肌肉、胰腺、眼及其任何组合的器官相关。在某些实施方式中，所述线粒体疾病或障碍与肾脏相关。在某些实施方式中，所述线粒体疾病或障碍与肝脏相关。在某些实施方式中，所述线粒体疾病或障碍与脑相关。在某些实施方式中，所述线粒体疾病或障碍与肌肉相关。在某些实施方式中，所述线粒体疾病或障碍与心脏相关。在某些实施方式中，所述线粒体疾病或障碍与胰腺相关。在某些实施方式中，所述线粒体疾病或障碍与眼相关。
147.在某些实施方式中，所述症状选自行走能力受损、运动技能受损、语言技能受损、记忆受损、体重增加受损、成长停滞、血液碱性磷酸酶水平低、血镁水平低、血液肌酐水平高、血液碳酸氢盐水平低、血液碱过量水平低、尿液葡萄糖/肌酐比率高、尿液氯化物/肌酐比率高、尿液钠/肌酐比率高、血液乳酸水平高、尿液镁/肌酐比率高、尿液钾/肌酐比率高、尿液钙/肌酐比率高、糖尿、镁尿、血液尿素水平高、c
‑
肽水平低、hba1c水平高、甲状旁腺功能减退、上睑下垂、听觉损失、心脏传导障碍、淋巴细胞中的atp含量和氧消耗量低。每种可能性代表本发明的独立实施方式。应该理解，将症状定义为“高”和“低”分别对应于“可检测地高于正常”和“可检测地低于正常”，其中所述正常水平是未患有线粒体疾病的多个对象中的相应水平。
148.在某些实施方式中，所述药物组合物被给药到特定组织或器官。在某些实施方式中，所述药物组合物包含至少104个线粒体富化的人类干细胞。在某些实施方式中，所述药物组合物包含约104至约108个线粒体富化的人类干细胞。
149.在某些实施方式中，所述药物组合物通过肠胃外给药来给药。在某些实施方式中，所述药物组合物通过系统性给药来给药。在某些实施方式中，所述药物组合物通过静脉内注射给药。在某些实施方式中，所述药物组合物通过静脉输注给药。在某些实施方式中，所述药物组合物包含至少105个线粒体富化的人类干细胞。在某些实施方式中，所述药物组合物包含约106至约108个线粒体富化的人类干细胞。在某些实施方式中，所述药物组合物包含至少约105‑2×
107个线粒体富化的人类干细胞/千克患者体重。在某些实施方式中，所述药物组合物包含至少约105个线粒体富化的人类干细胞/千克患者体重。在某些实施方式中，所述药物组合物包含约105至约2
×
107个线粒体富化的人类干细胞/千克患者体重。在某些实施方式中，所述药物组合物包含约106至约5
×
106个线粒体富化的人类干细胞/千克患者体重。
150.在某些实施方式中，所述人类干细胞在富集之前获自或源自于所述患者。在另外的实施方式中，所述在富集之前获自或源自于所述患者的人类干细胞具有(i)亚正常的氧(o2)消耗速率；(ii)亚正常的柠檬酸合酶含量或活性水平；(iii)亚正常的三磷酸腺苷(atp)生产速率；或(iv)(i)、(ii)和(iii)的任何组合。
151.在某些实施方式中，线粒体富化的人类干细胞在富集之前获自或源自于不同于所述患者的供体。
152.在某些实施方式中，所述供体与所述患者至少部分人类白细胞抗原(hla)匹配。在某些实施方式中，上述方法还包括向所述患者给药阻止、延迟、最小化或废除所述患者与线粒体富化的人类干细胞之间的不利免疫原性反应的药剂的步骤。每种可能性代表本发明的独立实施方式。在某些实施方式中，所述不利免疫原性反应是移植物抗宿主疾病(gvhd)。
153.在某些实施方式中，所述人类干细胞是cd34
+
。在某些实施方式中，所述人类干细胞是造血干细胞。在某些实施方式中，所述人类干细胞是间充质干细胞。在某些实施方式中，所述人类干细胞是多能干细胞(psc)或诱导性多能干细胞(ipsc)。当在本文中使用时，术语“多能干细胞(psc)”是指能够无限繁殖并产生身体中的多种细胞类型的细胞。当在本文中使用时，术语“诱导性多能干细胞(ipsc)”是指可以从人类成年体细胞产生的一类多能干细胞。在某些实施方式中，所述psc是非胚胎干细胞。在特定实施方式中，应该明确地理解人类胚胎干细胞被明确地排除在权利要求的范围之外。当在本文中使用时，术语“胚胎干细胞(esc)”是指源自于囊胚的内部细胞团的一类全能干细胞。全能干细胞是可以产生身体中的每种其他细胞类型的细胞。
154.当在本文中使用时，术语“cd34
+
细胞”是指以cd34阳性为特征的干细胞，不论它们的起源如何。所述术语也指从干细胞获得或从骨髓动员或从脐带血获得的以cd34阳性为特征的造血干细胞。当在本文中使用时，术语“cd34+细胞”是指表达表面标志物蛋白cd34的细胞。cd34的表达可以使用针对cd34的抗体通过免疫荧光分析或facs分析来确定。
155.在某些实施方式中，所述cd34+细胞是脐带细胞。在某些实施方式中，所述cd34+细胞是骨髓细胞。在某些实施方式中，所述cd34+细胞是造血细胞。在某些实施方式中，所述cd34+细胞是间充质干细胞。在某些实施方式中，所述cd34+细胞是内皮祖细胞。在某些实施方式中，所述cd34+细胞是血管的内皮细胞。在某些实施方式中，所述cd34+细胞是肥大细胞。在某些实施方式中，所述cd34+细胞是树突状细胞的子群体(其是因子xiiia阴性的)。在某些实施方式中，所述cd34+细胞是长期造血干细胞(lt
‑
hsc)。在某些实施方式中，所述cd34+细胞是人类hsc细胞。在某些实施方式中，所述cd34+细胞对所述患者来说是同种异体的，其中所述cd34+细胞与所述患者hla匹配。在某些实施方式中，所述cd34+细胞与所述患者hla匹配。在某些实施方式中，所述cd34+细胞对所述患者来说是自体的。
156.在某些实施方式中，线粒体富化的人类干细胞通过将冻融过的健康的功能性外源线粒体引入到所述人类干细胞中来获得。在某些实施方式中，上述方法还包括分离、衍生或获得人类干细胞并将健康的功能性外源线粒体引入到所述人类干细胞中，由此产生线粒体富化的人类干细胞的前期步骤。在某些实施方式中，上述方法还包括在将所述健康的功能性外源线粒体引入到所述人类干细胞中之前从所述细胞中选择cd34阳性细胞的步骤。cd34阳性细胞的选择可以通过本领域中已知的方法包括但不限于clinimacs或prodigy系统(miltenyi)来进行。
157.在某些实施方式中，在将所述冻融过的健康的功能性外源线粒体引入到所述人类干细胞中之前，所述人类干细胞已经历至少一个冻融循环。在某些实施方式中，所述方法包括：(a)冷冻所述人类干细胞，(b)融化所述人类干细胞，和(c)将健康的功能性外源线粒体引入到所述人类干细胞中。
158.在某些实施方式中，所述方法还包括在富集所述健康的功能性外源线粒体之前或之后扩增所述干细胞。在某些实施方式中，所述方法还包括通过将所述第一组合物中的干细胞在能够扩增干细胞的培养基或增殖培养基中培养，来扩增所述细胞。在其他实施方式中，所述方法还包括通过将所述第四组合物中的线粒体富化的干细胞在能够扩增干细胞的培养基或增殖培养基中培养，来扩增所述细胞。当在整个本申请中使用时，术语“培养或增殖培养基”是为细胞提供营养物的流体介质例如细胞培养基、细胞生长培养基、缓冲液。当
在整个本申请和权利要求书中使用时，术语“药物组合物”包含为细胞提供营养物的流体载体例如细胞培养基、细胞生长培养基、缓冲液。
159.根据本发明的原理，在富集健康的功能性外源线粒体之前冷冻人类干细胞的可能性是有益的，因为它在富集健康的功能性外源线粒体之前例如提供了足够的时间以测试所述人类干细胞的某些属性/或提高了所述人类干细胞的储藏寿命和/或允许容易地配送所述人类干细胞。
160.根据本发明的原理，在富集健康的功能性外源线粒体之后冷冻人类干细胞的可能性是有益的，因为它在富集健康的功能性外源线粒体之后例如提供了足够的时间以测试所述富集的人类干细胞的某些属性/或提高了所述富集的人类干细胞的储藏寿命和/或允许容易地配送所述富集的人类干细胞。
161.在某些实施方式中，所述人类干细胞从骨髓的细胞、脂肪组织、口腔粘膜、皮肤成纤维细胞、血液或脐带血分离、衍生或获得。每种可能性代表本发明的独立实施方式。在某些实施方式中，所述人类干细胞不从骨髓或骨髓的细胞分离、衍生或获得。
162.在某些实施方式中，上述方法还包括从适合的来源分离或获取健康的功能性外源线粒体和将所述健康的功能性外源线粒体引入到人类干细胞中，由此产生线粒体富化的人类干细胞的前期步骤。在某些实施方式中，所述方法包括：(a)冷冻所述健康的功能性外源线粒体，(b)融化所述健康的功能性外源线粒体，和(c)将所述健康的功能性外源线粒体引入到所述人类干细胞中。
163.根据本发明的原理，在富集所述人类干细胞之前冷冻健康的功能性外源线粒体的可能性对于线粒体增强疗法过程来说是关键的，因为它在富集所述人类干细胞之前例如提供了足够的时间以测试所述健康的功能性外源线粒体的功能和/或某些属性，以及提高了所述健康的功能性外源线粒体的储藏寿命和/或允许容易地配送所述健康的功能性外源线粒体。
164.不希望受到任何理论或机制限制，与未经历冻融循环的对照线粒体相比，已经历冻融循环的线粒体在融化后表现出可比的氧消耗速率。
165.根据某些实施方式，所述冻融循环包括在融化之前将所述功能性线粒体冷冻至少24小时。根据其他实施方式，所述冻融循环包括在融化之前将所述功能性线粒体冷冻至少1个月、几个月或更长时间。每种可能性代表本发明的独立实施方式。根据另一个实施方式，所述功能性线粒体在所述冻融循环后的氧消耗量等于或高于所述功能性线粒体在所述冻融循环之前的氧消耗量。
166.当在本文中使用时，术语“冻融循环”是指将所述功能性线粒体冷冻到低于0℃的温度，将所述线粒体在低于0℃的温度下维持确定的时间段，并将所述线粒体融化到室温或体温或能够用所述线粒体处理所述干细胞的任何高于0℃的温度。每种可能性代表本发明的独立实施方式。当在本文中使用时，术语“室温”通常是指18℃至25℃之间的温度。当在本文中使用时，术语“体温”是指35.5℃至37.5℃之间的温度，优选为37℃。在另一个实施方式中，已经历冻融循环的线粒体是功能性线粒体。
167.在另一个实施方式中，将所述已经历冻融循环的线粒体在
‑
70℃或更低的温度下冷冻。在另一个实施方式中，将所述已经历冻融循环的线粒体在
‑
20℃或更低的温度下冷冻。在另一个实施方式中，将所述已经历冻融循环的线粒体在
‑
4℃或更低的温度下冷冻。根
据另一个实施方式，所述线粒体的冷冻是逐渐的。根据某些实施方式，线粒体的冷冻通过闪冻进行。当在本文中使用时，术语“闪冻”是指通过使所述线粒体经历超低温而将它们快速冷冻。
168.在另一个实施方式中，将所述经历冻融循环的线粒体在融化之前冷冻至少30分钟。根据另一个实施方式，所述冻融循环包括将所述功能性线粒体在融化之前冷冻至少30、60、90、120、180、210分钟。每种可能性代表本发明的独立实施方式。在另一个实施方式中，将所述已经历冻融循环的线粒体在融化之前冷冻至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、24、48、72、96或120小时。每个冷冻时间代表本发明的独立实施方式。在另一个实施方式中，将所述已经历冻融循环的线粒体在融化之前冷冻至少4、5、6、7、30、60、120、365天。每个冷冻时间代表本发明的独立实施方式。根据另一个实施方式，所述冻融循环包括将所述功能性线粒体在融化之前冷冻至少1、2、3周。每种可能性代表本发明的独立实施方式。根据另一个实施方式，所述冻融循环包括将所述功能性线粒体在融化之前冷冻至少1、2、3、4、5、6个月。每种可能性代表本发明的独立实施方式。
169.在另一个实施方式中，将所述已经历冻融循环的线粒体在融化之前在
‑
70℃冷冻至少30分钟。不希望受到任何理论或机制限制，冷冻线粒体并将它们在长时间段后融化的可能性使得能够容易地储存和使用所述线粒体并获得可重复的结果，即使是在长时间储存后。
170.根据一个实施方式，融化在室温下进行。在另一个实施方式中，融化在体温下进行。根据另一个实施方式，融化在能够按照本发明的方法给药所述线粒体的温度下进行。根据另一个实施方式，融化逐渐地进行。
171.根据另一个实施方式，将所述经历冻融循环的线粒体在冷冻缓冲液内冷冻。根据另一个实施方式，将所述经历冻融循环的线粒体在分离缓冲液内冷冻。当在本文中使用时，术语“分离缓冲液”是指本发明的线粒体在其中被分离的缓冲液。在非限制性实例中，所述分离缓冲液是蔗糖缓冲液。不希望受到任何机制或理论限制，将线粒体在所述分离缓冲液中冷冻节省时间和分离步骤，因为不需要在冷冻之前用冷冻缓冲液代替所述分离缓冲液或在融化后替换所述冷冻缓冲液。
172.根据另一个实施方式，所述冷冻缓冲液包含低温防护剂。根据某些实施方式，所述低温防护剂是糖、寡糖或多糖。每种可能性代表本发明的独立实施方式。根据另一个实施方式，所述冷冻缓冲液中的糖浓度是足以用于保护线粒体功能的糖浓度。根据另一个实施方式，所述分离缓冲液包含糖。根据另一个实施方式，所述分离缓冲液中的糖浓度是足以用于保护线粒体功能的糖浓度。根据另一个实施方式，所述糖是蔗糖。
173.在某些实施方式中，所述健康的功能性外源线粒体从胎盘、在培养物中生长的胎盘细胞或血液细胞分离或获得。每种可能性代表本发明的独立实施方式。
174.根据某些方面，本发明提供了一种在需要治疗的人类患者中治疗原发性线粒体疾病、障碍或其症状的方法，所述方法包括将包含多个人类cd34
+
干细胞的药物组合物给药到所述患者的步骤，其中所述人类cd34
+
干细胞富集有冻融过的、在线粒体dna中没有致病突变的健康的功能性外源线粒体，并且其中所述健康的功能性外源线粒体占线粒体富化的人类cd34
+
干细胞中总线粒体的至少3％并少于33％。
175.另一方面，本发明还提供了一种使人类干细胞富集健康的功能性外源线粒体的离
体方法，所述方法包括下述步骤：(i)提供第一组合物，其包含来自于患有原发性线粒体疾病、障碍或其症状的患者的多个人类干细胞；(ii)提供第二组合物，其包含从在线粒体dna中没有致病突变的供体获得的多个分离的健康的功能性外源线粒体；(iii)将所述第一组合物的人类干细胞与所述第二组合物的健康的功能性外源线粒体相接触，由此提供第三组合物；并且(iv)将所述第三组合物在允许所述健康的功能性外源线粒体进入所述人类干细胞的条件下温育，从而使所述人类干细胞富集所述健康的功能性外源线粒体，由此提供包含线粒体富化的人类干细胞的第四组合物；其中所述健康的功能性外源线粒体占所述第四组合物的总线粒体的至少3％并少于33％。
176.当在本文中使用时，术语“离体方法”是指包括专门在人体外部进行的步骤的任何方法。具体来说，离体方法包括在体外操作细胞，随后将其重新引入或移植到待治疗的对象中。
177.术语“接触”是指使线粒体和细胞的组合物足够接近，以促进所述线粒体进入到所述细胞中。术语将线粒体“引入”到干细胞中可以与术语“接触”互换使用。
178.根据某些实施方式，所述使人类干细胞富集健康的功能性外源线粒体的方法不包括测量所述细胞的膜电位。
179.在某些实施方式中，使所述干细胞富集健康的功能性外源线粒体包括在所述干细胞中引入剂量为至少0.044直至176毫单位cs活性/百万个细胞的线粒体。在某些实施方式中，使所述干细胞富集健康的功能性外源线粒体包括在所述干细胞中引入剂量为至少0.088直至176毫单位cs活性/百万个细胞的线粒体。在其他实施方式中，使所述干细胞富集健康的功能性外源线粒体包括在所述干细胞中引入剂量为至少0.2直至150毫单位cs活性/百万个细胞的线粒体。在其他实施方式中，使所述干细胞富集健康的功能性外源线粒体包括在所述干细胞中引入剂量为至少0.4直至100毫单位cs活性/百万个细胞的线粒体。在某些实施方式中，使所述干细胞富集健康的功能性外源线粒体包括在所述干细胞中引入剂量为至少0.6直至80毫单位cs活性/百万个细胞的线粒体。在某些实施方式中，使所述干细胞富集健康的功能性外源线粒体包括在所述干细胞中引入剂量为至少0.7直至50毫单位cs活性/百万个细胞的线粒体。在某些实施方式中，使所述干细胞富集健康的功能性外源线粒体包括在所述干细胞中引入剂量为至少0.8直至20毫单位cs活性/百万个细胞的线粒体。在某些实施方式中，使所述干细胞富集健康的功能性外源线粒体包括在所述干细胞中引入剂量为至少0.88直至17.6毫单位cs活性/百万个细胞的线粒体。在某些实施方式中，使所述干细胞富集健康的功能性外源线粒体包括在所述干细胞中引入剂量为至少0.9直至15毫单位cs活性/百万个细胞的线粒体。
180.线粒体剂量可以根据cs活性的单位或mtdna拷贝数或本文中所解释的健康的功能性线粒体的量的其他可定量测量值来表示。“cs活性的单位”被定义为能够在1ml反应体积中在1分钟内转化1微摩尔底物的量。
181.另一方面，本发明还提供了一种在需要治疗的人类患者中治疗原发性线粒体疾病或障碍或其症状的方法，所述方法包括将包含上述线粒体富化的人类干细胞的药物组合物给药到所述患者的步骤。
182.当在本文中使用时，短语“从患有线粒体疾病的患者获得的干细胞”是指在从所述患者分离时是所述患者中的干细胞的细胞。
183.当在本文中使用时，短语“源自于患有线粒体疾病的患者的干细胞”是指不是所述患者中的干细胞并且已被操作以变成干细胞的细胞。所述短语还包括某种类型的干细胞，其已被操作以变成不同类型的干细胞。当在本文中使用时，术语“操作”是指使用本领域中已知的方法中的任一者(yu j.等，science,2007,vol.318(5858)，第1917
‑
1920页)将体细胞重编程到未分化的状态并变成诱导性多能干细胞(ipsc)，并任选地进一步将所述ipsc重编程以变成所需谱系或群体的细胞(chen m.等，iovs,2010,vol.51(11)，第5970
–
5978页)，例如骨髓细胞(xu y.等，2012,plos one,vol.7(4)，第e34321页)。
184.当在本文中使用时，术语“患有线粒体疾病的患者”是指被诊断为患有线粒体疾病、被怀疑具有线粒体疾病或在发生线粒体疾病的风险组中的人类对象。由于某些线粒体疾病是遗传的，因此线粒体疾病的遗传携带者或被诊断为患有线粒体疾病的对象的后代被认为是发生线粒体疾病的风险组。
185.当在本文中使用时，术语“未患有线粒体疾病的对象/供体”是指未被诊断为患有线粒体疾病、未被怀疑具有线粒体疾病和/或不在发生线粒体疾病的风险组中的人类对象。所述术语还包括在线粒体dna中没有突变的对象和/或在编码转移到线粒体的分子(例如蛋白质或rna分子)的核dna中没有突变的对象。
186.当在本文中使用时，术语“分离的健康的功能性人类外源线粒体”是指获自或源自于从未患有线粒体疾病的对象获得的细胞的完整的线粒体。所述术语还包括从在线粒体dna中不带有突变的对象获得的功能性线粒体。在某些实施方式中，这些线粒体是外源线粒体。当在本文和权利要求书中在线粒体的背景中使用时，术语“分离的”包括从所述来源中存在的其他组分至少部分纯化的线粒体。在某些实施方式中，所述包含多个分离的健康的功能性外源线粒体的第二组合物中线粒体蛋白的总量，在所述样品中细胞蛋白的总量的20％
‑
80％、20
‑
70％、40
‑
70％、20
‑
40％或20
‑
30％之间。每种可能性代表本发明的独立实施方式。在某些实施方式中，所述包含多个分离的健康的功能性外源线粒体的第二组合物中线粒体蛋白的总量在所述样品中细胞蛋白的总量的20％
‑
80％之间。在某些实施方式中，所述包含多个分离的健康的功能性外源线粒体的第二组合物中线粒体蛋白的总量在所述线粒体和其他亚细胞级分的合并重量的20％
‑
80％之间。在其他实施方式中，所述包含多个分离的健康的功能性外源线粒体的第二组合物中线粒体蛋白的总量高于所述线粒体和其他亚细胞级分的合并重量的80％。
187.当在本文中使用时，短语“允许所述人类功能性线粒体进入所述人类干细胞的条件”通常是指诸如时间、温度和所述线粒体与所述人类干细胞之间的接近性等的参数。这些条件由本发明提供。
188.在某些实施方式中，将所述人类干细胞与所述健康的功能性外源线粒体在约16至约37℃范围内的温度下温育0.5至30小时范围内的时间。在某些实施方式中，将所述人类干细胞与所述健康的功能性外源线粒体温育1至30或5至25小时范围内的时间。每种可能性代表本发明的独立实施方式。在特定实施方式中，温育进行20至30小时。在某些实施方式中，温育进行至少1、5、10、15或20小时。每种可能性代表本发明的独立实施方式。在其他实施方式中，温育进行至多5、10、15、20或30小时。每种可能性代表本发明的独立实施方式。在特定实施方式中，温育进行24小时。在某些实施方式中，温育在室温(16℃至30℃)进行。在其他实施方式中，温育在37℃进行。在某些实施方式中，温育在5％co2气氛中进行。在其他实施
方式中，温育不包括添加高于空气中存在的水平的co2。在某些实施方式中，温育进行到所述干细胞中的线粒体含量与它们的初始线粒体含量相比平均提高1％至45％为止。
189.通过操控所述温育的条件，人们可以操控所述产物的特点。在某些实施方式中，所述温育在37℃进行。在某些实施方式中，所述温育进行至少6小时。在某些实施方式中，所述温育进行至少12小时。在某些实施方式中，所述温育进行12至24小时。在某些实施方式中，所述温育以每份具有或表现出4.4毫单位cs的外源线粒体的量1
×
105至1
×
107个原初干细胞的比例进行。在某些实施方式中，所述温育以每份具有或表现出4.4毫单位cs的外源线粒体的量1
×
106个原初干细胞的比例进行。在某些实施方式中，所述条件足以将通过cs活性确定的所述原初干细胞的线粒体含量提高至少约3％、5％或10％。每种可能性代表本发明的独立实施方式。
190.当在本文中使用时，术语“线粒体含量”是指细胞内线粒体的量。在某些实施方式中，温育在支持细胞存活的培养基中进行。在某些实施方式中，所述培养基是dulbecco改良的eagle培养基(dmem)。在其他实施方式中，所述培养基是含有hsa(人血清白蛋白)的盐水。在某些实施方式中，所述盐水含有1％至10％之间的hsa。在另外的实施方式中，所述盐水含有3至6％之间的hsa。在另外的其他实施方式中，所述盐水含有4.5％hsa。在特定实施方式中，所述干细胞与所述健康的功能性线粒体的温育在16至30℃范围内的温度下，在含有3至6％之间的hsa的盐水中，不添加高于空气中存在的水平的co2，进行15至30小时范围内的时间。
191.在某些实施方式中，上文描述的方法在其各种不同实施方式中还包括在将所述干细胞与所述外源线粒体温育之前、期间或之后进行离心。每种可能性代表本发明的独立实施方式。在某些实施方式中，上文描述的方法在其各种不同实施方式中包括在将所述干细胞与所述外源线粒体温育之前、期间或之后进行单个离心步骤。在某些实施方式中，所述离心力在1000g至8500g的范围内。在某些实施方式中，所述离心力在2000g至4000g的范围内。在某些实施方式中，所述离心力高于2500g。在某些实施方式中，所述离心力在2500g至8500g的范围内。在某些实施方式中，所述离心力在2500g至8000g的范围内。在某些实施方式中，所述离心力在3000g至8000g的范围内。在其他实施方式中，所述离心力在4000g至8000g的范围内。在特定实施方式中，所述离心力为7000g。在其他实施方式中，所述离心力为8000g。在某些实施方式中，离心进行2分钟至30分钟范围内的时间。在某些实施方式中，离心进行3分钟至25分钟范围内的时间。在某些实施方式中，离心进行5分钟至20分钟范围内的时间。在某些实施方式中，离心进行8分钟至15分钟范围内的时间。
192.在某些实施方式中，离心在4至37℃范围内的温度下进行。在某些实施方式中，离心在4至10℃或16
‑
30℃范围内的温度下进行。每种可能性代表本发明的独立实施方式。在特定实施方式中，离心在2
‑
6℃下进行。在特定实施方式中，离心在4℃下进行。在某些实施方式中，上文描述的方法在其各种不同实施方式中包括在将所述干细胞与所述外源线粒体温育之前、期间或之后进行单次离心，然后将所述细胞在低于30℃的温度下静息。在某些实施方式中，允许所述人类功能性线粒体进入所述人类干细胞的条件包括在将所述干细胞与所述外源线粒体温育之前、期间或之后进行单次离心，然后将所述细胞在16至28℃范围内的温度下静息。
193.在某些实施方式中，所述第一组合物是新鲜的。在某些实施方式中，所述第一组合
物被冷冻，然后在温育之前融化。在某些实施方式中，所述第二组合物是新鲜的。在某些实施方式中，所述第二组合物被冷冻，然后在温育之前融化。在某些实施方式中，所述第四组合物是新鲜的。在某些实施方式中，所述第四组合物被冷冻，然后在给药之前融化。
194.在某些实施方式中，所述第四组合物中的干细胞与所述第一组合物中的干细胞相比具有(i)提高的线粒体dna含量；(ii)提高的选自cs、cox1和sdha的至少一种线粒体蛋白的含量；(iii)提高的氧(o2)消耗速率；(iv)提高的柠檬酸合酶活性水平；(v)提高的三磷酸腺苷(atp)生产速率；或(vi)(i)、(ii)、(iii)、(iv)和(v)的任何组合。每种可能性代表本发明的独立实施方式。用于确定这些各种不同参数的方法在本领域中是公知的。
195.当在本文中使用时，术语“提高的线粒体dna含量”是指可检测地高于线粒体富集之前所述第一组合物中的线粒体dna含量的线粒体dna含量。线粒体dna含量可以通过在线粒体富集之前和之后进行线粒体基因的定量pcr，并归一化到核基因来测量。
196.当在本文中使用时，术语“提高的至少一种线粒体蛋白的含量”是指核编码或线粒体编码的线粒体蛋白例如cs、cox1和sdha的含量，其可检测地高于线粒体富集之前所述第一组合物中所述线粒体蛋白的含量。
197.当在本文中使用时，术语“提高的氧(o2)消耗速率”是指可检测地高于线粒体富集之前所述第一组合物中的氧(o2)消耗速率的氧(o2)消耗速率。
198.当在本文中使用时，术语“提高的柠檬酸合酶含量或活性水平”是指可检测地高于线粒体富集之前所述第一组合物中的柠檬酸合酶含量值或活性水平的柠檬酸合酶含量或活性水平。
199.当在本文中使用时，术语“提高的三磷酸腺苷(atp)生产速率”是指可检测地高于线粒体富集之前所述第一组合物中的三磷酸腺苷(atp)生产速率的三磷酸腺苷(atp)生产速率。
200.在某些实施方式中，本文中所使用的术语“可检测地高于”是指所述正常与提高的值之间的统计学显著的提高。在某些实施方式中，本文中所使用的术语“可检测地高于”是指非病理性提高，即提高到其中没有与所述实质性更高的值相关的病理症状变得显而易见的水平。在某些实施方式中，当在本文中使用时，术语“提高的”是指比在多个健康对象的相应细胞或相应线粒体中或线粒体富集之前所述第一组合物的干细胞中存在的相应值高1.05倍、1.1倍、1.25倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍或更高的值。每种可能性代表本发明的独立实施方式。
201.在特定情况下，将线粒体富集之前的同一种细胞用作对照以测量cs和atp活性并确定富集水平。
202.柠檬酸合酶(cs)位于线粒体基质中，但由核dna编码。柠檬酸合酶参与克雷布斯循环的第一步，并通常被用作完整线粒体存在的定量酶标记物(larsen s.等，2012,j.physiol.,vol.590(14)，第3349
–
3360页；cook g.a.等，biochim.biophys.acta.,1983,vol.763(4)，第356
‑
367页)。在某些实施方式中，通过确定柠檬酸合酶的含量来确定所述第一组合物或第四组合物中干细胞的线粒体含量。在某些实施方式中，通过确定柠檬酸合酶的活性水平来确定所述第一组合物或第四组合物中干细胞的线粒体含量。在某些实施方式中，所述第一组合物或第四组合物中干细胞的线粒体含量与柠檬酸合酶的含量相关。在某些实施方式中，所述第一组合物或第四组合物中干细胞的线粒体含量与柠檬酸合酶的活性
水平相关。cs活性可以通过例如使用cs活性试剂盒cs0720(sigma)来测量。
203.真核生物的nadph
‑
细胞色素c还原酶(细胞色素c还原酶)是一种定位于内质网的黄素蛋白。它将电子从nadph传递到几种加氧酶，其中最重要的是负责异生物质脱毒的细胞色素p450家族的酶。细胞色素c还原酶被广泛用作内质网标志物。在某些实施方式中，所述第二组合物基本上没有细胞色素c还原酶或细胞色素c还原酶活性。在某些实施方式中，所述第四组合物与所述第一组合物相比未富集细胞色素c还原酶或细胞色素c还原酶活性。
204.在某些实施方式中，所述干细胞包含成髓细胞。当在本文中使用时，术语“成髓细胞”是指参与骨髓形成，例如参与骨髓和从其产生的所有细胞即所有血液细胞的生成的细胞。
205.在某些实施方式中，所述干细胞包含红细胞生成细胞。当在本文中使用时，术语“红细胞生成细胞”是指参与红细胞生成，例如参与红血细胞(红细胞)的产生的细胞。
206.在某些实施方式中，所述干细胞包含多潜能造血干细胞(hsc)。当在本文中使用时，术语“多潜能造血干细胞”或“成血细胞”是指通过造血过程产生所有其他血液细胞的干细胞。
207.在某些实施方式中，所述干细胞包含共同髓系祖细胞、共同淋巴系祖细胞或其任何组合。当在本文中使用时，术语“共同髓系祖细胞”是指产生髓系细胞的细胞。当在本文中使用时，术语“共同淋巴系祖细胞”是指产生淋巴细胞的细胞。
208.在某些实施方式中，所述药物组合物还包含巨核细胞、红细胞、肥大细胞、成髓细胞、嗜碱性粒细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、自然杀伤(nk)细胞、小淋巴细胞、t淋巴细胞，b淋巴细胞、浆细胞、网状细胞或其任何组合。每种可能性代表本发明的独立实施方式。
209.在某些实施方式中，所述干细胞包含间充质干细胞。当在本文中使用时，术语“间充质干细胞”是指可以分化成各种不同的细胞类型包括成骨细胞(骨细胞)、软骨细胞、肌细胞(肌肉细胞)和脂肪细胞的多能基质细胞。
210.在某些实施方式中，所述干细胞由成髓细胞构成。在某些实施方式中，所述干细胞由红细胞生成细胞构成。在某些实施方式中，所述干细胞由多潜能造血干细胞(hsc)构成。在某些实施方式中，所述干细胞由共同髓系祖细胞、共同淋巴系祖细胞或其任何组合构成。每种可能性代表本发明的独立实施方式。在某些实施方式中，所述干细胞由间充质干细胞构成。
211.也被称为cd34抗原的造血祖细胞抗原cd34是在人类中由cd34基因编码的蛋白质。cd34是细胞表面糖蛋白中的一种分化抗原簇，并起到细胞
‑
细胞黏附因子的作用。在某些实施方式中，所述干细胞表达骨髓祖细胞抗原cd34(是cd34
+
的)。在某些实施方式中，所述干细胞在它们的外膜上存在骨髓祖细胞抗原cd34。在某些实施方式中，所述干细胞不表达骨髓祖细胞抗原cd34(是cd34
‑
的)。在某些实施方式中，所述干细胞在它们的外膜上不存在骨髓祖细胞抗原cd34。
212.在某些实施方式中，所述第一组合物中的干细胞直接源自于患有线粒体疾病的患者。在某些实施方式中，所述第一组合物中的干细胞直接源自于未患有线粒体疾病的对象。当在本文中使用时，术语“直接源自于”是指直接源自于其他细胞的干细胞。在某些实施方式中，所述干细胞源自于造血干细胞。
213.在某些实施方式中，所述第一组合物中的干细胞间接源自于患有线粒体疾病的患者。在某些实施方式中，所述第一组合物中的干细胞间接源自于未患有线粒体疾病的对象。当在本文中使用时，术语“间接源自于”是指源自于非干细胞或其他类型的干细胞的干细胞。在某些实施方式中，所述干细胞源自于被操作以变成诱导性多能干细胞(ipsc)的体细胞。
214.在某些实施方式中，所述第一组合物中的干细胞从患有线粒体疾病的患者的骨髓直接获得。在某些实施方式中，所述第一组合物中的干细胞从未患有线粒体疾病的对象的骨髓直接获得。当在本文中使用时，术语“直接获得”是指例如通过诸如手术或利用注射器经针头吮吸的手段从骨髓本身获得的干细胞。
215.在某些实施方式中，所述第一组合物中的干细胞从患有线粒体疾病的患者的骨髓间接获得。在某些实施方式中，所述第一组合物中的干细胞从未患有线粒体疾病的对象的骨髓间接获得。当在本文中使用时，术语“间接获得”是指从骨髓本身之外的其他位置获得的干细胞。
216.在某些实施方式中，所述第一组合物中的干细胞从脂肪组织、口腔粘膜、皮肤成纤维细胞、血液和/或脐带血直接或间接获得。每种可能性是独立的实施方式。
217.在某些实施方式中，所述第一组合物中的干细胞从患有线粒体疾病的患者的外周血获得。在某些实施方式中，所述第一组合物中的干细胞从未患有线粒体疾病的对象的外周血获得。当在本文中使用时，术语“外周血”是指在血液系统中循环的血液。
218.在某些实施方式中，上述方法还包括前期步骤，所述步骤包括向所述患有线粒体疾病的患者给药诱导干细胞向外周血动员的药剂。在某些实施方式中，上述方法还包括前期步骤，所述步骤包括向未患有线粒体疾病的对象给药诱导干细胞向外周血动员的药剂。
219.在某些实施方式中，所述诱导干细胞向外周血动员的药剂选自粒细胞集落刺激因子(g
‑
csf)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(gm
‑
csf)、1,1
′‑
[1,4
‑
亚苯基双(亚甲基)]双[1,4,8,11
‑
四氮杂环十四烷](普乐沙福，cas编号155148
‑
31
‑
5)、其盐及其任何组合。每种可能性代表本发明的独立实施方式。
[0220]
在某些实施方式中，上述方法还包括从患有线粒体疾病的患者的外周血分离所述干细胞的步骤。在某些实施方式中，上述方法还包括从未患有线粒体疾病的对象的外周血分离所述干细胞的步骤。当在本文中使用时，术语“从外周血分离”是指将干细胞与血液的其他组成成分分离开。
[0221]
在单采分离期间，将供体或患者的血液通过一种装置，所述装置分离出一种特定组成成分并将剩余组分返回到循环。因此，它是在身体外部进行的医学程序。在某些实施方式中，所述分离通过单采分离来进行。
[0222]
在某些实施方式中，上述方法还包括在温育之前浓缩所述第三组合物中的干细胞和功能性线粒体。在某些实施方式中，上述方法还包括在温育期间浓缩所述第三组合物中的干细胞和功能性线粒体。在某些实施方式中，在温育期间所述第三组合物中的干细胞和功能性线粒体的浓缩通过连续离心来进行。
[0223]
在某些实施方式中，上述方法还包括在温育之前将所述第三组合物离心。在某些实施方式中，上述方法还包括在温育期间将所述第三组合物离心。在某些实施方式中，上述方法还包括在温育之后将所述第三组合物离心。
[0224]
应该强调的是，对针对多个细胞或线粒体的任何可测量的特点或特征或情况的任何指称，针对的是所述多个细胞或线粒体的所述可测量的平均特点或特征或情况。
[0225]
异质性是在细胞或个体内存在超过一种类型的线粒体dna。异质性水平是突变体mtdna分子相对于野生型/功能性mtdna分子的比例，并且是考虑线粒体疾病的严重性中的重要因素。较低的异质性水平(足够量的线粒体是功能性的)与健康的表型相关，而较高的异质性水平(不足量的线粒体是功能性的)与病理相关。在某些实施方式中，所述第四组合物中干细胞的异质性水平比所述第一组合物中干细胞的异质性水平低至少1％。在某些实施方式中，所述第四组合物中干细胞的异质性水平比所述第一组合物中干细胞的异质性水平低至少3％。在某些实施方式中，所述第四组合物中干细胞的异质性水平比所述第一组合物中干细胞的异质性水平低至少5％。在某些实施方式中，所述第四组合物中干细胞的异质性水平比所述第一组合物中干细胞的异质性水平低至少10％。在某些实施方式中，所述第四组合物中干细胞的异质性水平比所述第一组合物中干细胞的异质性水平低至少15％。在某些实施方式中，所述第四组合物中干细胞的异质性水平比所述第一组合物中干细胞的异质性水平低至少20％。在某些实施方式中，所述第四组合物中干细胞的异质性水平比所述第一组合物中干细胞的异质性水平低至少25％。在某些实施方式中，所述第四组合物中干细胞的异质性水平比所述第一组合物中干细胞的异质性水平低至少30％。
[0226]
在某些实施方式中，所述方法还包括冷冻所述第四组合物。在某些实施方式中，所述方法还包括冷冻然后融化所述第四组合物。
[0227]
当在本文中使用时，术语“自体细胞”或“自体的细胞”是指患者自身的细胞。术语“同种异体细胞”是指来自于不同供体个体的细胞。术语“自体线粒体”是指从相同的母体遗传相关细胞获得的线粒体。术语“同种异体线粒体”是指来自于不同供体个体的线粒体，其中所述不同供体个体与所述待治疗的对象不是母体遗传相关的。
[0228]
当在本文和权利要求书中使用时，术语“同系”是指足以允许个体之间的移植而没有排斥的遗传同一性或遗传近同一性。在线粒体的情形中，术语“同系”在本文中可以与意味着相同的母系血统的术语“自体线粒体”互换使用。
[0229]
术语“外源线粒体”是指从细胞外部的来源引入到靶细胞(即干细胞)的线粒体。例如，在某些实施方式中，外源线粒体可以源自或分离自与所述靶细胞不同的细胞。例如，外源线粒体可以在供体细胞中生产/制造，从所述供体细胞纯化/分离/获得，随后引入到所述靶细胞中。
[0230]
术语“内源线粒体”是指由细胞制造/表达/生产并且不是从外部来源引入到所述细胞中的线粒体。在某些实施方式中，内源线粒体可以含有由所述细胞的基因组编码的蛋白质和/或其他分子。在某些实施方式中，术语“内源线粒体”等同于术语“宿主线粒体”。
[0231]
在某些实施方式中，所述健康的功能性人类外源线粒体是自体或同种异体线粒体。
[0232]
在某些实施方式中，所述内源线粒体与已被引入到靶细胞中之后的外源线粒体的鉴定/辨别可以通过各种不同手段来进行，包括例如但不限于：鉴定所述内源线粒体与外源线粒体之间线粒体dna(mtdna)序列的差异例如不同的单体型，鉴定起源于所述外源线粒体的组织的特定线粒体蛋白例如来自于胎盘的细胞色素p450胆固醇侧链切割(p450scc)、来自于棕色脂肪组织的ucp1等，或其任何组合。
[0233]
在某些实施方式中，上述方法还包括向所述患者给药促进线粒体生物发生的药剂的步骤。当在本文中使用时，术语“线粒体生物发生”是指线粒体的生长和分裂。在某些实施方式中，所述促进线粒体生物发生的药剂是促红细胞生成素(epo)或其盐。在某些实施方式中，所述药剂选自重组人类促红细胞生成素和分离的人类促红细胞生成素。
[0234]
在某些实施方式中，上述方法还包括向所述患者给药阻止、延迟、最小化或废除所述患者与干细胞之间的不利免疫原性反应的药剂的步骤。在某些实施方式中，所述不利免疫原性反应是移植物抗宿主疾病(gvhd)。在某些实施方式中，所述gvhd是所述疾病的急性形式(agvhd)。在某些实施方式中，所述gvhd是所述疾病的慢性形式(cgvhd)。
[0235]
在某些实施方式中，上述方法还包括在给药所述药物组合物之前向所述患者给药移植前调理剂的前期步骤。当在本文中使用时，术语“移植前调理剂”是指能够杀死所述人类对象中的干细胞的任何药剂。在某些实施方式中，所述移植前调理剂是白消安。
[0236]
当在本文中使用时，术语“突变”是指线粒体或核dna中至少一个核苷酸的插入、缺失或替换。在某些实施方式中，所述突变是病理性突变。
[0237]
在某些实施方式中，所述药物组合物被局部给药。在某些实施方式中，所述药物组合物向对象的给药通过直接给药到所述对象的骨髓来进行。在某些实施方式中，所述药物组合物向对象的给药是给药到组织或器官。在某些实施方式中，所述药物组合物向对象的给药是给药到眼。玻璃体液是透明、无色的凝胶状物质，充满了眼中晶状体与视网膜之间的空间。在某些实施方式中，所述药物组合物向对象的给药是给药到眼的玻璃体液。在某些实施方式中，所述药物组合物向对象的给药通过直接肌肉内注射来进行。在某些实施方式中，所述药物组合物被系统性给药。在某些实施方式中，所述药物组合物向对象的给药通过选自静脉内、动脉内、肌肉内、皮下和直接注射到组织或器官中的途径来进行。每种可能性代表本发明的独立实施方式。
[0238]
在某些实施方式中，所述功能性线粒体从选自胎盘、在培养物中生长的胎盘细胞和血液细胞的人类细胞或人类组织获得。每种可能性代表本发明的独立实施方式。
[0239]
根据另一个实施方式，线粒体膜的完整性可以通过本领域中已知的任何方法来确定。在非限制性实例中，线粒体膜的完整性使用四甲基罗丹明甲酯(tmrm)或四甲基罗丹明乙酯(tmre)荧光探针来测量。每种可能性代表本发明的独立实施方式。在显微镜下观察到并显示出tmrm或tmre染色的线粒体具有完整的线粒体外膜。当在本文中使用时，术语“线粒体膜”是指选自线粒体内膜、线粒体外膜和两者的线粒体膜。
[0240]
尽管已参考某些实施方式对本发明进行了描述，但本领域技术人员将会理解，可以做出各种不同的改变并且可以用等同方式替换而不背离本发明的范围。此外，在不背离本发明的范围的情况下可以做出许多修改，以使特定情况或材料适应于本发明的教导。因此，不打算将本发明限于所公开的特定实施方式，而是本发明将包括落于权利要求书的范围之内的所有实施方式。
[0241]
提供下面的实施例是为了提供对本发明的更完全的理解。为说明本发明的原理而阐述的具体技术、条件、材料、比例和报告的数据是示例性的，并且不应被解释为限制本发明的范围。
[0242]
实施例
[0243]
实施例1.在mat程序后线粒体快速进入cd34
+
细胞
[0244]
将来自于健康供体的cd34
+
细胞用mitotracker orange(mto)处理并清洗，然后使用从hela
‑
turbogfp
‑
线粒体细胞(celltrend gmbh)分离的线粒体进行mat。将细胞用2％pfa固定10分钟并用dapi固定。使用装备有60x/1.42油浸物镜的共聚焦显微镜对细胞进行扫描。
[0245]
正如可以在图1中看到的，外源线粒体在快至mat后0.5小时进入cd34
+
细胞(细胞内部明亮的、几乎白色的斑点)，并在所测试的8和24小时继续进入。
[0246]
实施例2.小鼠中的线粒体增强疗法
[0247]
将不同小鼠细胞在含有10％fcs的dmem中，在37℃和5％co2气氛下与分离的线粒体温育24小时，以便提高它们的线粒体含量和活性。表1描述了所述线粒体增强过程的代表性结果，其通过所述过程之后细胞的cs活性与所述过程之前细胞的cs活性相比的相对提高来确定。
[0248]
表1.
[0249][0250]
将fvb/n骨髓细胞(带有mtdna atp8中的突变)与从胎盘分离的c57/bl野生型(wt)线粒体以各种不同的剂量(在1ml中0.044、0.44、0.88、2.2、4.4、8.8、17.6毫单位cs活性/1m个细胞)温育。正如可以在图2a中看到的，使用wt特异性序列的dpcr显示，对于大多数剂量来说wt mtdna以剂量依赖性方式增加。所述富集的细胞也显示出mtdna编码的(cox1)(图2b)和核编码的(sdha)(图2c)蛋白质含量的剂量依赖性提高。
[0251]
小鼠骨髓细胞(106)未被处理或与从小鼠骨髓瘤细胞分离的gfp标记的线粒体(17milliu或34milliu，指示作为线粒体含量的标志物的柠檬酸合酶活性的水平)温育24小时。将所述细胞与线粒体混合，以8000g离心并重悬浮。在24小时温育后，将所述细胞用pbs清洗两次，并如以前在wo 2016/135723中所述使用cs0720和cy0100试剂盒(sigma)分别测量柠檬酸合酶(cs)活性(图3a)和细胞色素c还原酶活性(图3b)的水平。
[0252]
图3中演示的结果清楚地表明在上述实验中使用的功能性线粒体的组合物使骨髓细胞富集线粒体但不富集er。
[0253]
为了研究线粒体增强疗法的体内体内效果，将富集有4.4毫单位cs活性的c57/bl胎盘线粒体的fvb/n骨髓细胞(1x106)iv注射到fvb/n小鼠。在所述处理后1天、1周、1个月和3个月从小鼠收集骨髓，并使用dpcr检测wt mtdna水平。正如可以在图4中看到的，在处理后1天在骨髓中检测到显著量的wt mtdna。
[0254]
实施例3.mat导致外源和内源mtdna在细胞内的共存
[0255]
健康供体cd34
+
细胞的线粒体增强使用两个不同胎盘来源的线粒体批次来进行，并在24h温育后将细胞充分清洗。mtdna的基于illumina的测序显示在同一细胞内存在转移的和内源线粒体两者。
[0256]
正如可以在图5中看到的，来自于两个不同胎盘的两个mat实验产生相近的增强百分率。
[0257]
实施例4.线粒体可以进入人类骨髓细胞
[0258]
将人类cd34
+
细胞(1.4
×
105个，atcc pcs
‑
800
‑
012)不进行处理或与从人类胎盘细胞分离的gfp标记的线粒体温育20小时。在将所述细胞铺板之前，将线粒体与所述细胞混合，以8000g离心并重悬浮。在温育后，将所述细胞用pbs清洗两次，并使用cs0720 sigma试剂盒测量cs活性(图6a)。atp含量如以前在wo 2016/135723中所述使用atplite(perkin elmer)来测量(图6b)。
[0259]
图6中演示的结果清楚地表明，通过与分离的人类线粒体相互作用和共温育，人类骨髓细胞的线粒体含量可以提高许多倍，其程度超过人类或鼠类成纤维细胞或鼠类骨髓细胞的能力。
[0260]
实施例5.来自于植入有人类脐带血的nsgs小鼠的骨髓在mat后2个月含有更多的人类mtdna
[0261]
将皮尔逊综合症患者的脐带血细胞与0.88mu人类线粒体温育24hr，然后除去培养基，将细胞清洗并重悬浮在4.5％hsa中。将所述富集的细胞iv注射到nsgs小鼠(每只小鼠100,000个cd34
+
细胞)。
[0262]
图7a是皮尔逊综合症患者的脐带血细胞中mtdna缺失的图示说明，示出了4978kb的缺失的ucb mtdna区域(左图)，以及示出了所述缺失的dna印迹分析(右图)。
[0263]
在mat后2个月从小鼠收集骨髓，并使用鉴定ucb的不存在缺失的wt mtdna序列的引物和探针在dpcr中分析不存在缺失的wt mtdna的拷贝数。
[0264]
正如可以在图7b中看到的，在线粒体增强疗法后2个月，所述小鼠的骨髓与用未增强的脐带血细胞注射的小鼠的骨髓相比含有多出～100％的人类mtdna。
[0265]
实施例6.体内安全性和生物分布动物模型
[0266]
将线粒体引入到来自于两种不同背景的对照健康小鼠的骨髓细胞中：线粒体的来源是来自于具有不同mtdna序列的小鼠(jenuth jp等，nature genetics,1996,vol.14，第146
‑
151页)。
[0267]
从野生型小鼠(c57bl)胎盘分离线粒体。从fvb/n小鼠分离骨髓细胞。将所述突变的fvb/n骨髓细胞(106)用所述健康的功能性c57bl线粒体(4.4毫单位)装载并iv给药到fvb/n小鼠。
[0268]
方法的步骤如下：(1)从c57bl小鼠的胎盘分离线粒体，在
‑
80℃下冷冻并解冻，或新鲜使用；(2)从mtdna突变的fvb/n小鼠获得骨髓细胞；(3)将所述线粒体与骨髓细胞相接触，以8000g离心5分钟，重悬浮并温育24小时；(4)将所述骨髓细胞用pbs清洗两次并注射到fvb/n小鼠的尾静脉中。在移植后的各个不同时间点例如24小时、一周、一个月和3个月后，收集组织(血液、骨髓、淋巴细胞、脑、心、肾、肝、肺、脾、骨骼肌、眼、卵巢/睾丸)并提取dna用于进一步序列分析。
[0269]
在移植后1个月骨髓中fvb/n水平的降低描绘在图8中。
[0270]
实施例7.患有皮尔逊综合症(ps)和肾范可尼综合征(fs)的青少年使用富集有mnv
‑
bld(血液来源的线粒体)的自体cd34
+
细胞的同情治疗
[0271]
患者1是被诊断为患有ps的6.5岁男性患者，在其mtdna中具有第5835
‑
9753位核苷酸的缺失。在线粒体增强疗法(mat)之前，他的体重为14.5kg，不能行走超过100米或爬楼梯。在治疗之前他的生长显著延迟3年，并且在基线时他的体重为
‑
4.1标准偏差评分(sds)，身高为
‑
3.2sds(相对于群体)，并且尽管通过胃造口管(g管)喂食超过一年但仍没有改善。他具有肾衰竭(gfr 22ml/min)和近端肾小管病，需要补充电解质。他具有需要补充钙的甲状旁腺功能减退，并且在心电图上具有不完全性右束支传导阻滞(icrbb)。
[0272]
造血干细胞和祖细胞(hspc)的动员通过单独地皮下给药gcsf共5天来进行。白细胞单采使用spectra optia系统(terumobct)，按照机构指南通过外周静脉接口来进行。使用clinimacs cd34试剂，按照制造商的说明书对动员的外周血来源的细胞进行cd34阳性选择。使用ph7.4的250mm蔗糖缓冲液，通过差速离心从母体外周血单核细胞(pbmc)分离线粒体。为了进行mat，将自体cd34
+
细胞与所述来自于患者母亲的健康的线粒体温育(每份具有4.4毫单位柠檬酸合酶(cs)的量的线粒体1
×
106个细胞)，导致细胞线粒体含量的1.56倍提高(正如通过cs活性所证实的线粒体含量增加56％)。与线粒体的温育在含有4.5％hsa的盐水中在r.t.进行24小时。将富集的细胞悬浮在含有4.5％人血清白蛋白的盐水溶液中。通过按照图9a中展示的时间线iv输注1.1
×
106个富集有健康线粒体的自体cd34
+
细胞/千克体重，所述患者接受单轮治疗。
[0273]
图9b展示了所述患者的有氧任务代谢当量(met)评分的水平随细胞疗法后的时间的变化。数据表明，所述患者的有氧met评分随时间显著提高，从5(中等强度活动，例如步行和骑自行车)提高到8(高强度活动，例如跑步、慢跑和跳绳)。
[0274]
图9c展示了在所述患者的血液中发现的乳酸盐水平随iv注射后的时间的变化。血液乳酸盐是在线粒体损伤时或在氧气向组织的递送不足以支持正常的代谢需求时作为无氧代谢的结果而出现在血液中的乳酸，是线粒体功能障碍的标志之一。正如可以在图4c中看到的，在mat后，患者1的血液乳酸盐水平已降低到正常值。
[0275]
表2展示了所述患者的儿童线粒体疾病量表(ipmds)
–
生活质量(qol)问卷调查结果随细胞疗法后的时间的变化。在“申诉与症状”和“身体检查”两个类别中，0表示相关属性“正常”，而加重的状况根据严重程度被评分为1
‑
5。
[0276]
表2.
[0277] 治疗前+6个月申诉与症状2411身体检查13.44.6
[0278]
应该注意到，所述患者在治疗前的3年中没有增加体重，即自从3.5岁后没有任何体重增加。图4d中呈现的数据示出了通过所述患者的体重和身高的标准偏差评分所度量的生长，数据始于mat之前4年并涵盖随访期间。所述数据表明在单次治疗后约9个月或15个月，所述患者的体重和身高分别存在增加。
[0279]
所述患者生长的另一个证据来自于他的碱性磷酸酶水平。碱性磷酸酶水平测试(alp测试)测量血流中碱性磷酸酶的量。血液中具有低于正常的alp水平可以指示营养不良，这可能由某些维生素和矿物质的缺乏引起。图9e中展示的数据表明单次治疗足以在仅
仅12个月中将所述患者的碱性磷酸酶水平从159提高到486iu/l。
[0280]
正如可以在图9f
‑
h中看到的，治疗导致红血细胞水平(图9f)、血红蛋白水平(图9g)和血细胞比容水平(图9h)的显著改善。这些结果显示，单次治疗足以改善贫血的症状。图9i展示了所述患者的血液中镁的水平随镁增补和细胞疗法后的时间的变化。所述数据表明，所述患者的血液镁水平随时间显著提高，使得不再需要镁增补。在没有镁增补的情况下达到高的镁水平，是镁的吸收以及在肾近端小管中的重吸收得以改善的证据。
[0281]
图9j展示了在细胞疗法之前和之后所述患者血液中的肌酐水平随时间的变化。所述数据表明所述患者的肌酐水平在开始时正常(低于1mg/dl)，但随时间流逝，在治疗前约12个月，他的状况变差。达到高的肌酐水平是肾衰竭的标志物。在启动细胞疗法后，他的状况变得稳定，并阻止了进一步变差(由虚线所示)。
[0282]
正如可以在图9k至9l中进一步看到的，细胞治疗也导致在不增补碳酸氢盐的情况下碳酸氢盐(图9j)和碱过量(图9l)水平的显著改善。
[0283]
正如可以在图9m
‑
9p中看到的，单次治疗也导致几种肾小管病指示物的水平的显著降低，例如尿液中的葡萄糖水平(图9m)和某些盐的水平(图9n
–
钾；图9o
–
氯化物；图9p
‑
钠)。
[0284]
所使用的疗法的成功的遗传指标是正常mtdna与总mtdna相比的占有率。正如在图10a(pt.1)中所示，所述患者中正常mtdna的占有率从基线时的约1在仅仅4个月中提高到高达1.6(+60％)，并在从治疗起20个月后提高到1.9(+90％)。值得注意的是，在大多数时间点，正常mtdna水平高于基线水平。正如在图10b(pt.1)中展示的，在mat后存在异质性水平的降低(存在缺失的mtdna更少)，其在基线时具有相对高的异质性水平。这在整个随访过程中持续存在。
[0285]
根据医院的神经科医生报告，在含有健康线粒体(不带有缺失突变)的自体细胞移植后，在所述患者中证实了神经学改善。所述患者提高了他的行走技巧、爬阶梯的能力和使用剪刀和绘画的能力。在他的执行命令的能力、反应时间以及运动和语言技巧方面，也注意到实质性改善。此外，患者的母亲报告了患者记忆的改善。
[0286]
正如上文展示的数据所指示的，由本发明提供的单轮治疗方法成功地治疗了ps、fs，改善了肾功能，并提高了外周血中正常mtdna的占有率。在所述患者的对于同年龄的健康对象来说正常的体重增加及其认知状态中，进一步发现了这种有益效果的组合的证据。
[0287]
实施例8.患有皮尔逊综合症(ps)的青少年使用富集有mnv
‑
bld(血液来源的线粒体)的自体cd34
+
细胞的同情治疗
[0288]
患者2是被诊断为患有ps的7岁女性患者，在她的mtdna中具有4977个核苷酸的缺失。所述患者也患有贫血、内分泌胰腺功能不全，并且她已患有胰岛素依赖型糖尿病4年。患者具有高的乳酸盐水平(>25mg/dl)、低的体重以及进食和增加体重的问题。所述患者还患有高镁尿症(尿液中高水平并且血液中低水平的镁)。患者具有记忆和学习问题、散光和外周淋巴细胞中低的线粒体活性，正如通过tmre、atp含量和o2消耗速率(相对于健康的母亲)所确定的。
[0289]
造血干细胞和祖细胞(hspc)的动员、白细胞单采和cd34阳性选择与患者1(实施例3)类似地进行，区别在于在白细胞单采之前第
‑
1天添加普乐沙福(n＝2)。使用ph 7.4的250mm蔗糖缓冲液，通过差速离心从母体外周血单核细胞(pbmc)分离线粒体。为了进行mat，
将自体cd34
+
细胞与所述来自于患者母亲的健康的线粒体温育(每份具有4.4毫单位柠檬酸合酶(cs)的量的线粒体1
×
106个细胞)，导致细胞线粒体含量的1.62倍提高(正如通过cs活性所证实的线粒体含量增加62％)。与线粒体的温育在含有4.5％hsa的盐水中在r.t.进行24小时。应该指出，在线粒体富集后，来自于所述患者的cd34
+
细胞的集落形成率提高了26％。
[0290]
通过按照图11a中展示的时间线iv输注1.8
×
106个富集有健康线粒体的自体cd34
+
细胞/千克体重，对患者2(在治疗当天15kg)进行治疗。
[0291]
图11b展示了在所述患者的血液中发现的乳酸盐水平随i.v.注射后的时间的变化。血液乳酸盐是在线粒体损伤时或在氧气向组织的递送不足以支持正常的代谢需求时作为无氧代谢的结果而出现在血液中的乳酸，是线粒体功能障碍的标志之一。所述数据表明血液乳酸盐的水平随时间显著降低。
[0292]
图11c和11d展示了所述患者的“坐立试验”和“6分钟行走”试验的结果随i.v.注射后的时间的变化。
[0293]
图11e展示了对所述患者的右腿肌肉进行的测力计试验的结果随i.v.注射后的时间的变化。在每个试验中记录三个连续的重复结果。所述数据表明在肌肉强度提高和疲劳降低两个方面，所述患者的肌肉能力随时间改善。
[0294]
图11f
‑
11h分别展示了在所述患者的尿液中发现的镁、钾和钙相比于肌酐的比率随i.v.注射后的时间的变化。
[0295]
图11i展示了所述患者的尿液中atp8与18s之间的基因比率随i.v.注射后的时间的变化。
[0296]
图11j展示了所述患者的淋巴细胞中的atp含量随i.v.注射后的时间的变化。对照是作为线粒体的供体的所述患者的母亲的淋巴细胞中的atp含量。
[0297]
图10a(pt.2)展示了正常mtdna的占有率随i.v.注射后的时间的变化。正如可以在图10a(pt.2)中看到的，正常mtdna的占有率在仅仅1个月内从约1的基线提高到高达2(+100％)，并且直至治疗后10个月仍相对高。值得注意的是，在所有时间点正常mtdna水平均高于基线水平。
[0298]
图10b(pt.2)展示了异质性水平随mat后的时间的变化。可以看到，在患者2中，在mat后存在异质性的降低(存在缺失的mtdna更少)。这在整个随访期间持续存在。
[0299]
实施例9.患有皮尔逊综合症(ps)和范可尼综合征(fs)的青少年使用富集有mnv
‑
bld(血液来源的线粒体)的自体cd34
+
细胞的同情治疗
[0300]
患者3是被诊断为患有ps的10.5岁女性患者，在其mtdna中具有第12113
‑
14421位核苷酸的缺失。所述患者还患有贫血以及发展成肾功能不全第4阶段的范可尼综合征。患者每周三次进行透析治疗。在最近两个月中，患者还患有严重视觉障碍、视野变窄和近视力丧失。患者完全不能进行任何体力活动(不能行走，坐在手推童车中)。患者具有高乳酸盐水平(>50mg/dl)和使用胰岛素治疗的胰腺障碍。脑mri显示出许多病变和萎缩区域。患者仅通过胃造口术进食。患者具有记忆和学习问题。患者在外周淋巴细胞中具有低的线粒体活性，正如通过四甲基罗丹明乙酯(tmre)、atp含量和o2消耗速率(相对于健康的母亲)试验所确定的。
[0301]
造血干细胞和祖细胞(hspc)的动员以及白细胞单采和cd34阳性选择与患者1(实
施例3)类似地进行，区别在于在白细胞单采之前第
‑
1天添加普乐沙福(n＝1)。白血病单采通过永久性透析导管来进行。使用ph 7.4的250mm蔗糖缓冲液，通过差速离心从母体外周血单核细胞(pbmc)分离线粒体。为了进行mat，将自体cd34
+
细胞与所述来自于患者母亲的健康的线粒体温育(每份具有4.4毫单位柠檬酸合酶(cs)的量的线粒体1
×
106个细胞)，导致细胞线粒体含量的1.14倍提高(正如通过cs活性所证实的线粒体含量增加14％)。将细胞与线粒体在含有4.5％hsa的盐水中在r.t.温育24小时。应该指出，在线粒体富集后，来自于所述患者的cd34
+
细胞的集落形成率提高了52％。
[0302]
通过按照图12a中展示的时间线iv输注2.8
×
106个富集有来自于她的母亲的健康线粒体的自体cd34
+
细胞/千克体重，对患者3(21kg)进行治疗。
[0303]
图12b展示了在所述患者的血液中发现的乳酸盐水平在疗法之前和之后随时间的变化。
[0304]
图12c展示了在细胞疗法之前和之后所述患者的血液中ast和alt肝脏酶的水平随时间的变化。在血液中达到低的肝脏酶水平是肝损伤降低的证据。
[0305]
图12d展示了在细胞疗法之前和之后所述患者的血液中甘油三酯、总胆固醇和极低密度脂蛋白(vldl)胆固醇的水平随时间的变化。在血液中达到低的甘油三酯、总胆固醇和vldl胆固醇水平是肝功能提高和脂类代谢改善的证据。
[0306]
糖化血红蛋白(有时也被称为血红蛋白a1c、hba1c、a1c、hb1c、hb1c或hgba1c)是血红蛋白的一种形式，测量它主要是为了鉴定三个月平均血浆葡萄糖浓度。由于红血细胞的寿命为4个月(120天)，因此所述测试限于三个月平均值。图12e展示了在疗法之前和之后所述患者的a1c测试结果随时间的变化。
[0307]
图12f和12g展示了所述患者的“坐立试验”(12f)和“6分钟行走”(12g)试验的结果随i.v.注射后的时间的变化，显示出在治疗后5个月所述两个参数的改善。
[0308]
图10a(pt.3)展示了正常mtdna的占有率随i.v.注射后的时间的变化。正如可以在图10a(pt.3)中看到的，正常mtdna的占有率在治疗后7个月时提高50％。值得注意的是，在大多数时间点正常mtdna水平高于基线水平。
[0309]
图10b(pt.3)展示了异质性水平随mat后的时间的变化。可以看到，在基线时具有相对低的异质性水平的患者3中，在mat后存在异质性的降低(存在缺失的mtdna更少)。这在整个随访期间持续存在。
[0310]
合在一起，上文中展示的结果证实了通过富集外源健康功能性线粒体来增强自体cd34
+
hspc，即使在低至中等的线粒体富集(本文中所示例的14％)下，也可以在患有ps的患者中停止疾病发展并且可以导致许多症状的改善。
[0311]
实施例10.患有kearns
‑
sayre综合征(kss)的青少年使用富集有mnv
‑
bld(血液来源的线粒体)的自体cd34
+
细胞的同情治疗
[0312]
患者4是被诊断为患有kearns
‑
sayre综合征的14岁、19.5kg的女性患者，经历管状视力、上睑下垂、眼肌麻痹和视网膜萎缩。所述患者具有视力问题、cpeo、癫痫发作、病理性eeg、不能坐起或行走的重度肌病、心律失常。所述患者在其线粒体dna中具有7.4kb的缺失，包括下述基因：tk，nc8，atp8，atp6，co3，tg，nd3，tr，nd4l，th，ts2，tl2，nd5，nd6，te，nc9和cyb。
[0313]
造血干细胞和祖细胞(hspc)的动员以及白细胞单采和cd34阳性选择与患者3(实
施例5)类似地进行。为了进行mat，将自体cd34
+
细胞与来自于患者母亲的健康的线粒体(每份具有4.4毫单位柠檬酸合酶(cs)的量的线粒体1
×
106个细胞)在含有4.5％hsa的盐水中在r.t.温育24小时。所述富集导致细胞线粒体含量的1.03倍提高(正如通过cs活性所证实的线粒体含量增加3％)。
[0314]
通过按照图12a中展示的时间线，将患者4用2.2
×
106个富集有健康线粒体的自体cd34
+
细胞/千克体重进行治疗。
[0315]
出人意料的是，在用仅富集有3％健康线粒体的cd34
+
单次治疗后4个月，所述患者的eeg显示出明显改善，没有癫痫发作。在治疗后5个月，所述患者遭受疾病相关的房室(av)阻滞并安装了起搏器。所述患者恢复并继续改善。在治疗后6个月测量了外周血中的atp含量，显示出与治疗前相比atp含量提高约100％，正如在图13中所示。在治疗后7个月，所述患者可以独自坐起、在帮助下行走、交谈、有更好的食欲并且体重增加3.6kg。
[0316]
实施例11.使用富集有人类线粒体的人类干细胞治疗患有线粒体疾病的患者
[0317]
患者基于其线粒体或核dna中的一个或多个突变、其经历的症状或两者而被诊断为患有线粒体疾病。
[0318]
患者按照适合于其年龄、体重和临床状况的时间线，用富集有从健康供体获得或分离的健康的功能性线粒体的自体或同种异体人类干细胞进行治疗。所述给药的人类干细胞通过将原初人类干细胞与健康的功能性线粒体温育来制备。
[0319]
在疗法之前、期间和/或之后监测所述患者的临床状况。所述患者的生理和/或认知方面的临床状况可以通过下述测试之一来确定：韦克斯勒学前班和小学智力量表(wppsi v3)，国际儿科线粒体疾病量表(ipmds)调查问卷，身体检查，神经心理学检查(例如：根据发育神经心理学评估nepsy ii(nepsy ii
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第2版)的名单记忆测试，根据韦氏儿童智力量表(wis)第4版的数字跨度测试，和根据beery
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buktenica视觉
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运动整合的发育测试：管理，评分和教学手册(第6版)的视觉运动整合(vmi))，全血细胞计数，血气，血液生化，手动差异血液测试，尿液生化，体重增加，呼吸功能和正常线粒体dna含量。
[0320]
本发明的范围不受本文中描述的具体实施方式限制。事实上，对于本领域技术人员来说，根据前述描述和附图，除了本文中描述的之外的本发明的各种不同修改将变得显而易见。这些修改打算落入权利要求书的范围之内。