钙离子载体在白癜风治疗中的应用的制作方法

本发明属于医药领域，具体涉及钙离子载体在白癜风治疗中的应用。

背景技术：

白癜风是一种常见的获得性色素脱失性皮肤黏膜病，其临床特征主要表现为表皮黑色素细胞减少或消失而出现色素脱失斑。全球发病率约为0.5％，我国患病人数在1500万人以上，发病人群以年轻人居多。其病因复杂，病情反复，确切发病机制尚未明确。

白癜风的有效治疗目前仍是临床治理的难题，现有的治疗药物和方法包括局部外用药、光疗或光化学治疗、手术治疗、系统使用免疫调节药物、系统小剂量糖皮质激素、中医中药辩证施治。其中，对于白癜风的局部治疗，主要包括局部外用药、光疗和光化学疗法。局部外用药包括外用糖皮质激素和用钙调神经磷酸酶抑制剂，外用糖皮质激素，因其抗炎和免疫调节作用而被作为局限型白癜风的一线疗法；外用钙调神经磷酸酶抑制剂可以影响t细胞的活化和分化、抑制细胞因子如tnf-β的合成，亦可促进黑色素细胞的迁移和分化。光化学疗法常用puva疗法，于患处涂抹补骨脂素后照射uva(波长为320～420nm的紫外线)，puva可诱导促黑素生成，促进黑色素体向角质形成细胞转移。目前临床上常用窄波uvb(波长为311-313nm的紫外线)照射患处，其不良反应比puva疗法少。

白癜风现有治疗药物和方法往往单独或者联合使用，虽然取得了一定的治疗效果，但是存在有效率较低、作用部位局限、复发率较高等缺陷。局部外用药：使用外用糖皮质激素治疗时，在头颈部的有效率为75％，但是在肢端有效率仅为33％。使用外用钙调神经磷酸酶抑制剂时，其有效作用部位局限于头颈部，有效率约为50％-60％，而肢端反应较差。光化学疗法：puva疗法的复色率为70％～80％，但完全复色的患者仅占20％，75％的患者在1～2年内复发。同时长期使用puva疗法会增加患皮肤癌的风险。uvb光疗：有效率约为50％，停止照射uvb后长期复发率为21％，1年内复发率在44％，两年内复发率为55％。

现有治疗药物和方法虽然取得了一定的疗效，但是现有药物和方法并没有充分纠正白癜风患处黑色素细胞对钙离子的摄取和转运障碍，没能改善和恢复黑色素细胞钙稳态，也没能进一步为患处黑色素细胞提供一个更加良好的细胞内钙环境，从而影响患处黑色素细胞的生理活动，一定程度地限制了现有药物和方法的治疗效果，也增加了疾病复发的可能性。然而，目前并没有可靠的辅助药物可以提高现有疗法的治疗效果并巩固其治疗成果，所以现有药物和方法的缺陷不能得到较好的改善，从而影响白癜风患者对治疗的满意度。

因此在白癜风治疗领域，寻求一种辅助用药来辅助现有药物和方法，为现有的白癜风治疗提供一个更加良好的细胞环境，从而提高现有药物和方法的治疗效果，巩固其治疗成果，减少疾病复发率是本领域亟待解决的技术问题。

技术实现要素：

钙离子作为细胞信号转导通路中常见的多效信使，对黑色素细胞正常的生理活动起重要的调控作用。大量文献表明其一方面可以调控黑色素细胞合成及转运黑色素，另一方面也可以减少自由基和氧化应激对黑色素细胞的破坏。本发明团队在大量研究白癜风发病机制时发现，白癜风患处黑色素细胞对钙离子的摄取和转运存在障碍，而治疗白癜风的现有药物和方法并不能有效纠正这一问题。

钙离子载体是一类移动性离子载体，可以运输钙离子进入细胞质，增加胞质的游离钙离子浓度，是细胞生物学研究中常见的实验室用药。另外，钙离子载体也可以通过增加人或哺乳动物精子内的钙离子浓度，从而诱导精子获能，因此被广泛应用于畜牧业养殖中，同时也已经被应用于试管婴儿技术。

针对白癜风患处黑色素细胞对钙离子的摄取和转运存在障碍这一问题，本发明通过在患处涂抹钙离子载体，增加患处黑色素细胞对钙离子的摄取，来改善和恢复黑色素细胞钙稳态，为白癜风患处黑色素细胞提供一个更加良好的细胞内钙环境，进而有助于黑色素的合成及转运，增强黑色素细胞对自由基和氧化应激的防御。本发明旨在作为白癜风现有治疗药物和方法的辅助用药，通过为白癜风治疗提供一个更加良好的细胞内钙环境，来辅助现有的治疗药物和方法，增加其治疗效果并巩固其治疗成果，进而减少其复发率，从而增加白癜风患者对治疗的满意度。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：将钙离子载体及其衍生物用于治疗白癜风。

本发明还提供一种治疗白癜风的局部外用药，所述药物包括有效量的钙离子载体及其衍生物和药学上可接受的载体；所述钙离子载体及其衍生物选自以下钙离子载体中的任意一种或几种，具体见表1：

表1：本发明用于辅助治疗白癜风的钙离子载体

所述钙离子载体在所述局部外用药中的浓度为5-5000μmol/l。

优选地，所述治疗白癜风的局部外用药以液体、半固体、固体或者气雾剂形态使用。

优选地，所述液体形态为水溶性或者非水溶性的混悬液、溶液、啫喱、乳剂(包括膏霜)、软膏、凝胶、浆液或者喷雾剂。

优选地，所述治疗白癜风的局部外用药作为辅助用药来辅助现有的治疗药物(外用糖皮质激素、外用钙调神经磷酸酶抑制剂、系统使用免疫调节药物、系统使用小剂量糖皮质激素)与方法(窄波uvb光疗、puva疗法)。

本发明的有益效果为：本发明通过在患处涂抹钙离子载体，增加患处黑色素细胞对钙离子的摄取，改善和恢复黑色素细胞钙稳态，为白癜风治疗提供一个更加良好的细胞内钙环境，以此来辅助现有的治疗药物和方法，增加现有药物和方法的治疗效果并巩固其治疗成果，进而减少疾病复发率，最后使白癜风患者对治疗的满意度增加。

附图说明

图1为实施例1联合使用钙离子载体ⅰ和窄波uvb治疗白癜风的结果示意图。

图2为实施例2联合使用钙离子载体ⅳ和窄波uvb治疗白癜风的结果示意图。

图3为实施例3联合使用钙离子载体ⅱ和地塞米松治疗白癜风的结果示意图。

图4为实施例4联合使用钙离子载体ⅴ和地塞米松治疗白癜风的结果示意图。

图5为实施例5联合使用钙离子载体氯四环素和钙调神经磷酸酶抑制剂他克莫司治疗白癜风的结果示意图。

图6为实施例6联合使用钙离子载体ⅲ和窄波uvb治疗白癜风的结果示意图。

图7为实施例7联合使用钙离子载体ⅵ和puva疗法治疗白癜风的结果示意图。

图8为实施例8联合使用钙离子载体ionomycine和糖皮质激素糠酸莫米松治疗白癜风的结果示意图。

具体实施方式

为了更加简洁明了的展示本发明的技术方案、目的和优点，下面结合具体实施例详细说明本发明的技术方案。

实施例1

联合使用钙离子载体ⅰ和窄波uvb治疗白癜风，观察其对人黑色素细胞合成黑色素的效果。

1.材料

1.1细胞系：人白癜风病灶周围黑色素细胞，昆明医科大学第一附属医院皮肤科惠赠。

1.2药物：钙离子载体ⅰ，casno.58801-34-6，规格：50mg，品牌：sigma。

1.3试剂及耗材：黑色素细胞培养基(melm)购自美国蓝白公司，胎牛血清购自德国pan公司，胰蛋白酶trypsin购自上海生工生物工程有限公司，二甲基亚砜(dmso)购自美国sigma公司，3.5厘米细胞培养板购自美国corning公司，标准黑色素购自美国sigma公司，bca蛋白浓度测定试剂盒购自中国碧云天生物技术公司。

1.4仪器：白癜风uvb光疗仪，品牌：sigma，型号：双管ss-01；酶标仪，美国赛默飞公司；超净工作台，青岛海尔医用低温科技有限公司；co2培养箱，新加坡esco公司；倒置显微镜，日本nikon公司；冷冻离心机，美国赛默飞公司。

2.试验方法

2.1细胞培养：细胞培养于含0.05g/l链霉素、0.05g/l青霉素、10％胎牛血清的黑色素细胞培养基中，置37℃、5％co2及饱和湿度的恒温孵育箱中培养。

2.2实验分组：实验分为4组，分别是阴性对照组(a组)、uvb单独作用组(b组)、钙离子载体ⅰ单独作用组(c组)、uvb与钙离子载体ⅰ联合作用组(d组)，以上4组除相关变量不同外其余变量保持一致。阴性对照组，这组细胞不作任何处理；uvb单独作用组，使用白癜风uvb光疗仪照射该组细胞，辐照剂量为9j/cm²，之后继续培养12小时；钙离子载体ⅰ单独作用组，在该组细胞培养基中添加钙离子载体ⅰ，使其浓度为10umol/l，之后继续培养12小时；uvb与钙离子载体ⅰ联合作用组，在该组细胞培养基中添加钙离子载体ⅰ，使其浓度为10umol/l，同时使用白癜风uvb光疗仪照射该组细胞，辐照剂量为9j/cm²，之后继续培养12小时。

2.3提取黑色素并测量黑色素含量：培养结束后把以上4组细胞分别刮下来，收集在ep管中离心，弃掉培养基。每管细胞中加入含1％triton-x100的pbs溶液，低温裂解1小时。裂解结束后使用冷冻离心机离心30分钟，转速为15000g，离心结束后上清液为蛋白溶液、管底不溶部分为黑色素。取上层蛋白溶液，用bca法测出每管细胞蛋白浓度，计算相应的蛋白量(mg)。吸除所有上清液，然后往每个ep管中加入浓度为1n的naoh溶液，在85℃加热直到所有的黑色素沉淀溶解，涡旋振荡均匀。用sigma标准黑色素配置浓度梯度，使用分光光度计测出每管细胞的黑色素浓度，计算相应的黑色素量(mg)。最后，以每管细胞的黑色素量/该管细胞的蛋白量作为该管细胞的黑色素的含量，即mg黑色素/mg蛋白。

2.4统计方法：以阴性对照组的黑色素含量为基础值(在统计图中，默认阴性对照组的黑色素含量为数值1)，计算其余三组实验组的相对黑色素增加量，使用统计软件绘制柱状图。

3.实验结果

如图1，uvb单独作用组黑色素增加，钙离子载体ⅰ单独作用组黑色素有少量增加，而uvb与钙离子载体ⅰ联合作用组黑色素显著增加。采用spss17.0统计软件进行统计学分析，t检验得p＜0.05，差异有统计学意义。

实施例2

联合使用钙离子载体ⅳ和窄波uvb，观察其对黑色素细胞合成黑色素的效果。除以下区别外，其它同实施例1。

1材料

1.2药物：钙离子载体iv，casno.126572-74-5，规格：50mg，品牌：sigma。

2试验方法

2.2实验分组：实验分为4组，分别是阴性对照组(a组)、uvb单独作用组(b组)、钙离子载体ⅳ单独作用组(c组)、uvb与钙离子载体ⅳ联合作用组(d组)，以上4组除相关变量不同外其余变量保持一致。阴性对照组，这组细胞不作任何处理；uvb单独作用组，使用白癜风uvb光疗仪照射该组细胞，辐照剂量为9j/cm²，之后继续培养12小时；钙离子载体ⅳ单独作用组，在该组细胞培养基中添加钙离子载体ⅳ，使其浓度为10umol/l，之后继续培养12小时；uvb与钙离子载体ⅳ联合作用组，在该组细胞培养基中添加钙离子载体ⅳ，使其浓度为10umol/l，同时使用白癜风uvb光疗仪照射该组细胞，辐照剂量为9j/cm²，之后继续培养12小时。

3.实验结果

如图2，uvb单独作用组黑色素增加，钙离子载体ⅳ单独作用组黑色素有少量增加，而uvb与钙离子载体ⅳ联合作用组黑色素显著增加。采用spss17.0统计软件进行统计学分析，t检验得p＜0.05，差异有统计学意义。

实施例3

联合使用钙离子载体ⅱ和地塞米松，观察其对黑色素细胞合成黑色素的效果。除以下区别外，其它同实施例1。

1材料

1.2药物：钙离子载体ii，casno.74267-27-9，规格：50mg，品牌：sigma。地塞米松，casno.50-02-2，规格：100mg，品牌：sigma。

2实验方法

2.2实验分组：实验分为4组，分别是阴性对照组(a组)、地塞米松单独作用组(b组)、钙离子载体ⅱ单独作用组(c组)、地塞米松与钙离子载体ⅱ联合作用组(d组)，以上4组除相关变量不同外其余变量保持一致。阴性对照组，这组细胞不作任何处理；地塞米松单独作用组，在该组细胞培养基中添加地塞米松，使其浓度为1μmol/l，之后继续培养12小时；钙离子载体ⅱ单独作用组，在该组细胞培养基中添加钙离子载体ⅱ，使其浓度为10umol/l，之后继续培养12小时；地塞米松与钙离子载体ⅱ联合作用组，在该组细胞培养基中添加钙离子载体ⅱ，使其浓度为10umol/l，在该组细胞培养基中添加地塞米松，使其浓度为1μmol/l，之后继续培养12小时。

3.实验结果

实验结果如图3。地塞米松单独作用组黑色素增加，钙离子载体ⅱ单独作用组黑色素几乎不增加，而地塞米松与钙离子载体ⅱ联合作用组黑色素显著增加。采用spss17.0统计软件进行统计学分析，t检验得p＜0.05，差异有统计学意义。

实施例4

联合使用钙离子载体ⅴ和地塞米松，观察其对黑色素细胞合成黑色素的效果。除以下区别外，其它同实施例1。

1材料

1.2药物：钙离子载体ⅴ，casno.160563-01-9，规格：50mg，品牌：sigma。地塞米松，casno.50-02-2，规格：100mg，品牌：sigma。

2实验方法

2.2实验分组：实验分为4组，分别是阴性对照组(a组)、地塞米松单独作用组(b组)、钙离子载体ⅴ单独作用组(c组)、地塞米松与钙离子载体ⅴ联合作用组(d组)，以上4组除相关变量不同外其余变量保持一致。阴性对照组，这组细胞不作任何处理；地塞米松单独作用组，在该组细胞培养基中添加地塞米松，使其浓度为1μmol/l，之后继续培养12小时；钙离子载体ⅴ单独作用组，在该组细胞培养基中添加钙离子载体ⅴ，使其浓度为10umol/l，之后继续培养12小时；地塞米松与钙离子载体ⅴ联合作用组，在该组细胞培养基中添加钙离子载体ⅴ，使其浓度为10umol/l，在该组细胞培养基中添加地塞米松，使其浓度为1μmol/l，之后继续培养12小时。

3.实验结果

实验结果如图4。地塞米松单独作用组黑色素增加，钙离子载体ⅴ单独作用组黑色素有少量增加，而地塞米松与钙离子载体ⅴ联合作用组黑色素显著增加。采用spss17.0统计软件进行统计学分析，t检验得p＜0.05，差异有统计学意义。

实施例5

联合使用钙离子载体氯四环素和钙调神经磷酸酶抑制剂他克莫司，观察其对黑色素细胞合成黑色素的效果。除以下区别外，其它同实施例1。

1材料

1.2药物：氯四环素，casno.57-62-5，规格：100mg，品牌：mce。他克莫司，casno.109581-93-3，规格：150mg，品牌：sigma。

2实验方法

2.2实验分组：实验分为4组，分别是阴性对照组(a组)、他克莫司单独作用组(b组)、氯四环素单独作用组(c组)、他克莫司与氯四环素联合作用组(d组)，以上4组除相关变量不同外其余变量保持一致。阴性对照组，这组细胞不作任何处理；他克莫司单独作用组，在该组细胞培养基中添加他克莫司，使其浓度为0.1μmol/l，之后继续培养12小时；氯四环素单独作用组，在该组细胞培养基中添加氯四环素，使其浓度为2.5umol/l，之后继续培养12小时；他克莫司与氯四环素联合作用组，在该组细胞培养基中添加氯四环素，使其浓度为2.5umol/l，在该组细胞培养基中添加他克莫司，使其浓度为0.1μmol/l，之后继续培养12小时。

3.实验结果

实验结果如图5。他克莫司单独作用组黑色素增加，氯四环素单独作用组黑色素有少量增加，而他克莫司与氯四环素联合作用组黑色素显著增加。采用spss17.0统计软件进行统计学分析，t检验得p＜0.05，差异有统计学意义。

实施例6

构建白癜风豚鼠模型，联合使用钙离子载体ⅲ(又名为a23187)和窄波uvb，观察其治疗效果。

1实验材料

1.1动物：英国短毛种黑色豚鼠4只，普通级，350-400克，雌性，由湖南太平生物科技有限公司提供，实验动物质量合格证编号no44002100007496，许可证号scxk(湘)2015-0004。

1.2药物：4-甲氧基苯酚(mmh)，规格：100g，品牌：梯希爱(tci)；钙离子载体ⅲ(又名为a23187)，casno.52665-69-7，规格：50mg，品牌：abcam；二甲基亚砜(dmso)，规格：500ml，品牌：sigma。

1.3仪器：白癜风uvb光疗仪，品牌：sigma，型号：双管ss-01；分光测色仪，品牌：3nh(三恩时)，型号：ys4510。

2实验步骤

2.1造模：取豚鼠4只，剪去豚鼠背部长毛，剃去面积约6cm×6cm短毛，在每只豚鼠的剃毛部位用标记笔各标出12个直径为1cm的圆孔，按3×4的格式排列。以浓度为30％的dmso作为溶剂配制质量分数为10％的4-甲氧基苯酚溶液，在每个圆孔处分别涂抹10μl4-甲氧基苯酚溶液进行脱色，1天1次。每天重复以上步骤，用药14天后圆孔处变白，完成造模。

2.2分组、给药：以浓度为30％的dmso作为溶剂配制浓度为500μmol/l的a23187溶液。将4只白癜风模型豚鼠随机编号为1-4号。1号和2号豚鼠作为实验组，在每个圆孔处涂抹10μla23187溶液，1天1次。3号和4号豚鼠作为对照组，在每个圆孔处涂抹10μl溶剂(30％dmso溶液)，1天1次。

2.3照射uvb：完成给药后，随即实验组和对照组均照射uvb，辐照剂量为10j/cm2。每天重复以上步骤2.2和2.3，持续56天。

2.4测量并记录数据：同时，我们根据国际照明委员会规定的l*a*b*颜色系统(cie1976l*a*b*)，使用分光测色仪测量并记录圆孔处皮肤颜色的l值，并记录给药0天、7天、14天、21天、28天、35天、42天、49天和56天的数据，并绘制曲线图。在l*a*b*颜色系统中，l值反映色彩的明暗程度，l值越大表示其颜色越白，l值越小则表示其颜色越黑。

3.实验结果

如图6，实验组和对照组豚鼠背部圆孔处均有明显变黑，两组l值均出现下降。但相比对照组，实验组l值下降更多，色素沉着更加明显。采用spss17.0统计软件进行统计学分析，t检验得p＜0.05，差异有统计学意义。通过上述实验说明，采用本发明所述方法可以增加uvb疗法对白癜风的治疗效果。

实施例7

构建白癜风豚鼠模型，联合使用钙离子载体ⅵ和puva疗法，观察其治疗效果。除以下区别外，其余同实施例6.

1.实验材料

1.2药物：4-甲氧基苯酚(mmh)，规格：100g，品牌：tci；钙离子载体ⅵ，casno.171979-66-1，规格：10mg，品牌：希恩斯；二甲基亚砜(dmso)，规格：500ml，品牌：sigma。敏柏宁酊剂，规格:24ml，含0.75％8-甲氧补骨脂素(8-mop)，品牌：法国康密迪加大药厂。

1.3仪器：uva(360nm)lde灯板，规格：yl-uvahp-360-jc3028.8*12.6(30个灯)，厂家：韩国lg；分光测色仪，品牌：3nh(三恩时)，型号：ys4510。

2.实验步骤

2.2分组、给药：以浓度为30％的dmso作为溶剂配制浓度为500μmol/l的钙离子载体ⅵ溶液。将4只白癜风模型豚鼠随机编号为1-4号。1号和2号豚鼠作为实验组，在每个圆孔处涂抹10μl钙离子载体ⅵ溶液，1天1次。3号和4号豚鼠作为对照组，在每个圆孔处涂抹10μl溶剂(30％dmso溶液)，1天1次。

2.3联合puva疗法：使用75％乙醇稀释敏柏宁酊剂，配制浓度为0.15％的8-mop酊剂。在对照组和实验组的每个圆孔处均涂抹10μl8-甲氧补骨脂素酊剂，随即两组豚鼠均照射uva，辐照剂量为10j/cm2。每天重复以上步骤2.2和2.3，持续56天。

3.实验结果

如图7，实验组和对照组豚鼠背部圆孔处均有明显变黑，两组l值均出现下降。但相比对照组，实验组l值下降更多，色素沉着更加明显。采用spss17.0统计软件进行统计学分析，t检验得p＜0.05，差异有统计学意义。通过上述实验说明，采用本发明所述方法可以增加puva疗法对白癜风的治疗效果。

实施例8

构建白癜风豚鼠模型，在模型脱色部位涂抹钙离子载体ionomycine和糖皮质激素糠酸莫米松，观察其治疗效果。除以下区别外，其它同实施例6。

1.实验材料

1.2药物：4-甲氧基苯酚(mmh)，规格：100g，品牌：tci；钙离子载体ionomycine，casno.56092-81-0，规格：50mg，品牌：sigma；二甲基亚砜(dmso)，规格：500ml，品牌：sigma。糠酸莫米松，规格：5g，国家药品标准ws1-(x-025)-2004z，厂家：上海先灵葆雅制药有限公司。

1.3仪器：分光测色仪，品牌：3nh(三恩时)，型号：ys4510。

2.实验过程

2.2分组、给药：以浓度为30％的dmso作为溶剂配制浓度为500μmol/l的钙离子载体ionomycine溶液。将4只白癜风模型豚鼠随机编号为1-4号。1号和2号豚鼠作为实验组，在每个圆孔处涂抹10μl钙离子载体ionomycine溶液，1天1次。3号和4号豚鼠作为对照组，在每个圆孔处涂抹10μl溶剂(30％dmso溶液)，1天1次。

2.3涂抹糠酸莫米松：在对照组和实验组的每个圆孔处均匀涂抹1mg糠酸莫米松。每天重复以上步骤2.2和2.3，持续56天。

3.实验结果

如图8，实验组和对照组豚鼠背部圆孔处均有明显变黑，两组l值均出现下降。但相比对照组，实验组l值下降更多，色素沉着更加明显。采用spss17.0统计软件进行统计学分析，t检验得p＜0.05，差异有统计学意义。通过上述实验说明，采用本发明所述方法可以增加糖皮质激素对白癜风的治疗效果。