吲哚布洛芬作为CBP溴区抑制剂的新用途的制作方法

本发明涉及药物筛选领域，具体涉及cbp溴区抑制剂的筛选方法，以及吲哚布洛芬可作为cbp溴区抑制剂的用途。

背景技术：

cbp（crebbindingprotein）在哺乳动物中是高度保守的，被认定为是与creb转录因子相互作用的配体。cbp作为乙酰化转移酶的功能与其包含的溴区（bromodomain）结构域密切相关。溴区长约110个氨基酸，能特异性识别结合乙酰化的赖氨酸残基，可与多种dna结合性转录因子、病毒转化因子、核受体、信号分子等反应、其功能涉及到信号转导、细胞凋亡、癌症和炎症等。因此，cbp的溴区结构域是一种非常有前景的表观遗传新靶点，作用于cbp蛋白溴区结构域的小分子化合物以干扰溴区结构域，可在抗肿瘤与抗炎方面显示出巨大的潜力。近年来，一系列cbp溴区抑制剂，如sgc-cbp30、cpi-703、xpm-cbp、ischeminsodiumsalt等，已陆续研制开发。然而，上述抑制剂由于选择性、毒副作用等原因，在进入临床试验过程中有一定的限制。因此，应用已知药物或者化合物开发原适应症以外的用途，因其药理药动药效以及毒性信息相对传统创新药物研发更加完善，能很大程度上降低研发风险。

吲哚布洛芬（indoprofen）是一种非甾体抗炎药，可用于治疗风湿性关节炎、骨关节炎和癌症疼等。吲哚布洛芬的镇痛、消炎作用机制尚未明确，已有文献表明可能是通过抑制前列腺素或其他刺激性介质的合成为在炎症组织局部发挥作用。目前没有研究显示吲哚布洛芬或其衍生物可与cbp的溴区结合，以影响cbp的乙酰化转移酶活性。

技术实现要素：

本发明首先通过计算机高通量虚拟筛选，提供一系列靶点为cbp溴区的候选小分子抑制剂（包含8009-6824，4385-0355，7287-0394，碘苷，去氧氟尿苷，氟脲苷，吲哚布洛芬，二羟苯腙）；然后通过蛋白-小分子互作检测以及细胞水平上的生物活性检测，提供了吲哚布洛芬作为cbp溴区抑制剂的新用途。

为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：

本发明的第一个方面，提供了cbp溴区抑制剂的虚拟筛选方法，其包含：从pdb中获取cbp溴区与sgc-cbp30、cpi-703、xpm-cbp、ischeminsodiumsalt等抑制剂的共晶三维结构，依据结合位点设计活性口袋的步骤；根据设定的活性口袋，利用discoverystudio2.5中cdocker进行分子对接，打分排序筛选的步骤；以现有抑制剂为模板，利用discoverystudio2.5中hiphop构建药效团模型进行活性筛选的步骤。

本发明的第二个方面，提供了吲哚布洛芬作为cbp溴区抑制剂的新用途，初筛的小分子化合进行活性筛选中，对虚拟筛选出的小分子化合物进行cbp溴区抑制作用的细胞水平检测，发现：吲哚布洛芬对cbp溴区依赖的组蛋白h3与高迁移率族蛋白b1(hmgb1)的乙酰化程度的抑制；吲哚布洛芬与cbp溴区结构域具有分子间相互作用；吲哚布洛芬相似于sgc-cbp30，可以显著抑制rhhmgb1的促炎活性。

本发明的显著优点：本发明的cbp溴区抑制剂虚拟筛选方法可以缩短筛选时间且提高筛选效率；且通过后续的蛋白-小分子互作实验以及生物活性测定实验，得到潜在cbp溴区抑制剂——吲哚布洛芬，可以明显的影响溴区依赖的cbp作为乙酰化转移酶的功能；进一步的生物功能细胞实验显示吲哚布洛芬与现有市面上最强效的cbp溴区抑制剂sgc-cbp30相似，可以显著抑制rhhmgb1的促炎活性。而且，吲哚布洛芬作为一种“老药”，已经进行过临床前和临床试验，可以少做一些新药评审所必须的实验研究，出现未知的不良反应的风险也大为降低，所以吲哚布洛芬有望作为一种cbp溴区抑制剂被开发为临床抗肿瘤与抗炎方面药物。

附图说明

图1用于说明在进行cbp溴区抑制剂虚拟筛选时，执行药效基团的搜索和对接仿真的过程的模式图。

图2构建的cbp溴区抑制剂活性口袋的示意图。

图3虚拟筛选出的八种小分子化合物的结构图。

表1虚拟筛选的小分子化合物的溶解信息。

图4cck8方法检测不同浓度i.8009-6824，ii.4385-0355，iii.7287-0394，iv.碘苷，v.去氧氟尿苷，vi.氟脲苷，vii.吲哚布洛芬，viii.二羟苯腙对细胞活性进行检测。

表2虚拟筛选的小分子化合物的细胞用药浓度选择。

图5aelisa方法检测虚拟筛选的小分子化合物对lps刺激18小时的thp-1细胞释放hmgb1的影响。

图5bwesternblot方法检测虚拟筛选的小分子化合物对lps刺激4小时的thp-1细胞中组蛋白h3乙酰化的影响。

图6生物膜干涉技术（bli）检测吲哚布洛芬与cbp溴区结构域具有分子间相互作用。其中6ani-nta偶联固化cbp溴区结构域；6b芯片固化cbp溴区结构域与不同浓度吲哚布洛芬结合的相互作用的信号与数据；6cdataanalysissoftware9.0处理cbp溴区结构域与吲哚布洛芬相互作用数据曲线。

表3cbp溴区结构域与吲哚布洛芬相互作用数据分析。

图7以sgc-cbp30为阳性对照，检测吲哚布洛芬对rhhmgb1的促炎活性的影响。7a对hmgb1诱导的tnf-α、il-1β、il-6的释放的影响；7bwesternblot方法检测对hmgb1激活的mapks(p-jnk、p-erk、p-p38)与nf-κb(p-ikk、p-iκb)信号通路的影响。

具体实施方式：

为了加深对本发明的理解，下面结合附图对本发明的实施例做详细的说明。

实施例1cbp溴区抑制剂的虚拟筛选

实验材料：discoverystudio2.5，targetmol商业小分子化合物库

实验步骤：（1）从pdb中获取cbp溴区(id:3dwy)与已文献报道的sgc-cbp30、cpi-703、xpm-cbp、ischeminsodiumsalt等经典cbp溴区抑制剂的共晶三维结构（id：5bt3，5dbm，5nu5，5lpj，5lpl，5mqk，6axq等），依据结合的位点(如lys1139，asp1143等)设定抑制剂活性口袋；（2）从targetmol商业小分子化合物库随机抽取1000个小分子化合物，利用discoverystudio2.5中cdocker分子对接模块进行对接打分（cdocker_energy值，rmsd值）；（3）利用discoverystudio2.5中hiphop基于分子共同特征的药效团构建模块，以现有cbp溴区抑制剂为训练集构建定量药效团模型，对（2）中筛选出来的小分子进行第二轮筛选，根据小分子与药效团的匹配度最终确定8个候选分子。

实验结果：经过图1所示的药效团搜索和对接仿真过程，我们构建基于cbp溴区蛋白与配体复合物的药效团模型。通过参数设置时的selectivityscoring和展开advanced选项后进行viladation操作得到cbp溴区配体的药效团模型，其中蓝色与粉红色球体为设定的抑制剂活性口袋（图2）。采用药效团进行targetmol商业小分子化合物库数据筛选得到匹配度最高的八种化合物为：i.8009-6824，ii.4385-0355，iii.7287-0394，iv.碘苷，v.去氧氟尿苷，vi.氟脲苷，vii.吲哚布洛芬，viii.二羟苯腙（图3）。

实施例2对cbp溴区抑制作用的细胞水平检测

细胞培养：人单核细胞型淋巴瘤细胞株thp1（购买自中国科学院上海分院生物化学与细胞生物学研究所细胞库)在37℃，5％co2条件下，用含15％胎牛血清(wisent公司)和抗生素(100u/ml青霉素和100μg/ml链霉素，wisent公司)的rpmi1640完全培养液(wisent公司)培养。

实验步骤：

（1）取对数生长期的thp-1细胞，以每孔4×10³细胞数接种到96孔板中。与37℃，5%co2的细胞培养箱中培养24小时后加入各个浓度的8009-6824，4385-0355，7287-0394，碘苷，去氧氟尿苷，氟脲苷，吲哚布洛芬，二羟苯腙继续培养72小时。之后每孔加入10μl的cck8试剂与细胞共孵育2小时。在酶标仪450nm出测定吸光值。

（2）将thp-1细胞以5×10⁵/孔接种于12孔板中，当细胞密度达到70%-80%时，相应浓度的各个化合物与thp-1细胞预孵育2小时，然后与lps(500ng/ml)共孵育18小时，elisa检测细胞上清中hmgb1水平。

（3）将thp-1细胞以5×10⁵/孔接种于12孔板中，当细胞密度达到70%-80%时，相应浓度的各个化合物与thp-1细胞预孵育2小时，然后与lps(500ng/ml)共孵育4小时，免疫印迹方法检测ace-h3，h3以及β-actin的蛋白水平。

实验结果：

（1）我们将筛选出的小分子化合物通过化合物库检索得到相关的溶解信息（表1）。

表1

利用cck8方法检测筛选出的小分子化合物对thp-1细胞的细胞活性影响（图4），吸光度检测数值分析，小分子化合物最终选择的对细胞活性没有显著影响的浓度为：8009-6824（lowdose：0.5μm；highdose：1μm），4385-0355（lowdose：10μm；highdose：19μm），7287-0394（lowdose：40μm；highdose：155.72μm）,碘苷（lowdose：5μm；highdose：10μm），去氧氟尿苷（lowdose：6.2μm；highdose：12.4μm），氟脲苷（lowdose：8μm；highdose：50μm），吲哚布洛芬（lowdose：7.5μm；highdose：20μm），二羟苯腙（lowdose：40μm；highdose：78μm）（表2）。

表2

（2）lps(500ng/ml)刺激thp-1细胞18小时后，细胞上清中释放的hmgb1水平明显增高；而7287-0394（40μm、155.72μm）、4385-0355（19μm）、氟脲苷（8μm、50μm）能够一定程度抑制lps引起的hmgb1释放，吲哚布洛芬（7.5μm、20μm），二羟苯腙（78μm）类似于高效特异性cbp溴区抑制剂sgc-cbp30对lps引起的hmgb1释放具有显著的抑制效果（图5a）。

（3）与空白对照组相比，lps(500ng/ml)刺激明显增加了组蛋白h3的乙酰化程度，但吲哚布洛芬（7.5μm、20μm），二羟苯腙（40μm、78μm）与阳性抑制剂sgc-cbp30处理可显著降低lps诱导的组蛋白h3乙酰化程度（图5b）。

通过小分子化合物对cbp溴区抑制作用的体外细胞实验数据综合分析，得出吲哚布洛芬与二羟苯腙对cbp溴区依赖的cbp乙酰化转移酶活性具有抑制作用。

实施例3检测吲哚布洛芬与cbp溴区互作情况

实验材料：octet®octetk2system（pallfortebiocorp，menlopark，ca）；assaybuffer：pbst(ph7.4)+5%dmso（ph7.4pbs，tween200.05%+5%dmso，v/v）；ni-ntabiosensors（fortebio，partno.18-5101）；重组cbp溴区蛋白；吲哚布洛芬（购于sigma公司）。

实验步骤：

（1）ni-nta偶联固化：偶联样品为重组cbp溴区蛋白，最高浓度为50μm，两倍浓度梯度稀释，共5个浓度（图6a）。

（2）重组cbp溴区蛋白同吲哚布洛芬间相互作用：分析物样品为吲哚布洛芬，稀释缓冲液为pbst（ph7.4，0.05%tween20和5%dmso）。其中，分析物浓度范围为：50um，25um，12.5um，6.25um，3.125um，对照缓冲液为pbst+5%dmso（ph7.4pbs，tween200.05%+5%dmso，v/v）。

实验结果：a9-g9为芯片固化重组cbp溴区蛋白与不同浓度的吲哚布洛芬结合的相互作用的信号和数据；h9为芯片固化重组cbp溴区蛋白与对照缓冲液相互作用的信号和数据。通过dataanalysissoftware9.0对实验数据进行处理。拟合模型选择：1：1模型，即一个重组cbp溴区蛋白结合1个吲哚布洛芬。拟合方式：global，即把5个浓度作为一组关联进行分析拟合(图6b,c)。根据相互作用曲线图，结合重组cbp溴区蛋白与吲哚布洛芬之间的相互作用动力学实验数据，可以看出随着吲哚布洛芬的浓度增加，实验数据中结合信号的数值有明显的统计学正相关性，且kd在10^-4-10^-7之间，因此判定重组cbp溴区蛋白与吲哚布洛芬之间有相互作用(表3)。

表3

实施例4验证吲哚布洛芬的cbp溴区靶向性

实验步骤：将thp-1细胞以5×10⁵/孔接种于12孔板中，当细胞密度达到70%-80%时，sgc-cbp30（cbp30溴区强效抑制剂，阳性对照，购于selleck公司）或吲哚布洛芬与thp-1细胞预孵育2小时，然后与rhhmgb1(500ng/ml)共孵育12小时，elisa检测细胞上清中tnf-α、il-1β和il-6水平。

将thp-1细胞以5×10⁵/孔接种于12孔板中，当细胞密度达到70%-80%时，sgc-cbp30或吲哚布洛芬与thp1细胞预孵育2小时，然后与rhhmgb1(100ng/ml)共孵育30分钟，免疫印迹方法检测jnk、erk、p38、ikkα/β和iκb的磷酸化水平。

结果显示：rhhmgb1(500ng/ml)刺激thp-1细胞12小时后，细胞上清中释放的tnf-α、il-1β和il-6水平明显增多；而不同浓度吲哚布洛芬（7.5、20μm）处理细胞，能显著剂量依赖性的抑制rhhmgb1引起的tnf-α、il-1β和il-6释放，与阳性对照组sgc-cbp30组得到相似的结果（图7a）。

吲哚布洛芬处理thp-1细胞后再与rhhmgb1共孵育30分钟，mapks(jnk、erk、p38)的磷酸化被显著削弱，并呈现出明显的吲哚布洛芬剂量依赖效应；且吲哚布洛芬预处理后，rhhmgb1引起的ikkα/β和iκb的磷酸化程度以及ikbα蛋白的降解均发生明显的阻滞，且呈现剂量依赖性，与阳性对照组sgc-cbp30组得到相似的结果（图7b）。

本发明方案所公开的技术手段不仅限于上述技术手段所公开的技术手段，还包括由以上技术特征等同替换所组成的技术方案。本发明的未尽事宜，属于本领域技术人员的公知常识。