专利名称：冷冻红血细胞的方法
技术领域：
本发明涉及一种冷冻红血细胞(红血球)的方法，使它能长时间储存，并仍然适宜输血。
为输血目的而储存血液是已知的，血液通常在4℃的冷冻条件下储存，在这一温度下，血液的最长有效期大约为5周。因此，为保持充分的供应，就需要献血者连续不断的合作。但是有些时候，如圣诞节前后，供应就会短缺。还有某些场合，严重的灾难使某一特定的地区供应短缺。希望储存自身血液的人数也在增加，例如在选择的外科手术之前。于是，就需要一种长时间储存血液供应品的方法。
将血液冷冻至很低的储存温度使血液的长期储存成为可能。但是提供冷冻血液来输血被证明是不可能的。通常以大约450ml为标准单位储存血液，这是一位献血者一次献血的体积。病人通常以该单位的整数倍接受输血。冷冻这样一个体积的血液导致红血细胞的溶血作用，这使血液不能用于以后的输血。溶血作用导致对心脏有毒的钾的释放和基质(细胞碎屑)的释放，而基质会导致肾脏损伤。一般认为，输血可接受的血液中，红细胞的溶血作用必须大体上不高于1%。在通过冷冻而储存血液的方法中，血液被离心，使血浆和血小板与红血细胞分离，将红血细胞与低温防护剂相混合，通常用液氮再将该混合物冷冻至一个很低的温度，通常使用的低温防护剂是甘油。但是甘油是有毒的，制备用于输血的红细胞需要洗涤几次以除去甘油。这一方法涉及昂贵的设备，就负责的人员方面，需要高水平的技能，经验和不断的实践，还需要高度无菌区。洗涤过程每个单位花费大约20分钟，并且造成15%-20%的细胞损失。一种更有吸引力的低温防护剂是羟乙基淀粉(HES)，即laevosan。美国专利US3，758，382描述了含有抗凝血剂(酸化柠檬酸葡萄糖)的55ml全血样品如何与平均分子量为40，000-70，000的40%W/V的HES相混合，使其最后浓度为12-14%W/V HES。将该混合物浸入-190℃的液氮中，并以200次循环/分振动直至冻结。在-140℃储存一周后，将混合物在47℃的水溶液中浸入60秒，并以160次循环/分摇动进行解冻，可得到恢复系数高达99%(平均97.4%)的红血细胞。用于冷冻的体积，即55ml，只是标准体积的几分之一，如果用于通常的输血，会造成不希望的复杂性。
在该方法的改进中，考虑到标准单位血液的冷冻，美国专利US4，018，911描述了一种用平均分子量为150，000的HES冷冻血液的方法。将血液离心，使血浆和血小板与红血细胞分离，将一些血浆与HES混合。加入血浆的原因是，认为这对保护红血细胞是必需的。血浆和HES的混合物然后与大致相同体积的细胞混合，使最后混合物中HES的比例约为14%数量级。450ml的献血标准单位到那时候已被减少至大约405ml。把血浆和HES的混合物加入到冷冻袋中的红细胞中，在进一步混合之后，把冷冻袋放入与摆式摇动器相连的夹架中，该夹架是由铰接的并用螺栓固定在一起的两个钻孔的金属侧板做成。血袋靠不锈钢制成的侧板所赋予的刚性被夹持在它们之间，使得在冷冻时保持一个大致均匀的横截面。均匀的横截面可实现最快速度的冷冻，钢板使血袋在摇动时基本上保持刚性。血袋和夹架垂直地浸入液氮中，并在其内容物冷冻时使其摇动。在一个405ml单位正被冷冻时，由于这样一个单位的体积，又由于必须保持一个快速的冷却速率而使红血细胞的溶血作用减至最小，摇动过程是必需的。为输血目的而解冻血液时，在机械搅动下将其浸入大约54℃的水浴中1分钟左右。这样处理后的血液可立即用于输血(只要溶血的程度是可以容许的)，这就是优于用甘油冷冻血液单位的主要好处。这是因为细胞外的低温防护剂HES是无毒的和不致免疫的，类似体糖原，所以不需要将其除去。
美国专利US4，018，911描述了一种用该方法冷冻仅25ml样品的试验方法。在该方法中，在解冻后状态下，平均99.2%的红血细胞恢复，在半小时后在等渗压盐水中87.3%是稳定的。但是，全量的标准单位体积的结果要差得多，细胞恢复率下降为97.2%，盐水稳定率下降为75.7%。
使用HES作为低温防护剂用于冷冻保存红细胞、血小板、白细胞、骨髓细胞以及其它器官细胞在英国专利申请GB2046772A中被描述。这些细胞通过例如离心、细胞分离、过滤或吸附被分离。红细胞冷冻过程的简要描述涉及通过细胞分离(与离心不同，估计可能会留下一些有细胞的血浆)和以2/3(HES/红血细胞浓度)的比例加入10%的HES溶液来分离细胞。恢复率声称在95%-98%。这些现有技术文件表明有可能采用HES作为低温防护剂以非常小的批量(美国专利US4，018，911中为25ml)、在可接受的溶血水平下储存和恢复红细胞。然而，至今尚不能以与输血技术相协调的量来储存和恢复红细胞。此外，名义上相同的样品其恢复系数变化之高不能容许。于是，虽然长期以来已知有关用HES低温防护冷冻红血细胞的输血服务的潜在价值，但是，至今还不能设计出一种方法，给出可容许的溶血程度，而且恢复系数的变化范围又很小。
根据本发明，一种采用HES作为低温防护剂的冷冻红血细胞的方法包括下述步骤将一个单位的血液离心，使血浆和血小板与红血细胞分离，将红血细胞与HES混合，冷冻该混合物，其特征在于混合前的红血细胞的细胞压积不小于90%，混合物中存在的HES不大于7%W/V HES/红血细胞。细胞压积、或haemocrit是一个该技术中已知的函数，其定义如Sir John V Davie和S M Lewis所著《实用血学》第6版、第32页，Churchill Livingstone 1984，ISBN 044301981-9。应注意到，采用本发明的方法，和现有技术对照，在混合物中大体上不存在血浆。并且，尽管丧失了由血浆提供的保护作用，本发明的方法采用了更加低得多的HES/红血细胞的W/V百分比。除了达到可容许的溶血程度外，本方法的另一个优点是由不存在血浆和HES的降低所致。血浆中含有许多不同的蛋白质，包括与凝血有关的因子，其中之一是因子8，已发现当HES与血浆混合时，当HES增加时，对某些蛋白质，特别是凝血因子，补体成分，免疫蛋白和fibronectin有愈来愈不溶解的趋势(S Bell理科硕士论文，Brunel大学图书馆)。这些蛋白质形成聚集物，导致血浆呈牛奶色。遇到未处理的血浆时，不论在体内或是在试管里，这些聚集物起蛋白质进一步聚集的中心的作用，而同时HES能和新鲜血浆中更多的蛋白质发生作用。结果生成的碎屑由巨噬细胞除去，所以可能暂时地降低病人的免疫球蛋白。由于凝血因子和fibronectin受了影响，流血时间可被延长，且与HES的“剂量”成比例。HES最好是40%W/V的溶液形式，HES的平均分子量范围为150，000-200，000，一个优选的单位是以450ml的标准献血单位为基础的，让大约200ml红血细胞与35ml 40%HES溶液相混合，给出一个总的用于冷冻的单位为大约235ml。
红血细胞在同HES混合之前，用抗凝血剂和防腐剂(例如，CPDA，CPD或肝素)来处理更加有益。
冷冻过程最好在液氮中进行，冷冻袋中的混合物夹在一个框架中，该框架由两个平行的钻孔板组成，冷冻袋置于其间。两个板可以在彼此重直方向上略作移动而仍保持相互平行。
优选的框架是曲面形式的铝板，曲面是或者圆柱形、或者最好是球形的一部分。
已发现冷冻袋中的混合物在冷冻过程中对冷冻袋的局部增厚很敏感。冷冻时，混合物有膨胀的趋势。现有技术的冷冻框架或者变形给出局部的膨胀，来适应这种膨胀;或者阻止充分的膨胀，从而造成破碎损坏。通过允许平行板的垂直方向运动可避免冷冻混合物的局部增厚。采用本发明的方法，用于冷冻的一个标准单位的体积(235ml)，可使混合物以足够的速度冷冻，而无需象原有方法那样摇动冷冻袋。这就显著降低了对设备的要求，以及操作上的复杂性，也避免了溶血的潜在原因。(因摇动造成的细胞的机械损伤)。
离心后的红血细胞最好直接放入已装有HES的冷冻袋中。
用上述方法的冷冻血用于输血时，最好浸入43.5℃左右的热水中，不要摇动(避免溶血另一个可能的原因)，保持将近10分钟，直至达到接近人体的温度。
已发现采用上述方法冷冻和解冻一个血液单位，可以实现以一个标准献血单位为基础，半小时后，盐水稳定细胞的产率为91%SD±0.75%，解冻的平均恢复率为99.1%±0.12%。可在从液氮贮存取出后11分钟内，血液可准备好给病人输血。
来自献血者的血液 通过管 送入含有抗凝血剂和防腐剂(CPDA)的储存袋 ，密封该袋并置于一个离心上 。离心袋 分离出血浆和血小板，压挤并送入袋。堆积到细胞积压不小于90%的红血细胞，送入冷冻袋 ，其中装有大约35ml的羟乙基淀粉(HES)，最好为40% W/V，平均分子量为150，000-200，000。这在红血细胞外部浸泡它的流体中，给出大约25.5%的HES，使得HES总的百分比不大于7%W/V(优选为6%W/V)。
冷冻袋 是扁、薄、方形。在挤出空气后袋 移开并密封，例如通过手工颠倒或旋转几分钟将HES和红血细胞混合。
从输血到密封袋 的过程必须在无菌条件下进行，这一步骤最好被安排得从管 到冷冻袋 的连接是连续的并且是不断开的，并使得任何脱开可由任何连接处的同时分开的密封实现。离心的一般方法以及红血细胞与溶剂(HES)混合的一般方法在现有技术中是众所周知的，例如美国专利US4018911，在这里就不作更详细的描述了。
冷冻框架 有两个板 。每个都大体上是方的，弯曲成球表面的一部分，这些球是同心的，外层球的半径比内层球大3mm，球度的数量级使得例如在大约33cm长的冷冻框架的弦的中心有2cm的位移。(已发现这个尺寸的冷冻框架适合于冷冻一个标准单位的血液)每个板 的边缘，都有凸缘 ，使两个板可彼此相关地固定。
每个板都是由良导热性的材料制成，最好用铝制。每个板上都有许多穿孔 ，占据了大约50%的表面积。冷冻袋 放在板 上，使它能完全被板上的穿孔部分完全包围 。第二个板 然后被放在第一个板 和袋 之上，用一些夹具 夹持以固定其位置。每个夹具 的夹臂 都具有一定程度的挠性，并且它们固定的位置使它们夹住框架。
不覆盖及冷冻袋 的边缘。
框架 和冷冻袋 垂直地浸入一桶液氮中 ，HES和红血细胞的混合物在大约30秒钟内迅速冷冻。冷冻时混合物有膨胀的趋势，夹具 夹臂 的挠性使板 可略微地分开方向移动，以补偿这种膨胀。但是，板 的曲率使它们的变形的结果使它们在所有点上彼此保持平行，于是在冷冻袋全部面积范围内保持了它的厚度恒定。已发现这一点是很重要的，因为冷冻袋的局部膨胀会导致局部溶血增加。
上述的冷冻血液可在液氮温度下储存相当长的时间，当从冷冻器中取出时，在用于输血之前，最好将它浸入大约43.5℃的热水中，不要摇动，保持大约10分钟。在这段时间内，最好使它的温度上升至人体血液的温度。
已发现采用这种方法，溶血程度的量级不会比1%更差，和原有的冷冻和制备方法相比，这是一个相当好的红血细胞的回收率。
下面的表1给出了采用上述方法冷冻和恢复的10个样品的详细情况。所用的冷冻框架是厚度为0.9mm的钻孔板，边缘厚度为1.2mm。
表2列出了一些重要参数，说明氧气迁移率和红细胞存活率没有变化或者受上述方法的影响不大。
表110包235ml HES(LAEVOSAN)／血液的解冻后质量控制结果％盐水稳定率％恢复率1/2小时2小时91.5 88.599.3 第1包00.1 87.599.1 第2包9289 99.0 第3包92.5 90 99.2 第4包90.3 87.899.1 第5包90.4 87.899.1 第6包91.3 88.999.1 第7包91.1 88.899.1 第8包90.6 88.298.9 第9包90.5 88.298.9 第10包平均1/2小时稳定率平均恢复率＝99.1%在盐水中＝91.0%, SD 0.12%SD 0.75%平均血浆稳定率比盐水稳定率高4％
因此，可以看出，本方法可保存和恢复标准单位的红细胞，并具有可重复的为输血目的所容许的溶血程度。标准单位的体积减小到大约235ml是一个附加的优点。因为它使更多的单位(即更多的红血细胞)能一次输给病人。
输血混合物中，基本上没有会伤害病人的杂质，并且，HES的量减小至现有技术冷冻方法的用量的25%左右。而且，整个过程比现有技术所描述的冷冻方法过程更简单，因为它不需要机械，例如在冷冻过程中用于振动冷冻框架和冷冻袋的机械。实际上，操作者除了保护性长统手套和一副夹钳之外，不需要更多的设备就能够冷冻血液。而且，解冻步骤可由未经训练的志愿者来完成，除了一桶他为判断为“烫手”的水，并估计10分钟时间之外，没有任何更复杂的事情，仍然能获得很好的效果。
应当认识到，在本发明的范围内，可以采用上述方法和设备的各种改进都可以。例如，板 已描述为球形，这当然是一种理想的情形。单单圆柱形的弯曲，或者某些成角度的形状，也是可以的。只要它在冷冻过程中，在允许垂直的相对运动时能保持2个板的平行性。另外，除铝之外的其它材料也可以用来制造板。
还应当认识到，虽然本方法的意图是要用标准单位的血液，以便与常规的献血和输血实际相适应，但是，也可采用更小的单位。例如可用于Sachets的准备中(即小尺寸的袋，例如，5cm2的尺寸)用于实验目的的储存，或者用于稀有血型样品的储存。
权利要求
1.一种采用HES作为低温防护剂冷冻红血细胞的方法，包括下列步骤将一个单位的血液离心，使血浆的血小板与红血细胞分离开来，将红血细胞与HES混合，并冷冻该混合物。其特征在于，混合之前的红血细胞的细胞压积不小于90%，混合物中存在的HES不大于7%W/V的HES/红血细胞。
2.按照权利要求1所述的方法，其特征在于HES以6%W/V HES/红血细胞的比例存在。
3.按照权利要求1或2所述的方法，其特征在于HES是40%W/V/HES的溶液形式。
4.按照权利要求1至3中任何一个所述的方法，其特征在于HES的平均分子量在150，000-200，000的范围内。
5.按照权利要求1至4中任何一个所述的方法，其特征在于血液单位是以450ml的标准献血单位为基础。
6.按照权利要求1至5中任何一个所述的方法，其特征在于，红血细胞在与HES混合之前，用抗凝血剂进行处理。
7.按照权利要求1至6中任何一个所述的方法，其特征在于冷冻在液氮中进行。
8.按照权利要求1至7中任何一个所述的方法，其特征在于该混合物置于一个冷冻袋中。
9.按照权利要求8所述的方法，其特征在于在冷冻过程中，冷冻袋被夹在一个具有两个平行的钻孔板的冷冻框架上。
10.按照权利要求9所述的方法，其特征在于这两个板适合于在彼此垂直方向上略微地移动而仍保持平行。
11.按照权利要求10所述的方法，其特征在于这些板是弯曲的。
12.按照权利要求11所述的方法，其特征在于这些板是球形弯曲的。
13.按照权利要求11所述的方法，其特征在于这些板是圆柱形弯曲的。
14.按照权利要求9至13中任何一个所述的方法，其特征在于冷冻框架为铝制的。
15.按照权利要求14所述的方法，其特征在于这些板的钻孔区域的厚度为0.9mm。
16.按照权利要求14或15所述的方法，其特征在于这些板的非钻孔边缘的厚度为1.2mm。
17.按照权利要求9至16中任何一个所述的方法，其特征在于在冷冻过程中不摇动该冷冻框架。
18.一种大体上如这里描述的使用HES作为低温防护剂冷冻红血细胞的方法。
19.本方法使用的、具有特征如权利要求9至16中任何一个所述的一种冷冻框架。
20.一种大体上如这里描述的冷冻框架。
21.一种冷冻红血细胞的方法，其特征在于包括下述步骤将450ml标准献血单位的血液离心，去掉血浆和血小板，得到细胞压积不小于90%，占据大约200ml的体积的红血细胞;将红血细胞置于一个装有大约35ml 40%W/V HES溶液的冷冻袋中，HES的平均分子量为150，000-200，000;把冷冻袋定位于一个冷冻框架上，该冷冻框架由两个平行的弯曲板构成，两者可以在彼此垂直方向作略微的移动而仍保持平行;以及将冷冻框架放入液氮中，直至HES加红血细胞的混合物被冷冻，在冷冻过程中不摇动冷冻框架。
22.一种准备将权利要求1至18及21中任何一个方法中的红血细胞，用于输血时的方法，其特征在于将HES和红血细胞的混合物浸入43.5℃左右的热水中，在不需要摇动下，保持大约10分钟。
全文摘要
一种冷冻一个标准献血单位的红血细胞的方法，使之可以长期储存，随后以一种对输血是足够纯的形式被恢复，该方法包括将一个血液单位进行离心，分离出血浆和血小板，并使红血细胞的细胞压积不小于90％，把红血细胞置于装有HES溶液的冷冻袋(13)中，使得HES/红血细胞的比例不大于7％W/V(优选为6％W/V)，将冷冻袋(13)定位于一个冷冻框架(20，21)上，该框架适合于保持袋内物厚度均匀，并在不摇动下将冷冻框架(20，21)置于液氮中。
文档编号A61M1/02GK1049103SQ90101409
公开日1991年2月13日 申请日期1990年2月8日 优先权日1989年2月8日
发明者苏珊·海伦·贝尔, 斯图尔特·格雷厄姆·纳什, 厄恩斯特·悉尼·帕里, 迈克尔·约翰·格林·托马斯 申请人:英国国防部