治疗隐球菌感染的方法与流程

治疗隐球菌感染的方法
1.相关申请的交叉引用
2.本技术要求2019年8月13日提交的美国临时申请号62/886,118；2019年10月17日提交的美国临时申请号62/916,482；2020年1月17日提交的美国临时申请号62/962,427；和2020年4月16日提交的美国临时申请号63/011,091的权益并且依赖于这些美国临时申请的申请日；各申请的完整公开内容是以引用的方式并入本文中。
3.政府利益声明
4.本发明是根据美国国家卫生研究院(national institutes of health)所授予的授权号r01 ns110519在政府支持下进行的。美国政府享有本发明的某些权利。
技术领域
5.本技术一般涉及尤其使用经粘膜施用的两性霉素b制剂来治疗或预防隐球菌属感染、特别是隐球菌性脑膜炎的方法。本技术还涉及用于粘膜施用的两性霉素b制剂。


背景技术：

6.隐球菌病是一种机会性真菌感染，由于例如隐球菌中枢神经系统(cns)感染，估计每年导致100万例病例和625,000例死亡。hiv相关隐球菌性脑膜炎的早期死亡率特别高，这大部分是由于有效抗真菌剂的成本和毒性。
7.抗真菌剂两性霉素b能够快速并且持续地对隐球菌患者的脑脊液(csf)进行灭菌，这表明这种抗真菌剂应该是任何隐球菌病治疗策略的核心。然而，与两性霉素b治疗相关的挑战通常限制了其在隐球菌性脑膜炎最为流行的资源有限地区的使用。例如，两性霉素b目前是静脉内给药，这需要住院、共同施用iv流体和补充电解质。此外，静脉内施用的两性霉素b可能有毒，这使得需要快速并且可靠的实验室监测。因此，中低收入国家的许多治疗中心常常发现难以使用两性霉素b来治疗隐球菌感染。相应地，需要鉴定更有效且毒性更低的抗真菌疗法来减少对昂贵、长疗程的静脉内药物的依赖，所述依赖与毒性风险增加有关。


技术实现要素：

8.用于治疗或预防隐球菌感染的本发明方法提供与用于治疗此类疾病的其他方法相比令人惊讶的益处。例如，包括口服施用抗真菌剂(诸如两性霉素b)的本发明方法的毒性低于使用静脉内施用的抗真菌剂(诸如两性霉素b)的那些。因此，本发明方法可以减少或消除静脉内施用抗真菌剂(诸如两性霉素b)的需要并且相应地，消除在一些情况下对于住院和密切监测患者的需要。此外，由于没有传统上与两性霉素b相关的毒性，可以耐受更长的疗程，这可能降低复发性疾病和免疫重建炎症综合征(iris，抗逆转录病毒疗法在隐球菌病患者中的并发症)的发生率。此外，本发明方法也可以在不存在氟康唑的情况下使用，这为那些对氟康唑具有获得性敏感性或抗性的受试者提供了疗法。
9.更特定地，本公开针对一种治疗或预防包含隐球菌属的受试者的真菌感染的方法，所述方法包括诱导治疗期和巩固治疗期，其中所述诱导治疗期包括：向受试者施用脂质
卷包封的两性霉素b(camb)和5-氟胞嘧啶或唑，典型地为5-氟胞嘧啶，其中所述camb和所述5-氟胞嘧啶或所述唑是经粘膜(例如口服或鼻内)施用的。所述巩固治疗期可以包括向受试者口服施用脂质卷包封的两性霉素b，组合向受试者口服施用唑，诸如氟康唑。
10.本公开还提供包含脂质卷包封的两性霉素b的组合物，其中所述脂质卷包封的两性霉素b包含两性霉素b、磷脂、edta、水、维生素e、氯化钙、甲基纤维素、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、氢氧化钠、无水乙醇、磷酸二氢钾、山梨酸钾、乙酰磺胺酸钾和任选的调味剂。
附图说明
11.并入本说明书中并且构成本说明书的一部分的附图说明某些实施方案，并且连同书面描述一起用于解释本文所公开的组合物和方法的某些原理。
12.图1是如具体实施方式中所述的脂质卷的示意图。插图描绘了脂质卷的脂质层，其含有磷脂双层(圆圈和尾部)、多价阳离子(无阴影圆圈)和保护在脂质卷内的示例性货物部分(带阴影圆圈)。
13.图2描绘了吞噬脂质卷和其货物的巨噬细胞的示意图。插图描绘了如具体实施方式中所述在巨噬细胞内部的脂质卷的开口和货物的释放。
14.图3描绘了如具体实施方式中所述的两性霉素b的结构图。
15.图4是如具体实施方式中所述的用于制造两性霉素b-脂质卷的示例性策略的示意图。
16.图5描绘了如具体实施方式中所述的晶球脂质卷的示例性制备。
17.图6描绘了如实施例中所述的用于评价口服施用的camb的安全性和耐受性的i期设计。
18.图7描绘了如实施例中所述的用于评价口服施用的camb的功效的ii期设计。
19.图8描绘了如实施例中所述在多个时间点的平均camb血浆浓度。
具体实施方式
20.现在将详细参考多个示例性实施方案，所述实施方案的实施例在附图中说明并且在以下具体实施方式中讨论。应理解，提供以下具体实施方式是为了让读者更全面地理解本公开的某些实施方案、特征和各方面的细节，而不应被解释为限制本公开的范围。
21.本公开针对一种治疗或预防包含隐球菌属的受试者的真菌感染的方法，所述方法包括诱导治疗期和巩固治疗期，其中所述诱导治疗期包括：向受试者施用两性霉素b并且向受试者施用5-氟胞嘧啶或唑，其中所述两性霉素b包含脂质卷包封的两性霉素b(camb)，并且其中所述camb和所述5-氟胞嘧啶或所述唑是经粘膜(例如口服或鼻内)施用的。
22.如本文所用，术语“受试者”是指任何动物，包括但不限于人、小鼠、大鼠、兔、非人灵长类动物或任何其他哺乳动物。在一个实施方案中，受试者是灵长类动物。典型地，受试者是人。
23.如本文所用，术语“隐球菌属”是指属于隐球菌属的真菌物种，其是担子菌脂质卷包封的酵母。可以通过本领域中已知的任何方法，例如通过确定受试者是否对隐球菌属抗原呈阳性在受试者中检测此类感染。用于执行此类测试的试剂盒是可商购的，例如购自
0.20log
10
cfu/ml/天至-0.60log
10
cfu/ml/天，诸如-0.20log
10
cfu/ml/天至-0.29log
10
cfu/ml/天的范围内。
33.不受理论的束缚，据信在诱导疗法期间的efa与隐球菌属感染(诸如隐球菌性脑膜炎感染)之后的10周存活之间存在关联。本发明方法可能以比-0.20log
10
cfu/ml/天更快的速度产生清除值，与其他治疗方法相比，在隐球菌属感染(诸如隐球菌性脑膜炎)之后也典型地引起更好的存活。然而，一旦efa超过大约-0.30log
10
cfu/ml/天，存活方面的增量收益可能不太明显。例如，在比-.20log
10
cfu/ml csf/天更慢的清除率下的efa典型地导致更高的10周死亡率(》50％)，而在比-0.30log
10
cfu/ml/天更快的清除率下的efa典型地导致相似的死亡率(即，30-40％)。因此，本发明方法可能产生在-0.20log
10
cfu/ml/天至-0.29log
10
cfu/ml/天之间的efa值，可以导致存活率与可能引起更快真菌清除率的那些方法相当。
34.在一些实施方案中，诱导治疗期包括向受试者经粘膜(例如，口服)施用脂质卷包封的两性霉素b(camb)。脂质卷包封包括抗真菌剂在内的化合物(诸如两性霉素b)的方法是本领域中已知的并且描述于本文中。
35.在一些实施方案中，camb以介于约7mg/kg/天至约29mg/kg/天，诸如约14mg/kg/天至约29mg/kg/天的范围内的量施用于受试者。典型地，受试者是每天共计接受约0.5克至约2克camb的人类受试者，诸如每天约1克，诸如每天约1.5克，更典型地每天约2克。camb的日剂量可作为单一剂量或在24小时时期内以分次剂量施用。典型地，camb以分次剂量施用，其中每个分次剂量是≤400毫克(mg)，诸如≤375mg，诸如≤300mg，诸如≤333mg，诸如≤286mg，诸如《250mg，诸如≤200mg，或诸如≤167mg。例如，camb的每个分次剂量可以介于约150mg至约400mg，诸如约167mg至约400mg，诸如约167mg至约375mg，或诸如约200mg至约300mg的范围内。
36.在诱导治疗期期间的一些特定实施方案中，患有隐球菌属感染(诸如隐球菌性脑膜炎)的受试者(诸如人类受试者)每天口服施用4个分次剂量的camb，各自约250mg，每4小时一次，以在约12小时时期内实现1克的每日总累积剂量。在其他实施方案中，受试者(诸如人类受试者)每天口服施用5个分次剂量的camb，各自约200mg，每3-4小时一次，以在约12-16小时时期内实现约1克的每日总累积剂量。在一些实施方案中，受试者(诸如人类受试者)每天口服施用6个分次剂量的camb，各自约167mg，每2-3小时一次，以在约10-15小时时期内实现约1克的每日总累积剂量。
37.更典型地，在诱导治疗期期间，受试者(诸如人类受试者)每天口服施用4个分次剂量的camb，各自约375mg，每3-4小时一次，以在约9-12小时时期内实现1.5克的每日总累积剂量。在其他实施方案中，受试者(诸如人类受试者)每天口服施用5个分次剂量的camb，各自约300mg，以在约16小时时期内实现约1.5克的每日总累积剂量。在一些实施方案中，受试者(诸如人类受试者)每天口服施用6个分次剂量的camb，各自约250mg，每2-3小时一次，以在约10-15小时时期内实现约1.5克的每日总累积剂量。
38.甚至更典型地，在诱导治疗期期间，受试者(诸如人类受试者)每天口服施用5个分次剂量的camb，各自约400mg，每3-4小时一次，以在约15-16小时时期内实现2.0克的每日总累积剂量。在其他实施方案中，受试者(诸如人类受试者)每天口服施用6个分次剂量的camb，各自约333mg，每3.5小时一次，以在约17.5小时时期内实现约2.0克的每日总累积剂
[0048][0049]a相隔》5分钟，b危及生命
[0050]
在诱导治疗期期间的一些实施方案中，在诱导治疗期的2天期间，更典型地在诱导治疗期的五天期间，甚至更典型地在诱导治疗期的9天期间，甚至更典型地在诱导治疗期的10天期间，最典型地在诱导治疗期的14天期间，每天向受试者口服施用每日总累积剂量的camb。在一些实施方案中，在整个诱导治疗期的每一天向受试者口服施用每日总累积剂量的camb。
[0051]
在一些实施方案中，诱导治疗期还包括向受试者施用静脉内两性霉素b(iv amb)。然而，不受理论的束缚，据信在诱导治疗期的任何部分中口服施用camb可用于减少需要静脉内施用camb以治疗隐球菌感染(诸如隐球菌性脑膜炎)的天数。例如，camb的施用可以允许iv amb施用的不存在或允许施用iv amb的天数减少。例如，iv amb可以仅在诱导治疗期的10天中施用，诸如在诱导治疗期的仅五天中。
[0052]
iv amb可以在整个诱导治疗期中或仅在诱导治疗期的一部分中与camb同时施用。然而，更典型地，如果施用iv amb，那么其仅在诱导治疗期的一部分中施用并且camb仅在诱导治疗期的一部分中施用。在一些实施方案中，iv amb和camb仅在诱导治疗期的一天或两天中同时施用或在诱导治疗期期间不同时施用。举例来说，camb和iv amb可以在诱导治疗期的至少一天中，诸如在诱导治疗期的至少两天中同时施用，例如可以在诱导治疗期的一天中同时施用。
[0053]
例如，在一些实施方案中，诱导治疗期持续14天并且包括从第1-5天施用iv amb，接着从诱导期的第5-14天施用camb。在一些实施方案中，诱导治疗期持续14天并且包括从第1-2天施用iv amb，接着从诱导治疗期的第2-14天施用camb。在一些实施方案中，诱导治疗期持续14天并且包括从诱导治疗期的第1-5天向受试者施用camb，接着从诱导治疗期的第6-14天施用iv amb。在一些实施方案中，诱导治疗期持续14天并且包括从第1-2天施用iv amb，接着从诱导治疗期的第3-14天施用camb。在一些实施方案中，诱导治疗期持续14天并
且包括在iv amb不存在下从第1-14天向受试者施用camb。
[0054]
典型地，当在诱导治疗期期间施用时，iv amb的剂量为约0.7mg/kg/天至约1.0mg/kg/天。更典型地，iv amb在诱导治疗期期间以1.0mg/kg/天的剂量施用于受试者。
[0055]
在一些实施方案中，诱导治疗期还包括向受试者口服施用5-氟胞嘧啶。5-氟胞嘧啶是针对念珠菌和隐球菌的大多数菌株具有活性的药物。在一些实施方案中，在诱导治疗期的每一天，例如第1-14天施用5-氟胞嘧啶。在其他实施方案中，仅在诱导治疗期的一部分期间，诸如在14天诱导治疗期的第7-14天施用5-氟胞嘧啶。然而，典型地，在诱导治疗期的每一天施用5-氟胞嘧啶。在一些实施方案中，在诱导治疗期期间以约50mg/kg/天至约150mg/kg/天，典型地约100mg/kg/天的剂量口服施用5-氟胞嘧啶。
[0056]
在一些实施方案中，5-氟胞嘧啶被脂质卷包封。在一些实施方案中，本公开的包含两性霉素b的脂质卷还包含5-氟胞嘧啶。然而，典型地，5-氟胞嘧啶未被脂质卷包封。
[0057]
在一些实施方案中，诱导治疗期还包括向有需要的受试者施用唑。在一些实施方案中，所述唑是选自氟康唑、酮康唑、雷夫康唑、阿巴康唑、伊曲康唑、泊沙康唑、艾沙康唑和/或伏立康唑。更典型地，所述唑是氟康唑。氟康唑是一种合成的三唑抗真菌剂，它是真菌细胞色素p450依赖性酶的高度选择性抑制剂。它是一种强效cyp2c9抑制剂和中度cyp3a4抑制剂。
[0058]
在一些实施方案中，在诱导治疗期期间在5-氟胞嘧啶存在下施用所述唑(诸如氟康唑)。典型地，如果施用的话，那么在诱导治疗期期间在5-氟胞嘧啶不存在下施用所述唑(诸如氟康唑)。
[0059]
在诱导治疗期期间施用唑(诸如氟康唑)的实施方案中，在诱导的每一天施用所述唑(诸如氟康唑)。举例说来，可以在两周诱导治疗期的第1-14天的每一天施用所述唑(诸如氟康唑)。在其他实施方案中，仅在诱导治疗期的一部分期间，诸如仅在两周诱导治疗期的第7-14天施用所述唑(诸如氟康唑)。在一些实施方案中，所述唑是氟康唑，其在诱导治疗期期间以介于约200mg/kg/天至约1200mg/kg/天的范围内的剂量，典型地以800mg/kg/天的剂量，更典型地以1200mg/kg/天的剂量口服施用。
[0060]
在一些实施方案中，所述唑(诸如氟康唑)以分次剂量施用。例如，受试者可以每三至四小时接受3个400mg氟康唑的分次剂量，以实现1200mg/kg/天的氟康唑的每日累积剂量。
[0061]
在一些实施方案中，所述唑(诸如氟康唑)倍脂质卷包封。在一些实施方案中，本公开的包含两性霉素b的脂质卷还包含所述唑(诸如氟康唑)。然而，典型地，所述唑(诸如氟康唑)未被脂质卷包封。
[0062]
在最典型的实施方案中，本公开的诱导治疗期包括与5-氟胞嘧啶、特别是未被脂质卷包封的5-氟胞嘧啶组合施用camb。在诱导治疗期的每一天，典型地1-14天，典型地以1-2克、典型地2克的每日总累积剂量每日口服施用camb。camb典型地与5-氟胞嘧啶的口服施用组合，典型地以100mg/kg的日剂量施用。5-氟胞嘧啶典型地在诱导治疗期的每一天与camb组合，同时或依序以任何顺序施用。
[0063]
巩固
[0064]
在一些实施方案中，在本公开的诱导治疗期之后停止治疗。在这些实施方案中，发现受试者的csf培养物在反复腰椎穿刺之后呈阴性并且受试者展现出实质性的临床改进。
然而，更典型地，本公开的诱导治疗期之后是巩固治疗期，也称为“随访”治疗期或“根除期”。巩固治疗期的长度可以是约两周至十二周，更典型地约10周的时期。
[0065]
在一些实施方案中，在巩固治疗期期间口服施用camb。在这些实施方案中，camb在巩固治疗期期间以介于约7mg/kg/天至约29mg/kg/天，诸如约14mg/kg/天至约29mg/kg/天的范围内的量施用于受试者(诸如人类受试者)。典型地，在巩固治疗期期间，所述受试者是每天共计接受约0.5克至约2克camb的人类受试者，诸如每天约1克，诸如每天约1.5克，诸如每天约2克。
[0066]
典型地，在巩固治疗期期间的camb总剂量/天是少于在诱导治疗期期间每天施用的总剂量。例如，camb剂量的施用量比在诱导治疗期期间施用的量每天少至少0.5克，诸如每天少至少1.0克。典型地，camb在巩固治疗期期间以约1.5克/天，诸如每天约1.0克的量施用于受试者(诸如人类受试者)。
[0067]
camb可以在巩固治疗期期间作为单一剂量或在24小时时期内以分次剂量施用。典型地，camb以分次剂量施用，其中每个分次剂量是≤400mg，诸如≤375mg，诸如≤300mg，诸如≤333mg，诸如≤286mg，诸如《250mg，诸如≤200mg，或诸如≤167mg。例如，camb的每个分次剂量可以介于约150mg至约400mg，诸如约167mg至约400mg，诸如约167mg至约375mg，或诸如约200mg至约300mg的范围内。
[0068]
在巩固治疗期期间的一些实施方案中，患有隐球菌属感染(诸如隐球菌性脑膜炎)的受试者每天口服施用5个分次剂量的camb，各自约400mg，每3-4小时一次，以在约15-16小时时期内实现约2.0克的每日总累积剂量。在其他实施方案中，受试者(诸如人类受试者)每天口服施用6个分次剂量的camb，各自约333mg，每3.5小时一次，以在约17.5小时时期内实现约2.0克的每日总累积剂量。在一些实施方案中，受试者(诸如人类受试者)每天口服施用7个分次剂量的camb，各自约286mg，每3小时一次，以在约18小时时期内实现约2.0克的每日总累积剂量。
[0069]
在一些实施方案中，在巩固治疗期期间，受试者每天口服施用4个分次剂量的camb，每次约375mg，每3-4小时一次，以在约9-12小时时期内实现约1.5克的每日总累积剂量。在其他实施方案中，受试者(诸如人类受试者)每天口服施用5个分次剂量的camb，各自约300mg，以在约16小时时期内实现约1.5克的每日总累积剂量。在一些实施方案中，受试者(诸如人类受试者)每天口服施用6个分次剂量的camb，各自约250mg，每2-3小时一次，以在约10-15小时时期内实现约1.5克的每日总累积剂量。
[0070]
甚至更典型地，在巩固治疗期期间，受试者每天口服施用4个分次剂量的camb，各自约250mg，每4小时一次，以在约12小时时期内实现1约克的每日总累积剂量。在其他实施方案中，受试者(诸如人类受试者)每天口服施用5个分次剂量的camb，各自约200mg，每3-4小时一次，以在约12-16小时时期内实现约1克的每日总累积剂量。在一些实施方案中，受试者(诸如人类受试者)每天口服施用6个分次剂量的camb，各自约167mg，每2-3小时一次，以在约10-15小时时期内实现约1克的每日总累积剂量。
[0071]
在一些实施方案中，受试者将在整个巩固治疗期，例如巩固治疗期的每一天接受每日camb剂量，持续十周的时期。然而，更典型地，camb仅在巩固治疗期的一部分中施用，例如每天施用持续至少一周的时期，诸如至少两周，诸如至少三周，诸如至少四周，诸如至少八周。典型地，camb在巩固治疗期期间施用一周至四周，诸如两周至四周，最典型地四周。
2004/091572；wo 2004/091578；wo 2005/110361、wo 2012/151517及wo2014/022414，美国专利公布号2014/220108和专利公布号2010/0178325；其中每一者均以引用的方式完全并入本文中)。典型地，这些被称为晶体脂质卷。所述晶体脂质卷的变化形式被称为晶洞脂质卷(geode cochleate/geodate)，如例如美国专利公布2013/0224284中所述，所述文献的完整公开内容以引用的方式并入本文中。
[0083]
脂质卷具有独特的多层结构，由一个大的、连续的、固体磷脂双层板或层卷成螺旋状或堆叠板组成，没有内部水空间(图1)。这种独特的结构为相关的“脂质卷包封的”分子提供了免于降解的保护作用。由于整个脂质卷结构是一系列固体层，在脂质卷结构的内部的成分保持完整，即使脂质卷的外层可能暴露于恶劣的环境条件或酶。体内血清和粘膜分泌物中的二价阳离子浓度使得脂质卷结构得以维持。因此，大多数的脂质卷相关分子存在于固体、稳定、不可渗透的结构的内层中。然而，一旦进入细胞内部，低钙浓度会导致脂质卷晶体开口并且释放已经配制成脂质卷的分子(图2)。因此，脂质卷制剂在包括粘膜分泌物、血浆和胃肠液在内的生理流体中保持完整，由此通过包括粘膜(例如口服或鼻内)施用的多种施用途径介导生物活性化合物的递送。
[0084]
典型的脂质卷结构包括包含交替的二价阳离子的脂质层和包括至少一种带负电荷的磷脂的磷脂双层。典型地，诸如抗真菌剂(例如两性霉素b)的货物部分(图3)被隔绝在脂质卷的脂质层内。
[0085]
可以使用已知的方法制备脂质卷。在一个典型的实施方式中，使用美国专利公开号2014/220108中所述的方法来制造本公开的脂质卷，所述文献以引用的方式整体并入本文中。这一过程的概述在图4中示出。在这种方法中，疏水性抗真菌化合物(诸如两性霉素b)典型地溶解于例如二甲亚砜的溶剂中并且通过例如0.22μm过滤器过滤，并与例如200毫升无菌水中的2000毫克50％大豆磷脂酰丝氨酸(ps)脂质体(所述ps脂质体首先通过例如5、0.8和0.45μm过滤器过滤)组合以形成含有抗真菌剂(诸如amb)的脂质体。可以向所得混合物中添加阳离子，诸如多价或二价阳离子。添加多价或二价阳离子导致脂质体塌陷并形成阳离子螯合的磷脂双层的板，所述板卷起或堆叠形成含有抗真菌剂(诸如两性霉素b)的脂质卷。含有抗真菌剂的脂质卷(诸如含有两性霉素b的脂质卷)可以在冻干下干燥。可以将无菌水添加至干燥的抗真菌脂质卷粉末中以制备悬浮液。所述悬浮液可以在4℃下避光存储。
[0086]
用于制备含有抗真菌剂的脂质卷的其他方法包括捕捉-高ph方法、捕捉-薄膜方法和水凝胶方法。在捕捉-高ph方法中，使脂质粉末和抗真菌化合物(例如两性霉素b)以例如10:1的脂质/抗真菌摩尔比率混合于例如无菌聚丙烯管中。添加缓冲液，例如tes[n-三(羟基甲基)-甲基-2-氨基甲烷磺酸](ph 7.4)。在涡旋之后形成多层脂质体。接着通过添加例如1n naoh使ph增加至例如11.5，以溶解抗真菌化合物，例如两性霉素b。可以通过使用相位对比和偏振光学显微术来监测两性霉素b晶体的不存在和脂质体的存在。以例如2:1的脂质/阳离子摩尔比率将多价或二价阳离子(诸如氯化钙)缓慢地添加至抗真菌剂脂质体悬浮液中，以形成脂质卷。接着可以将外部ph调节至ph 7。
[0087]
在捕捉薄膜方法中，使抗真菌化合物(例如两性霉素b)溶解于溶剂(例如甲醇)中，其中进行短暂的声波处理，并将所述溶液添加至氯仿中的脂质中。抗真菌剂(例如两性霉素b)易溶于氯仿/甲醇混合物中。接着可以使用旋转蒸发器将所述混合物干燥成薄膜，并在减压(1巴)下在例如35℃-40℃下渐渐加温。接着可以用去离子水使干燥的脂质薄膜水合并且
进行声波处理。抗真菌剂-脂质体的尺寸应为大约50纳米。为了形成脂质卷，将多价或二价阳离子溶液(例如氯化钙溶液)缓慢地添加至脂质体悬浮液中以形成脂质卷。
[0088]
为了使用水凝胶方法来制备抗真菌脂质卷，将抗真菌化合物(诸如两性霉素b)溶解于甲醇中，并以例如10:1的摩尔比率添加至氯仿中的脂质中，接着使用旋转蒸发器将所述混合物干燥成药物-脂质薄膜。接着可以用去离子水使薄膜水合，并对药物-脂质悬浮液进行声波处理，直至获得含有抗真菌化合物的小脂质体。接着可以使抗真菌剂-脂质体悬浮液与例如40％w/w右旋糖苷-500,000在例如2/1v/v右旋糖苷/脂质体的悬浮液中混合。接着在磁力搅拌(800-1000rpm)下使用注射器将这一混合物注射至例如15％w/w peg-8000中。获得分散于peg连续相中的抗真菌剂脂质体/右旋糖苷小液滴的水相-水相乳液。接着将多价或二价阳离子溶液(例如氯化钙溶液)添加至所述乳液中。继续搅拌以允许缓慢形成小尺寸抗真菌脂质卷，这些脂质卷被隔绝在右旋糖苷小液滴中。接着通过添加含有例如1mm cacl2和150mm nacl的洗涤缓冲液来洗涤所述聚合物。
[0089]
如普通技术人员所认识到，包括ph、盐浓度、搅拌方法和速率、阳离子类型、浓度和添加速率、脂质组合物、浓度和脂质与其他材料的比率等在内的多种参数会影响配制，并且可以变化以便优化特定材料的脂质卷包封。
[0090]
在一些实施方案中，也可以将亲水性抗真菌化合物(诸如5-氟胞嘧啶)或含有亲水性结构域的抗真菌化合物(诸如氟康唑)配制成脂质卷。用于将此类化合物并入脂质卷中的方法是本领域中众所周知的，并且描述于例如美国专利公布号2014/220108中。不希望受任何特定理论的束缚，据信包括本公开的抗真菌化合物的亲水性分子或具有亲水性结构域的大分子(诸如所关注的活性药物成分(api))可以通过使所述api与像个“筏”并且保持完整并埋入脂质卷晶体基质中的脂质结构域缔合而以增强的方式配制成脂质卷。此类脂质包括如本领域中已知并且如本文所述的“中性脂质”。
[0091]
在一个典型的实施方式中，可用于使脂质体塌陷成脂质卷的本文所述的多价阳离子是二价金属阳离子，诸如钙、锌、镁和钡。在一个更典型的实施方式中，所述二价金属阳离子是钙。
[0092]
在一些实施方式中，抗真菌剂与脂质的比率(wt/wt)介于1:1至1:50的范围内或其间任何范围内，诸如1:2、1:3、1:4、1:6、1:8、1:10、1:12、1:15、1:20和1:25，典型地1:1至1-1:20，诸如1:2.5至1:10，典型地1:10。
[0093]
在脂质卷形成期间使用的脂质体可以是多层(mlv)或单层(ulv)，包括小的单层囊泡(suv)。这些脂质体溶液中的脂质的浓度可以是约0.1mg/ml至500mg/ml。典型地，脂质的浓度是约0.5mg/ml至约50mg/ml，更典型地约1mg/ml至约25mg/ml。
[0094]
在制造脂质卷的方法期间可以引入尺寸调节剂。如本文所用，尺寸调节剂是指减小脂质卷的粒径的剂。如本文所用，术语“粒径”是指粒子直径，或者在粒子不是球形的情况下，是指在粒子的一个方向上的最大延伸。脂质卷的粒径可以使用常规方法测量，诸如亚微米粒径分析仪。在某些实施方案中，尺寸调节剂是脂质锚定的多核苷酸、脂质锚定的糖(糖脂)或脂质锚定的多肽。在其他实施方案中，尺寸调节剂是胆汁盐，诸如氧胆酸盐、胆酸盐、鹅脱氧胆酸盐、牛磺胆酸盐、甘氨胆酸盐、牛磺鹅脱氧胆酸盐、甘氨鹅脱氧胆酸盐、脱氧胆酸盐或石胆酸盐。胆汁盐是与阳离子(通常是钠)复合的胆汁酸。胆汁酸是主要发现于哺乳动物的胆汁中的类固醇酸并且是可商购的。
[0095]
在某些实施方案中，所述尺寸调节剂是在沉淀的脂质卷形成之前添加至脂质或脂质体中。例如，在一个实施方案中，将所述尺寸调节剂引入至脂质体悬浮液中，随后将形成脂质卷(例如，通过添加阳离子或透析)。或者，可以在添加药理学活性剂之前或之后将尺寸调节剂引入脂质溶液中。
[0096]
在一些实施方案中，本公开的脂质卷可任选地包括一种或多种聚集抑制剂。如本文所用，术语“聚集抑制剂”是指抑制脂质卷的聚集的剂。所述聚集抑制剂典型地至少存在于脂质卷的表面上，并且可能仅存在于脂质卷的表面上(例如，当在脂质卷形成之后引入所述聚集抑制剂时)。聚集抑制剂可以在脂质卷形成之前、之后或期间添加。本领域普通技术人员将能够容易地确定形成所需尺寸的脂质卷所需的聚集抑制剂的量，而不超过常规实验。
[0097]
可根据本公开使用的合适的聚集抑制剂包括但不限于以下至少一者：酪蛋白、κ-酪蛋白、牛奶、白蛋白、血清白蛋白、牛血清白蛋白、兔血清白蛋白、甲基纤维素、乙基纤维素、丙基纤维素、羟基纤维素、羟基甲基纤维素、羟基乙基纤维素、羟基丙基纤维素、羟基丙基甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、羧甲基纤维素、羧乙基纤维素、支链淀粉、聚乙烯醇、海藻酸钠、聚乙二醇、聚环氧乙烷、黄原胶、黄蓍胶、瓜尔胶、阿拉伯胶(acacia gum/arabic gum)、聚丙烯酸、甲基丙烯酸甲酯共聚物、羧基聚合物、直链淀粉、高直链淀粉、羟基丙基化高直链淀粉、糊精、果胶、几丁质、壳聚糖、果聚糖、爱生兰(elsinan)、胶原蛋白、明胶、玉米蛋白、麸质、角叉菜胶、巴西棕榈蜡、虫胶、乳胶聚合物、乳蛋白分离物、大豆蛋白分离物、乳清蛋白分离物和其混合物。
[0098]
任何合适的脂质均可用于制造脂质卷。在一个实施方案中，脂质包括一种或多种带负电荷的脂质。如本文所用，术语“带负电荷的脂质”包括在酸性、碱性或生理学ph下的水溶液中具有携带形式负电荷的头基的脂质，并且还包括具有两性离子头基的脂质。在一个实施方案中，所述带负电荷的脂质为磷脂。
[0099]
所述脂质卷还可以包括不带负电荷的脂质(例如，阳性和/或中性脂质)。典型地，所述脂质卷包括大量带负电荷的脂质。在某些实施方案中，大部分脂质带负电荷。在一个实施方案中，所述脂质是脂质的混合物，包含至少50％带负电荷的脂质，诸如磷脂。在另一实施方案中，所述脂质包括至少75％带负电荷的脂质，诸如磷脂。在其他实施方案中，所述脂质包括至少85％、90％、95％或98％带负电荷的脂质，诸如磷脂。在其他实施方案中，带负电荷的脂质(例如，磷脂)占脂质卷中的总脂质的30％-70％、35％-70％、40％-70％、45％-65％、45％-70％、40％-60％、50％-60％、45％-55％、45％-65％或45％-50％之间。在某些实施方案中，带负电荷的脂质(例如，磷脂)占脂质卷中的总脂质的40％-60％或45％-55％之间。在一些实施方案中，带负电荷的脂质(例如，磷脂)占脂质卷的非疏水性结构域组分中的总脂质的30％-70％、35％-70％、40％-70％、45％-65％、45％-70％、40％-60％、50％-60％、45％-55％、45％-65％或45％-50％之间。在某些实施方案中，带负电荷的脂质(例如，磷脂)占脂质卷的非疏水性结构域组分中的总脂质的40％-60％或45％-55％之间。在一些实施方案中，带负电荷的脂质是磷脂并且占脂质卷中或脂质卷的非疏水性结构域组分中的总磷脂的30％-70％、35％-70％、40％-70％、45％-65％、45％-70％、40％-60％、50％-60％、45％-55％、45％-65％或45％-50％之间。在一些实施方案中，带负电荷的脂质是磷脂并且占脂质卷中或脂质卷的非疏水性结构域组分中的总磷脂的40％-60％或45％-55％之
间。
[0100]
所述带负电荷的脂质可以包括基于蛋的脂质、基于牛的脂质、基于猪的脂质、基于植物的脂质或源自其他来源的类似脂质，包括合成产生的脂质。所述带负电荷的脂质可以包括磷脂酰丝氨酸(ps)、二油酰基磷脂酰丝氨酸(dops)、磷脂酸(pa)、磷脂酰肌醇(pi)和/或磷脂酰甘油(pg)和或这些脂质中的一者或多者与其他脂质的混合物。或者或另外，所述脂质可以包括磷脂酰胆碱(pc)、磷脂酰乙醇胺(pe)、二磷脂酰甘油(dpg)、二油酰基磷脂酸(dopa)、二硬脂酰基磷脂酰丝氨酸(dsps)、二肉豆蔻酰基磷脂酰丝氨酸(dmps)、二棕榈酰基磷脂酰甘油(dppg)等。在另一实施方案中，磷脂酰丝氨酸是蛋或牛源性磷脂酰丝氨酸。
[0101]
含有大豆脂质的脂质卷
[0102]
在一些典型的实施方案中，使用基于豆类的磷脂、更典型地基于大豆的脂质来制备下文所述的脂质卷，包括晶洞脂质卷。此类基于大豆的脂质可以是天然的或合成的。甚至更典型地，所述基于大豆的脂质是大豆磷脂，诸如大豆磷脂酰丝氨酸，以脂质卷的脂质组分的重量计，其量为40％-74％。或者，以脂质卷的脂质组分的重量计，大豆磷脂酰丝氨酸可以是约40％、45％、50％、55％、60％、65％或70％或其任何增值。应理解，所有值以及这些值和范围之间的范围均意图被本公开涵盖。在一个典型的实施方案中，磷脂包含45-70％的大豆磷脂酰丝氨酸。在一个更典型的实施方案中，磷脂包含45-55％的大豆磷脂酰丝氨酸。
[0103]
大豆磷脂酰丝氨酸是可商购的，例如购自avanti polar lipids,inc.alabaster,al。或者，可以根据众所周知并且标准的纯化技术从大豆磷脂组合物中纯化大豆磷脂酰丝氨酸，所述大豆磷脂组合物是数种大豆磷脂的混合物。
[0104]
在一些实施方案中，中性脂质与大豆磷脂酰丝氨酸组合使用以制备本发明脂质卷。如本文所用，术语“中性脂质”包括多种脂质物质中的任一种，其在生理学ph下以不带电或中性两性离子形式存在并且因此包括于缺乏阴离子功能的脂质的组内。此类脂质包括例如二酰基磷脂酰胆碱、二酰基磷脂酰乙醇胺、神经酰胺、鞘磷脂、二氢鞘磷脂、脑磷脂和脑苷脂。一般说来，通过考虑例如脂质卷尺寸和稳定性来指导用于本文所述的脂质卷组合物的中性脂质的选择。具有不同链长和饱和程度的多种酰基链基团的脂质是可获得的，或者可以通过众所周知的技术分离或合成。在一组实施方案中，可以使用含有碳链长度在c
14
至c
22
范围内的饱和脂肪酸的脂质。在另一组实施方案中，可以使用具有碳链长度在c
14
至c
22
范围内的单或二不饱和脂肪酸的脂质。在另一组实施方案中，可以使用具有碳链长度在c8至c
12
范围内的单或二不饱和脂肪酸的脂质。另外，可以使用具有饱和和不饱和脂肪酸链的混合物的脂质。
[0105]
在一些实施方案中，本公开中使用的中性脂质是dope、dspc、dppc、popc或任何相关的磷脂酰胆碱。可用于本公开的中性脂质还可以由鞘磷脂、二氢鞘磷脂或具有其他头基(诸如丝氨酸和肌醇)的磷脂构成。
[0106]
在一个典型的实施方案中，使用99.9％纯的二油酰基磷脂酰丝氨酸、99.9％纯的大豆磷脂酰丝氨酸、75％大豆磷脂酰丝氨酸和50％大豆磷脂酰丝氨酸来制造脂质卷。典型地通过添加中性脂质(包括但不限于鞘磷脂和/或磷脂酰胆碱)来修饰99.9％纯的磷脂酰丝氨酸的脂质组成。当使用较低纯度的磷脂酰丝氨酸(例如，50％大豆磷脂酰丝氨酸)作为起始材料时，所述较低纯度的磷脂酰丝氨酸可以经历萃取步骤以去除不需要的杂质，诸如核酸酶。
[0107]
晶洞脂质卷
[0108]
在一些实施方案中，本公开的脂质卷是晶洞脂质卷(geode cochleate/geodate)，如例如美国专利公布2013/0224284中所述，所述文献的完整公开内容以引用的方式并入本文中。晶洞脂质卷还包括包含带负电荷的磷脂的脂质单层，其中所述脂质单层围绕疏水性结构域(诸如油)；和货物部分，诸如本文所述的抗真菌化合物，其分散于所述疏水性结构域内。所述脂质单层被隔绝在晶洞脂质卷的脂质层内。
[0109]
如本文所用，“疏水性结构域”是实际上具有充分疏水性以允许围绕其周边形成脂质单层的组合物。疏水性结构域典型地包括与货物部分(诸如本公开的抗真菌化合物，诸如两性霉素b)缔合的疏水性组合物，诸如油或脂肪。在某些实施方案中，疏水性结构域(hd)与晶洞脂质卷的磷脂组分(pplgd)之间的比率hd:pplgd或蓖麻油结构域(cod)与晶洞脂质卷的磷脂组分(pplgd)之间的比率cod:pplgd为1:20或更低、1:15或更低、1:10或更低、1:8或更低、1:6或更低、1:5或更低、1:4或更低、1:3.5或更低、1:3或更低、1:2.75或更低、1:2.5或更低、1:2.25或更低、1:2或更低、1:1.75或更低、1:1.5或更低、1:1.25或更低1:1或更低。
[0110]
图5示出可以如何制造晶洞脂质卷的示例性示意图。在这种示例性方法中，使磷脂(表示为开环)与诸如油的疏水性结构域(带阴影圆圈)组合并混合以形成包含脂质体和围绕所述疏水性结构域的脂质单层的稳定乳液。货物部分(诸如抗真菌化合物等)可以分散于所述疏水性结构域内。所述疏水性结构域具有埋入其表面中的磷脂。不意图受任何理论的束缚，据信磷脂的疏水性酰基链是在疏水性结构域内，使得归因于包覆磷脂头基并形成稳定乳液，所述疏水性结构域具有亲水性表面。如果磷脂带负电荷，诸如具有磷脂酰丝氨酸，那么二价阳离子(诸如钙)的添加会诱导形成包含交替的二价阳离子和磷脂双层的结晶结构(或脂质层)。所述脂质层用阴影表示。在晶洞脂质卷中，围绕疏水性结构域的脂质单层被“包裹”或“俘获”于结晶基质内，类似于“晶洞”。
[0111]
脂质卷制剂
[0112]
用于本发明方法的如本文所述的脂质卷包含药物组合物。用于本文所公开的药物组合物的合适的制剂形式包括例如片剂、胶囊、软胶囊、颗粒、粉末、悬浮液、乳液、微乳液、纳米乳液、单位剂型、环、薄膜、栓剂、溶液、乳膏、糖浆、透皮贴剂、软膏和凝胶。然而，典型地，所述脂质卷是制备用于粘膜(例如口服或鼻内)、典型地口服施用。
[0113]
所述药物组合物可以包括其他药学上可接受的赋形剂，诸如多种ph和离子强度的缓冲液(例如，tris-hcl、乙酸盐、磷酸盐)；添加剂，诸如白蛋白或明胶，以预防表面吸收；蛋白酶抑制剂；渗透增强剂；增溶剂(例如，甘油、聚乙烯甘油)；抗氧化剂(例如，抗坏血酸、焦亚硫酸钠、丁基化羟基茴香醚)；稳定剂(例如，羟基丙基纤维素、羟基丙基甲基纤维素)；增粘剂(例如，卡波姆、胶体二氧化硅、乙基纤维素、瓜尔胶)；甜味剂(例如，阿斯巴甜、柠檬酸)；防腐剂(例如，硫柳汞、苯甲醇、对羟基苯甲酸酯)；助流剂(例如，胶体二氧化硅)、增塑剂(例如，邻苯二甲酸二乙酯、柠檬酸三乙酯)；乳化剂(例如，卡波姆、羟基丙基纤维素、十二烷基硫酸钠)；聚合物涂层(例如，泊洛沙姆或泊洛沙胺、乙酸琥珀酸羟丙甲纤维素)；包衣和成膜剂(例如，乙基纤维素、丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、乙酸琥珀酸羟丙甲纤维素)；佐剂；液体制剂的药学上可接受的载体，诸如水性(水、醇/水性溶液、乳液或悬浮液，包括生理盐水和缓冲介质)或非水性(例如丙二醇、聚乙二醇和可注射的有机酯，诸如油酸乙酯)溶液、悬浮液、乳液或油；和肠胃外媒剂(用于皮下、静脉内、动脉内、鞘内或肌肉内注射)，包括但
不限于氯化钠溶液、林格氏右旋糖、右旋糖和氯化钠、乳酸林格氏和固定油。
[0114]
在某些实施方案中，所述药物组合物包含盐，诸如nacl或胆汁盐，诸如氧胆酸盐、胆酸盐、鹅脱氧胆酸盐、牛磺胆酸盐、甘氨胆酸盐、牛磺鹅脱氧胆酸盐、甘氨鹅脱氧胆酸盐、脱氧胆酸盐或石胆酸盐。胆汁盐是与阳离子(通常是钠)复合的胆汁酸。胆汁酸是主要发现于哺乳动物的胆汁中的类固醇酸并且是可商购的。在一个实施方案中，胆汁盐包含胆酸盐。在另一实施方案中，胆汁盐包含脱氧胆酸盐。在另一实施方案中，胆汁盐包含胆酸盐和脱氧胆酸盐。在另一实施方案中，胆汁盐由胆酸盐和脱氧胆酸盐组成。
[0115]
在某些实施方案中，nacl的浓度为1mm至1m、1mm至0.5m、1mm至0.1m、1mm至50mm、10mm至100mm、10mm至50mm、0.1m至1m、0.1m至0.5m或者0.5m至1m。在某些实施方案中，胆汁盐的浓度为1mm至100mm、1mm至50mm、1mm至25mm、1mm至10mm、1mm至5mm、0.1mm至5mm、0.1mm至1mm或者0.1mm至0.5mm胆汁盐。
[0116]
这些赋形剂是举例提供的，并且本领域技术人员应知晓将有其他或不同的赋形剂可以提供与本文所列出的那些相同的化学特征。
[0117]
在一些实施方案中，本发明方法的camb包含以下组分：两性霉素b、磷脂、edta、水、维生素e、氯化钙、甲基纤维素、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、氢氧化钠、无水乙醇、磷酸二氢钾、山梨酸钾、乙酰磺胺酸钾和任选的调味剂。
[0118]
在一些实施方案中，使用下表2中所述的组分和量来配制本公开的camb。在一些实施方案中，将本公开的camb配制为27.5mg/ml悬浮液，因此1000mg剂量为36.4ml。
[0119]
表2脂质卷状两性霉素b的配方组成
[0120][0121]
美国fda“一般认为安全”(gras)，指定为食品添加剂或化妆品。
[0122]
组合物
[0123]
本公开还针对一种包含脂质卷包封的两性霉素b(camb)的组合物。在一些实施方案中，脂质卷包封的camb包含两性霉素b、磷脂、edta、水、维生素e、氯化钙、甲基纤维素、对
羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、氢氧化钠、无水乙醇、磷酸二氢钾、山梨酸钾、乙酰磺胺酸钾和任选的调味剂。在一些实施方案中，本发明的脂质卷包封的camb的前述组分的量是描述于上表2中。
[0124]
实施例
[0125]
实施例1.安全性和耐受性(i期)
[0126]
材料和方法
[0127]
从2019年10月至2020年1月，我们在乌干达坎帕拉对hiv阳性乌干达人进行了针对camb的1期安全性和耐受性试验。所述试验是设计为分两个连续期进行，其中27名参与者在1a期中登记并且9名参与者在1b期中登记。
[0128]
根据图6，所述camb以每天1.0g、1.5g和2.0g分4-6个分次剂量施用，其中每个剂量组有9名参与者。9名参与者中的至少6名在进入下一给药群组之前必须耐受所述剂量。剂量限制性不耐受性是定义为经历3级或更高ae，在服用剂量之后的30分钟内呕吐，或归因于ae或毒性而永久地停止服用所述药物。1b期的参与者接受在1a期中100％耐受的camb剂量，持续7天，以验证连续给药时的安全性和耐受性。1a期和1b期的参与者具有相同的纳入和排除标准。
[0129]
参与者是从先前的隐球菌性脑膜炎试验群组招募的(astro-cm；clinicaltrials.gov:nct01802385)(rhein等人,2019.lancet inf ect.dis.19:843-851)。所有招募的受试者均具有已解决的hiv相关隐球菌性脑膜炎的病史并且先前已经接受iv amb。纳入要求是年龄》18岁和计算的肌酸酐清除》70ml/min/1.73m2(在3个月内测量)。如果参与者展现出当前患病、有已知的未治疗的严重健康问题或在过去90天内已经接受两性霉素b疗法，那么参与者将被排除在外。怀孕或哺乳的女性被排除在外。种群(rahic)、生命体征和hiv特征概述于表3中。
[0130]
试验终点包括：1)在30分钟内没有呕吐的情况下接受并且耐受的日剂量的比例；2)根据通用术语标准ae(ctcae)等级评分标准(美国卫生与公共服务部nioh，国家癌症研究所，2017，不良事件通用术语标准(ctcae)v5.0)对恶心、呕吐、腹泻的累积评分；3)美国国家过敏和传染病研究所(niaid)艾滋病司(daids)毒性量表(2017版)针对1-5级或严重ae(sae)的不良事件(ae)发生率(美国卫生与公共服务部nioh，美国国家过敏和传染病研究所，艾滋病司，2017，艾滋病司(daids)成人和儿童不良事件严重程度分级表，修正版本2.1.)；4)通过视觉模拟和其他量表，参与者对camb的主观印象。对所有临床和实验室ae进行随访，直至解决。
[0131]
在1a期中，我们在0、6、12、24和48小时收集血浆用于药物动力学分析。我们在0、24和48小时监测全血细胞计数、化学性质、肾和肝功能测试，随后对任何异常结果进行随访。对于1b期，在+1天、+3天和+7天进行相同的实验室监测以用于安全性评价和药物动力学分析。在idi核心实验室执行所有实验室测量，所述实验室是美国病理学家协会(cap)认证的实验室并参与针对所有实验室分析的外部质量保证。
[0132]
统计分析主要是描述性的。在适当的情况下报告了中位数和四分位数间距或者数目和比例。使用线性梯形方法进行曲线下面积(auc)计算，并通过anova进行统计比较。使用视觉模拟量表来评价参与者对试验的各个方面的主观体验。临床和实验室不良事件(ae)的数目由艾滋病司(daids)毒性表(2017版本)概述。
[0133]
穆拉戈医院研究与伦理委员会、乌干达国家科学技术委员会、乌干达国家药物管理局和明尼苏达大学irb批准了所述研究。所有参与者都以其首选语言提供知情同意书。在每个给药群组之后执行内部审查以确保耐受性。在完成1期数据收集之后，数据安全监测委员会(dsmb)审查了所有安全性数据。
[0134]
结果
[0135]
在最初的单次递增剂量试验中，筛查了共计35名hiv阳性隐球菌幸存者。我们将9名参与者登记至三个连续给药群组中的每一者中：每天1.0g、1.5g和2.0g。所有参与者都是先前隐球菌性脑膜炎的幸存者(自先前诊断以来的中位时间为46个月)，并且先前已经接受约14天的iv amb。中位年龄为36岁(iqr，30
–
44)，其中41％(11/27)为女性。所有参与者目前都在接受抗逆转录病毒疗法(art)，其中15名(42％)服用阿扎那韦，并且37％(10/27)积极服用氟康唑200mg预防。
[0136]
满足耐受性标准要求参与者服用完整日剂量，在服用任何剂量之后30分钟内没有呕吐，报告2级或更低ae，并且不会因ae或参与者选择而停止camb。对于1.0g和1.5g群组，所有18名参与者都满足完全耐受性标准。在2.0g群组中，所有9名参与者均完成给药，但一名参与者在48小时之时经历3级实验室ae，即暂时性血小板减少症，病因不明。因此，仅89％(8/9)参与者在2.0g给药下满足完全耐受性标准。
[0137]
在1a期中的27名参与者中，8名(30％)经历至少一次临床ae。报告了共计31例独特的临床ae，其中24例(77％)为1级并且7例(23％)为2级。增加的ae数目与增加的camb剂量相关，其中65％(20/31)记录在2.0g群组中。没有发生3级、4级或严重ae。最常见的临床ae是腹痛(n＝5)，恶心(n＝5)，和头晕(n＝4)。在相同的27名参与者中，15名(56％)经历至少一次实验室ae。报告了共计24例实验室ae，其中14例(58％)为1级并且9例(38％)为2级。有一个3级不良事件，其中2.0g群组中的一名参与者分别在基线和24小时之时具有163,000和160,000个细胞/μl的血小板计数；接着在48小时之时下降至31,000个细胞/μl。没有报告血小板结块。使血小板计数重复数次以确保ae解决；截至两周时，计数反弹至172,000个细胞/μl。在记录的血小板减少症发生时，参与者没有临床恶化或出血迹象。没有发生4级或严重实验室ae。最常见的实验室ae是总胆红素升高(n＝6)；轻度孤立性ast升高(n＝5)，和轻度高钠血症(n＝5)，其符合daids 1级ae标准(146-149meq/l)，但在当地cap认证的实验室针对人群的正常范围内(138-150meq/l)。在ast升高中，仅一名慢性乙型肝炎患者伴有alt升高。不良事件概述于表4中。
[0138]
针对1b期，选择1.5g剂量作为“100％耐受”的1a期剂量。9名1b期参与者的人口统计学与1a期的那些相似。9名参与者中的八名在7天内完成了完全给药，其中一名参与者无意中错过了一天的给药。三名参与者经历了共计五例1级临床ae，均不严重。三名参与者还经历了共计六例1级实验室ae，同样没有一个符合严重ae的标准。总之，1b期的参与者作为门诊患者成功地服用camb，并且在7天的连续疗法中展示最小的不耐受或毒性证据。不良事件概述于表4中。
[0139]
在从camb起始时起的0、6、12、24和48小时测量camb的血浆浓度，并计算曲线下面积(auc)。图8描绘了在不同时间点的平均camb血浆浓度，示出血浆auc
0-最后
在三个给药群组中没有显著差异，平均为2350ng*h/ml(p＝)。图8中的误差线代表1.5g群组的95％置信区间。通过单因素方差分析(one-way anova)计算p-值。
[0140]
camb的半衰期为53小时，并且在24小时之时，平均峰c
max
为63.0ng/ml(
±
16.2)(在群组中求平均值)。在1b期群组的药物动力学分析中，在24小时之时的血浆水平(74.8ng/ml)是第7天97.7ng/ml水平的77％。在72小时之时，91.1ng/ml的血浆水平是第7天水平的93％。
[0141]
使用定性量表，我们评价了1a期群组中的参与者印象：他们的camb体验相对他们先前的iv amb体验。在参与前调查中，40％(10/25)指示与替代疗法相对，他们愿意再次接受iv amb来用于其隐球菌性脑膜炎。在完成研究随访之后，96％(26/27)的参与者指示他们更喜欢camb而非iv amb来用于隐球菌性脑膜炎治疗。总体说来，93％(25/27)认为多个剂量的camb非常方便用于疗法，相比之下，65％(15/23)的受访者考虑iv amb。一名参与者无法回忆起他们最初的iv amb疗法。对于1g和1.5g群组中的9名参与者中的8名来说，恶心严重程度评分被评为“无”，并且对于2.0g群组来说，9名参与者中的7名被评为“无”。相比之下，25％(6/24)回忆起了在iv amb下的严重恶心。
[0142]
表3.基线特征
[0143]
[0144][0145]
表4：不良事件概述
[0146][0147]
实施例2.功效(ii期)
[0148]
所述试验的功效期(ii期)将是一项前瞻性随机研究，以评估口服脂质卷包封的两性霉素(camb)与iv两性霉素(amb)相比用于诱导疗法的安全性、耐受性和微生物学功效。在实验组中登记的参与者将在诱导疗法的持续时间的四个阶段中接受口服camb+5-氟胞嘧啶(5-fc)，使用i期试验中发现的最大耐受剂量的camb，即如下剂量，其中至少66％(9名中的6名)接受完整日剂量的参与者在长达48-96小时内具有等级《2gi毒性及等级《2实验室ae。所述实验组将在6周内接受camb。随机化至对照组的参与者将接受2018年who推荐的护理标
准。2每个阶段之后都将有预定的登记暂停。
[0149]
简单说来，2018年who推荐的护理标准如下。对于成人、青少年和儿童，相继使用两性霉素b脱氧胆酸盐(1.0mg/kg/天)和氟胞嘧啶(100mg/kg/天，分成每天四个剂量)、1周氟康唑(对于成人为1200mg/天，对于儿童和青少年为12mg/kg/天，高达每日800mg的最大剂量)的短疗程(一周)诱导方案是用于治疗hiv感染者的隐球菌性脑膜炎的优选选项(强烈推荐，对于成人为中等确定性证据，对于儿童和青少年为低确定性证据)。取决于药物可用性的替代诱导方案是(1)两周氟康唑(对于成人为每日1200mg，对于儿童和青少年为12mg/kg/天)+氟胞嘧啶(100mg/kg/天，分成每天四个剂量)(强烈推荐，中等确定性证据)；或(2)两周两性霉素b脱氧胆酸盐(1.0mg/kg/天)+氟康唑(对于成人为每日1200mg，对于儿童和青少年为12mg/kg/天，高达每日800mg的最大值)(强烈推荐，中等确定性证据)。
[0150]
氟康唑(对于成人为每日800mg，对于儿童和青少年为6
–
12mg/kg/天，高达每日800mg的最大值)被推荐用于巩固期(在诱导期之后持续八周)(强烈推荐，低确定性证据)。氟康唑(对于成人为每日200mg，对于青少年和儿童为6mg/kg/天)被推荐用于维持期(强烈推荐，高确定性证据)。
[0151]
参与者
[0152][0153]
所述研究的功效期的参与者包括患有隐球菌性脑膜炎的个体(包括hiv患者)，他们由于csf真菌培养物对隐球菌属呈阳性而得到诊断和/或呈csf隐球菌抗原(crag)阳性，并愿意接受协议规定的腰椎穿刺。具有先前已知的隐球菌性脑膜炎的先前病史的受试者将被纳入所述试验中。用于纳入这一患者群体的基本原理是在疾病复发和氟康唑抗性之间存在强关联性，因此我们相信添加camb可能对这一患者群体非常有益。
[0154]
所述研究的这一期排除了小于18岁、格拉斯哥昏迷量表《15、在过去30天内已经接受三个或更多剂量的iv两性霉素b疗法、无法服用肠内药物、怀孕或哺乳、不能或不太可能参加定期门诊、接受化学疗法或皮质类固醇、怀疑患有反常免疫重建炎症综合征(iris)或最近已经起始hiv疗法或抗逆转录病毒疗法(art)类别转换(2周内)的那些个体。
[0155]
治疗方案
[0156]
阶段1
[0157]
如图7所描绘，所述研究的功效期包括四个阶段。所述试验的第一阶段包括一项10人非随机观察性2a期研究，以评价camb研究药物在隐球菌性脑膜炎人群中的安全性和耐受性。阶段1实验组接受诱导疗法，其包括1a)从第1天至第5天，iv两性霉素b脱氧胆酸盐1mg/kg/天；从第5天至第14天，口服camb 2a)从第1天至第14天，口服5-fc，100mg/kg/天。在诱导治疗期期间口服施用的camb的剂量是发现具有2级或更低不良事件的9名i期试验参与者中有6名可耐受的分次剂量。
[0158]
在所述阶段1研究的诱导治疗期之后是巩固治疗期，其包括1b)从第15天至第6周，口服camb；2b)从第15天至第10周，口服氟康唑，800mg/天，和3b)其后是氟康唑，200mg/天(维持疗法)。在巩固治疗期期间口服施用的camb的剂量是发现具有2级或更低不良事件的9
名i期试验参与者中有9名可耐受的分次剂量。在确认阶段1剂量方案的安全性之后，所述研究将进入阶段2。
[0159]
阶段2
[0160]
在阶段2中，参与者将2:1随机化至实验组(n＝40)对对照组(n＝20)。这一阶段正在测试与接受标准护理iv amb的对照相比，缩短iv amb疗法的持续时间的功效和安全性。
[0161]
阶段2实验组接受诱导疗法，其包括1a)从第1天至第2天，iv amb，1mg/kg/天；从第2天至第14天，口服camb 2a)从第1天至第14天，口服5-fc，100mg/kg/天。在诱导期期间口服施用的camb的剂量是发现具有2级或更低不良事件的9名i期试验参与者中有6名可耐受的分次剂量。
[0162]
在所述阶段2研究的诱导疗法之后是巩固治疗期，其包括1b)从第15天至第6周，口服camb；2b)从第15天至第10周，口服氟康唑800mg/天，和3b)其后是氟康唑，200mg/天(维持疗法)。在巩固治疗期期间口服施用的camb的剂量是发现具有2级或更低不良事件的9名i期试验参与者中有9名可耐受的分次剂量。
[0163]
在第12个总体受试者(所述阶段的20％)积累》2周的数据之后，将聚焦于efa csf清除率进行早期安全性审查。这一早期安全性检查将仅聚焦于csf efa。如果对实验组中的csf清除率有任何疑问，那么可以进行更频繁的efa安全性审查。在第60个受试者积累≥4周的随访数据之后，还评估csf清除efa、安全性、存活和耐受性数据。
[0164]
随机化至对照组的参与者接受(根据2018年who指南)3诱导疗法，其包括1a)从第1天至第7天，iv amb，1mg/kg/天；2a)从第1天至第7天，口服5-fc，100mg/kg/天。在诱导疗法之后是巩固治疗期，其包括从第15天至第10周，口服氟康唑，800mg/天，随后参与者接受维持疗法，即口服氟康唑，200mg/天。
[0165]
2018年who推荐的方案是基于一项iii期随机临床试验，证明：1)1周iv amb具有与2周iv amb相等的存活；2)1周iv amb组合疗法的毒性低于2周iv amb；和3)辅助性5-fc具有优于辅助性氟康唑的存活。
[0166]
阶段3
[0167]
阶段3是一个观察性2a期安全性群组以评价开始使用口服camb和5-fc进行初始诱导疗法的安全性。十名参与者将接受5天的口服camb，接着转换为预定的iv amb疗法。这一阶段的主要目的是评价在iv amb负载剂量不存在下的初始csf清除率(即，efa)，以便确定进入阶段4的安全性。
[0168]
阶段3实验组接受诱导疗法，其包括1a)从第1天至第5天，口服camb 2a)从第6天至第14天，iv amb，1mg/kg/天3a)从第1天至第14天，口服5-fc，100mg/kg/天。在诱导期期间口服施用的camb的剂量是发现具有2级或更低不良事件的9名i期试验参与者中有6名可耐受的分次剂量。
[0169]
在所述阶段3研究的诱导疗法之后是巩固治疗阶段，其包括1b)从第15天至第6周，口服camb；2b)从第15天至第10周，口服氟康唑，800mg/天，和3b)其后是氟康唑，200mg/天(维持疗法)。在巩固治疗期期间口服施用的camb的剂量是发现具有2级或更低不良事件的9名i期试验参与者中有9名可耐受的分次剂量。在确认阶段1剂量方案的安全性之后，所述研究将进入阶段4。对于阶段3来说，没有对照组。
[0170]
在第10个受试者积累≥4周的随访数据之后，还评估csf清除efa、安全性、存活和耐受性数据。阶段2的对照将可用于关于预期结果的非统计比较。
[0171]
阶段4
[0172]
在阶段4中，参与者将2:1随机化至实验组(n＝40)对对照组(n＝20)。对照组的给药方案与上文关于阶段2所述相同。这一阶段测试是否可以在没有iv amb的情况下使用口服camb。
[0173]
阶段4实验组接受诱导疗法，其包括1a)从第1天至第14天，口服camb，和2a)从第1天至第14天，口服5-fc，100mg/kg/天。在诱导期期间口服施用的camb的剂量是发现具有2级或更低不良事件的9名i期试验参与者中有6名可耐受的分次剂量。
[0174]
在所述阶段4研究的诱导疗法之后是巩固治疗阶段，其包括1b)从第15天至第6周，口服camb；2b)从第15天至第10周，口服氟康唑，800mg/天，和3b)其后是氟康唑，200mg/天(维持疗法)。在巩固治疗期期间口服施用的camb的剂量是发现具有2级或更低不良事件的9名i期试验参与者中有9名可耐受的分次剂量。
[0175]
在第12个总体受试者(所述阶段的20％)积累》2周的数据之后，将仅聚焦于efa csf清除进行早期安全性审查。这一早期安全性检查将仅聚焦于efa csf。如果对实验组中的csf清除率有任何疑问，那么可以进行更频繁的审查。在第24个受试者(所述阶段的40％)积累≥4周的随访数据之后，还评估csf清除efa、安全性和耐受性数据。除非调查员有疑问，否则将继续登记。
[0176]
所有四个阶段中的参与者均将在诊断时、第3天、第5-7天、第10-14天接受腰椎穿刺(lp)，另外还需要控制颅内压并记录csf灭菌。在第一周期间进行的治疗性lp具有约70％相对存活获益。