硼替佐米及其制剂在制备治疗脉络膜新生血管性相关疾病药物上的应用及滴眼液制备方法与流程

[0001]
本发明涉及眼科学技术领域，具体涉及硼替佐米及其制剂在制备治疗脉络膜新生血管性相关疾病药物上的应用及滴眼液制备方法。


背景技术：

[0002]
年龄相关性黄斑变性（age-related macular degeneration, amd）是引起老年人视力损害和致盲主要原因之一，其中湿性年龄相关性黄斑变性为重要的致盲因素之一，特征性的病理改变为脉络膜血管新生(cnv)。anti-vegf（血管内皮细胞生长因子）抗体是目前最主要的治疗方法，但副作用大，长期使用后引起视网膜、脉络膜萎缩。因而，研究副作用小、疗效好的的治疗方法势在必行。


技术实现要素：

[0003]
为了解决现有技术存在的技术缺陷，本发明提供了硼替佐米及其制剂在制备治疗脉络膜新生血管性相关疾病药物上的应用及滴眼液制备方法。
[0004]
本发明采用的技术解决方案是：硼替佐米及其制剂在制备治疗脉络膜新生血管性相关疾病药物上的应用。
[0005]
所述的脉络膜新生血管性相关疾病为年龄相关性黄斑变性。
[0006]
所述的药物为玻璃体腔注射药物。
[0007]
所述的药物为玻璃体腔注射药物为滴眼液。
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一种用于治疗脉络膜新生血管性相关疾病的滴眼液的制备方法，包括以下步骤：将dmso加到硼替佐米中，配成母液；取出母液加入ddh
202
稀释10倍。从稀释的溶液中，再加入ddh
202
，得到硼替佐米滴眼液。
[0009]
所述的硼替佐米滴眼液终浓度为5.76μg/ml。
[0010]
所述的dmso占硼替佐米滴眼液终浓度的0.1%。
[0011]
本发明的有益效果是：本发明提供了硼替佐米及其制剂在制备治疗脉络膜新生血管性相关疾病药物上的应用及滴眼液制备方法, 在玻璃体腔注射蛋白酶复合体抑制剂硼替佐米或眼表使用硼替佐米滴眼液，可用于脉络膜新生血管性相关眼底疾病的治疗，如湿性年龄相关性黄斑变性的治疗, 副作用小、疗效好。
附图说明
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图1为在小鼠玻璃体内注射硼替佐米对激光诱导产生的cnv体积的效果图。
[0013]
图2为玻璃体腔内注射硼替佐米对cnv模型小鼠眼底血管的荧光渗漏的效果图 。
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图3为玻璃体腔内注射硼替佐米对cnv动物模型中脉络膜/rpe组织中p-vegfr2和p-pdgfrβ蛋白质水平的影响。
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图4为硼替佐米注射对cnv动物模型中脉络膜/rpe组织中vegf-a和pdgf-d的产生的影响。
[0016]
图5为cnv动物模型中注射硼替佐米，间充质细胞对激光损伤的斑点浸润的影响。
[0017]
图6为注射硼替佐米，小胶质细胞和巨噬细胞对激光点的浸润的影响。
[0018]
图7为对照组和硼替佐米注射组眼睛的暗视和明视erg。
[0019]
图8为眼表给药显著性对cnv模型小鼠眼底血管的荧光渗漏的影响。
具体实施方式
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现结合图1、图2、图3、图4、图5、图6、图7、图8对本发明进行进一步说明。
[0021]
本发明中所用材料可通过市售得到或通过本领域的常规方法得到。
[0022]
激光诱导cnv模型和脉络膜铺片cnv模型使用micron iv系统（phoenix research laboratories，pleasanton，ca）造模，只选择在受伤部位产生气泡的眼睛进行分析。氪红激光（激光间隔为0.05 s，持续时间为0.07 s，功率为240 mw），激光点围绕视盘均匀分布，每个视网膜四个激光点。激光损伤后第二天，将小鼠随机分为玻璃体腔注射生理盐水组（1.5
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l），玻腔注射硼替佐米（15、30、45 pmol，1.5
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l）、抗鼠vegf（（0.3）
µ
g, 1.5
µ
l)。 激光光凝后第七天，脉络膜固定铺片。形成的新生血管通过荧光alexa fluor 594偶联的异凝集素gs-ib4染色，图像用zeiss lsm 710共焦显微镜系统（德国卡尔蔡司）下获取。使用volocity 3d图像软件（perkinelmer）对cnv体积进行分析和定量。为了减少人为偏差最小化，在图像采集、cnv定量过程中，将对照组和处理组随机分配给对组别分配不知情的操作者。
[0023]
激光光凝后的第一天，对两个月大的c57bll6j野生型小鼠进行玻璃腔体内注射生理盐水（a）对照（n = 24），（b）硼替佐米15 pmol（n = 19），（c）30 pmol（n = 35），（d）45 pmol（n = 19）,（e）0.3
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g（n = 9）的小鼠抗vegf抗体。注射后第七天，制作脉络膜铺片并用alexa fluor 594异凝集素 gs-ib4染色，在共聚焦激光显微镜下捕获图像，并使用volocity 3d图像软件分析图像和cnv体积；平均值和标准差在（f）中表示。显示了代表性图像。采用单向方差分析。*p <0.05；**p <0.01。标尺= 21.30
ꢀµ
m。结果如图1所示，可以得出在小鼠玻璃体内注射硼替佐米，显著性减少激光诱导产生的cnv体积。
[0024]
荧光素眼底血管造影使用成像系统进行血管造影成像（micro iv，美国加利福尼亚州普莱森顿）。在腹腔 注射戊巴比妥钠（1％溶液）0.05ml / 10g的剂量麻醉小鼠。再通过腹腔注射0.2 ml 1％fluorescite
®
显示眼底血管。用1％的托吡卡因和1％的去氧肾上腺素盐酸盐的滴眼液扩瞳。将一滴由2.5％甲基纤维素组成的滴眼液涂在角膜表面，并调节micro iv物镜，使其与实验小鼠的眼表接触。使用成像软件（phoenix research laboratories），用滤光片在激发（480 nm）和释放波长（525 nm）下采集图像。荧光素泄漏点分为四个等级，等级i，无过量荧光点；ii级，病变显示高荧光点，无渗漏；iii级，病变在造影过程中显示高荧光，而后形成渗漏；iv级，病变在造影过程中显示高荧光后，后期荧光渗漏超出烧伤区域的边界。用imagejtm值软件（美国马里兰州贝塞斯达的国立卫生研究院）对荧光渗漏区域进行定量。
[0025]
激光光凝后的第一天，对两个月大的c57bll6j野生型小鼠进行玻璃体腔内注射生理盐水，对照（n = 7）和小鼠抗vegf抗体（0.3
ꢀµ
g）（n = 8 ）和硼替佐米30 pmol（n = 7）。注
射后第七天，对小鼠腹腔注射0.2 ml 1％荧光素钠，显示血管和渗漏情况。如材料和方法中所述测量泄漏的面积。抗vegf与对照对比，p = 0.005;硼替佐米与对照的比较，p = 0.001；硼替佐米与抗vegf的比较，p ＝ 0.012，比例尺=50
ꢀµ
m。结果如图2所示，可以得出玻璃体腔内注射硼替佐米可显著性减少cnv模型小鼠眼底血管的荧光渗漏 。
[0026]
脉络膜/rpe组织分离和蛋白质印迹分析将小鼠眼球取下，沿着锯齿状缘切开，丢弃角膜和玻璃体。在解剖显微镜下，将视网膜从眼罩上提起，然后从眼罩上剥离脉络膜rpe组织。组织用pbs洗涤一次，并在缓冲液中裂解，缓冲液组成成分为（单位为mm）：460 tris hcl，ph值7.4，138 nacl，1 edta，2.5氟化钠，2.5 na3vo4，1 苯甲磺酰氟，0.1％的nonidet p-40的二硫苏糖醇和1*蛋白酶磷酸酶抑制剂混合物（sigma，st louis）。 组织匀浆定量后，在每个孔中上样40
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g蛋白，sds-page (12%)分离蛋白质，再电转移到硝酸纤维素膜上，并用1*pbst（吐温20磷酸盐缓冲盐)冲洗，封闭2小时后，分别用抗体vegfr-2 （1：800），p-vegfr2（1：800），pdgfr-β（1：800），p-pdgfrβ（1：800）在40c孵育过夜。用pbs洗涤后，将膜与辣根过氧化物酶偶合的二抗（1：5000）在室温下孵育1 小时。用pbs洗涤3次后，使用增强的化学发光底物（pierce
™
eclthermoscientific）对膜进行显影，gapdh（1：5000）用作内参。
[0027]
激光光凝后的第一天，对两个月大的c57bll6j野生型小鼠进行玻璃腔体内注射生理盐水（con），硼替佐米30pmol（bor）。激光损伤后第七天，分离出脉络膜/rpe组织 。（每个实验的每组n ＝ 4-5只小鼠）溶解在裂解缓冲液中匀浆，然后以10,000 rpm 离心10分钟。收集上清蛋白，利用免疫印迹检测vegfr2（1：800）和p-vegfr2（1：800）（a,b）,检测pdgfrβ（1：800）和p-pdgfrβ（1：800）（c，d），gapdh（1：5000）作为内参。实验独立重复三次。 * p ＜0.05，相对于对照组。结果如图3所示，可以得出玻璃体腔内注射硼替佐米，cnv动物模型中脉络膜/rpe组织中p-vegfr2和p-pdgfrβ蛋白质水平降低。
[0028]
elisa测定对脉络膜rpe组织中的vegf-a，pdgf-b和mcp-1水平进行检测。abc反应液和3,3'，5,5'-四甲基联苯胺（tmb）工作液在使用前制备。将标准溶液或上清液（100
ꢀµ
l）轻轻移入预先包被的单个抗体的微孔板中，并在370c下孵育90分钟，倒出溶液并干燥。将生物素偶联的检测抗体（单个多克隆抗体，100
ꢀµ
l）添加到每个孔中，并在370c下孵育60分钟。洗三遍之后将亲和素偶联的过氧化物酶溶液（abc工作溶液，100
ꢀµ
l）轻轻加到到每个孔中，并在370c 下温育30分钟。洗涤五次后，将tmb生色溶液（90
ꢀµ
l）加入每个孔中，在避光条件下，370c 孵育30分钟，之后添加反应终止溶液（100
ꢀµ
l），并在450 nm的读板器中读取吸光值（spectra m5；molecular devices，sunnyvale，ca）。
[0029]
激光光凝后的第一天，对两个月大的c57bll6j野生型小鼠进行玻璃腔体内注射生理盐水（con），硼替佐米30pmol（bor）。在激光损伤后第七天，分离脉络膜/rpe组织。将各组的每只动物的脉络膜rpe组织在蛋白裂解液中匀浆，然后以10,000 rpm离心10分钟。通过elisa对上清液进行（a）vegf-a，（b）mcp-1，（c）pdgf-b和（d）pdgf-d的测定。 每个管表示一个样品，该样品在相同条件下处理。与相应的对照相比，* p <0.05，** p <0.01。实验独立重复三次。结果如图4所示，硼替佐米注射减少了cnv动物模型中脉络膜/rpe组织中vegf-a和pdgf-d的产生。
[0030]
视网膜电图
玻璃体内注射后第7天，使用（roland consult，威斯巴登，德国）的retiport系统进行视网膜电图记录。适应黑暗过夜后，在暗室ergs的刺激强度为-2.5和0 log cd-ssm 2
，间隔为30秒并记录五次数据，取平均值作为暗视反应。记录明视反应前，小鼠在暴露在稳定的背景照明30cddm2下，10分钟后，在刺激强度0.5 log cd-ssm2下记录明视反应并记录五次刺激下的实验数据，取平均值作为明视反应，五次记录间隔时间为0.4秒。在对照组和硼替佐米注射组，每组取6只小鼠记录明视和暗视下b波振幅，取平均值。操作过程中，为避免人为误差，课题组主要负责人将小鼠随机分配处理，将对照组和治疗组的眼睛编号，分配给实验操作人。
[0031]
激光光凝后的第一天，对两个月大的c57bll6j野生型小鼠进行玻璃腔体内注射生理盐水（con），硼替佐米30pmol（bor）。激光损伤后第7天，对照组和注射硼替佐米（30 pmol）组的眼球，制成冰冻切片。a将切片用一抗ng2（1：700）检测，再用与alex flour 594偶联的二抗（1：1000） 显色。 ng2染色（中间），dapi染色（左列）显示，两者融合（右列）；第一行为阴性对照，第二行为对照组，第三行为硼替佐米注射组。箭头表示与硼替佐米注射相比，对照组浸润更多。图像在荧光显微镜下用物镜20x捕获，每组5-6个眼球，每个眼球2-3张切片，比例尺=20
ꢀµ
m。在每个冰冻切片中对浸润的间充质细胞进行定量，对照组与注射硼替佐米组相比显示为图b。p <0.05。结果如图5所示，cnv动物模型中注射硼替佐米，间充质细胞对激光损伤的斑点浸润减少。
[0032]
激光光凝后的第一天，对两个月大的c57bll6j野生型小鼠进行玻璃腔体内注射生理盐水（con），硼替佐米30pmol（bor）。在激光损伤后的第七天，收集来自对照组和注射硼替佐米（30 pmol）组的眼球，并将其制成冰冻切片。切片用一抗cd68（1:80）检测，并进一步用与alex flour 594偶联的二抗（1：1000）检测。cd68（中间列）和dapi染色（左列）的图像中显示。第一行为阴性对照；第二行为对照组;第三行为为硼替佐米注射组。对照组比硼替佐米注射组浸润的小胶质细胞和巨噬细胞多。图像在荧光显微镜下用物镜20x捕获，每组3-4个眼球，每个眼球2-3张切片，比例尺=20
ꢀµ
m。在每个冷冻切片中对浸润的巨噬细胞进行定量，b图是对照组和硼替佐米注射组相比的统计图。p <0.05。结果如图6所示，注射硼替佐米，小胶质细胞和巨噬细胞对激光点的浸润减少。
[0033]
在注射1周后，在-1.85 log cd-ssm2闪光强度诱发的暗视反应，（a）注射生理盐水组（n = 6）erg与注射30 pmol的硼替佐米组（n = 6）暗视（视杆）的b波振幅。（ b ）注射1周后，在0.5log cd-ssm2闪光强度明视反应erg，注射生理盐水组（n = 6）erg与注射30 pmol的硼替佐米组（n = 6）明视（视锥）的b波振幅。（c）在注射后第1周，用0 log cd-ssm2的闪光强度刺激下，注射生理盐水组（n = 6）erg与注射30 pmol的硼替佐米组（n = 6）的标准ergb波振幅。（d）注射生理盐水和注射硼替佐米眼睛的明视（视锥）和暗视（视杆）b波振幅的统计数据，结果如图7所示。
[0034]
激光光凝后的第一天，对两个月大的c57bll6j野生型小鼠进行眼表给药生理盐水，对照（n = 7）和小鼠抗vegf抗体（0.3
ꢀµ
g）（n = 8 ），硼替佐米滴眼液5.76μg/ml（n = 7）。连续七天，早晚各一次（10μl），七天后对小鼠腹腔注射0.2 ml 1％荧光素钠，观察血管的渗漏情况。如材料和方法中所述测量泄漏面积。p = 0.005;硼替佐米与对照的比较，p = 0.001；硼替佐米与抗vegf的比较，p ＝ 0.046，比例尺=50
ꢀµ
m。结果如图8所示，眼表给药显著性减少cnv模型小鼠眼底血管的荧光渗漏 。
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硼替佐米滴眼液制备方法43.4微升dmso加到硼替佐米2.5mg(品牌cst货号2204s)管中，配成0.15mm母液；取出10微升加入90微升ddh202稀释10倍。从100微升稀释的溶液中，取出50微升加入5mlddh202，终浓度为5.76μg/ml,并进行分装，每次取10μl早晚各滴一次，硼替佐米分子量为384.24，dmso占终浓度的0.1%。
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各位技术人员须知：虽然本发明已按照上述具体实施方式做了描述，但是本发明的发明思想并不仅限于此发明，任何运用本发明思想的改装，都将纳入本专利专利权保护范围内。
[0037]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。