用于核磁共振成像的颗粒及其制备方法

专利名称：用于核磁共振成像的颗粒及其制备方法
技术领域：
本发明涉及当在混悬液中时能注入患者血流的氧化铁颗粒。该种颗粒抗凝集的稳定性增强，它们对于网状内皮系统(RES)是相对觉察不出的，它们对巨噬细胞的清除作用抵抗力增加。该种颗粒对制备血池造影对比剂是有用的。
氧化钛颗粒以可注射水悬液的形式用于诊断目的，过去已引起人们很大兴趣。铁磁性物质或超顺磁性铁矿微晶已被用作肝脾核磁共振成像(MRI)的对比剂。它们在这些器官用作对比剂是基于这些颗粒注射后很快被RES识别并迅速被捕获的观点。这些颗粒然后从血流中清除，贮存于肝脏和脾脏，随后被消除。已作了很多努力以改进已知剂型，目的在于使超顺磁性颗粒从体内消除之前在靶器官如肝、脾或骨髓中的摄取增加，使它们的应用更有实效。
随着核磁共振(NMR)分析的发展，人们认识到，如果能提供一种对比剂，其性质能使NMR分析用于整体而非仅仅某些部位，技术将会有相当大的改进，现有技术可获得重要的进展。但是，为此目的，必须提供一种介质，其磁性至少与迄今已知的氧化铁颗粒的磁性一样好，而其在血流中的保留时间比现有技术中已知的任何其他颗粒均长。因此，在这方面要解决的问题是找到一种颗粒，它在给定时间内不被RES识别。据报导，通过使用各种涂层材料于氧化铁颗粒上，可得到改进的氧化铁颗粒，可提高保留时间，或有助于颗粒向动物或人体其他特定部位的输送。
EP-A-0272091(VESTAR)揭示了在活性成分即磁性氧化铁(和其他诊断剂或药物)的固体颗粒上(所述活性成分构成颗粒的芯核)，涂覆以第一层单分子两亲物层，该两亲物可与芯核成分结合;该系统还包括第二层即外层，它可包括包裹着两亲物的磷脂双分子层(即脂质体膜类似物)。在实施例中，涂有棕榈酸作为表面活性剂的磁性氧化铁颗粒包裹在由胆固醇和二硬脂酰膦脂酰胆碱构成的脂质体中。这种安排的一个目的是使活性成分在循环中具有抗清除的稳定性。
EP-A-0275285(ADVANCEDMAGNETICS)揭示了有涂层和无涂层的磁性氧化铁颗粒用作NMR成像的对比剂。当有涂层时，颗粒被聚合物包裹，生物活性分子可连接于其上。在涂层颗粒的情况下，生物分子可选择得以特定的器官或组织为目标。所公开的聚合物涂层可由蛋白质如白蛋白、多糖类如葡萄糖、多肽类如聚谷氨酸酯或聚赖氨酸、或有机硅烷类如N-2-氨乙基-3-氨丙基三甲氧基硅烷所制成。可共价结合于涂层的生物分子为抗体、碳水化合物或激素，它们可增加颗粒对生物体特定部位的特异性和生物分布。
EP-A-0354855(TERUMO)公开了脂质体作为药物载体泡囊，在泡囊脂质层含有与聚乙二醇结合的磷酯。磷脂的疏水部分陷入构成膜的脂质或结合于其上，而聚乙二醇的亲水部分从成膜脂质上伸出并延伸到周围介质中。据说脂质体泡囊可用来将血红蛋白包在其中以制备人造红细胞。
US-A-4，904，479(ILLUM)公开了用同时有亲水性和疏水性片段的两亲嵌段共聚物(如Poloxamer
和Poloxamine
)涂覆聚苯乙烯颗粒。该涂层目的在于使注射后的调理素作用减为最小，使颗粒导向胃髓而不是肝脏或脾脏。Poloxamer
和Poloxamine
是相继地包含聚氧丙烯疏水片和聚氧乙烯亲水片段的两亲嵌段共聚物。据信，为了防止被肝脏摄取，亲水片段从颗粒外涂层表面伸出，从而使调理素沉积其上有了空间阻碍，并使颗粒不易被巨噬细胞识别。
虽然现有技术的方法有长处，它们只涉及颗粒的一个特定问题，这些颗粒可被选择性地导向不同的特定部位(例如肝、脾、肺、淋巴结、骨髓等)，而本发明则是解决颗粒的制备问题，这些颗粒不能被RES所识别，它们在血液中维持时间延长，可用来制备长效血池试剂。
现有技术的颗粒需昂贵的制造技术，制得的颗粒注射后就被RES识别，容易被从血液中清除。这样的颗粒及由此制成的对比剂不能被用于需相对长生物半衰期的应用情况。
在血中存在时间长(即对RES摄取有好的抗御力，向组织或血管外部位扩散度较低)的对比剂在本领域中被认为是特别有用的“血池”试剂。如果想产生有意义的分析结果而避免反复注射和使用大量对比介质，有时就需要血池试剂有长的生物半衰期。为了得到长效血池试剂，可能需要制备“隐秘”(stealth)颗粒，它在一个时期内不会被RES识别，它还提供足够的磁性弛豫响应(magneticrelaxationresponse)。有了真正的“隐秘”氧化铁颗粒，就会使整个人体的NMR分析成为可能，而不象迄今已知的对比剂那样只能作局部或特定器官的分析。因而，隐秘颗粒可使采用无伤害技术测量各种器官(包括脑)的血容量和血流量成为可能。例如，监测脑皮质在激活时血液氧合作用的变化将成为可能。
能在血流中保留长时间的颗粒还会提供在各种生理条件下关于细胞状况和营养物在各器官分布的很有价值的信息。用这样的颗粒制成的对比剂能直接洞察体内血液微循环和细胞的代谢循环，为更好地了解生命体过程开创新的途径，从而导致更好地检测异常情况如肿瘤的生长。但是，现有技术尚未成功地提供长效磁性颗粒及由此制成的血池对比剂，这种对比剂能使这些分析技术进行这样的测量并产生满意的资料。
简言之，本发明涉及用于人或动物体诊断图像分析，特别是MRI分析的血池对比剂，它们在血流中保留时间长，从而能测量各器官的血容量和血流量。本发明更具体地涉及对RES快速摄取的抗御力特别强的对比剂，当注射后，它比迄今已知的血池对比剂在血流中存在时间长得多。本发明的血池对比剂包括由含两亲化合物分子和非离子表面活性剂的三维壳层稳定的氧化铁颗粒。该两亲化合物具有一个带负电的亲水性含磷头部，联结于疏水性尾部上，它以呈胶粒状为特征。三维壳层的非离子表面活性剂使两亲化合物呈所述胶粒状，两亲物的亲水性含磷(以磷酰基为佳)的头部至少带两个负电荷。三维壳由两亲化合物分子组成，两亲化合物的负电性磷酰基头部指向氧化铁芯核，其疏水性尾部向外伸出，形成刺猬样结构。该刺猬样结构成为构成三维壳的基础，非离子表面活性剂固定于其上。当两亲化合物为单烷基或链烯基磷酸酯或甘油磷脂时，外层包括一非离子表面活性剂，其疏水基团与酯或甘油磷脂的烷基或链烯基交织或相互盘绕，进一步使结构稳定。在任一情况下，都利用了非离子表面活性剂使这些化合物胶粒化的天然能力。
较佳的甘油磷脂由取代或部分取代的多元醇的单磷酸酯组成，所述多元醇的至少另一个醇官能团被饱和或不饱和长链脂肪酸酯化，或被饱和或不饱和长链醇醚化，磷酸的另两个酸官能团可是游离的，也可与碱金属或碱土金属成盐。更具体地，甘油磷脂可为选自二肉豆蔻酰磷脂酸、二棕榈酰磷脂酸或二硬脂酰磷脂酸的脂肪酸甘油酯的单膦酸酯。
较佳的非离子表面活性剂是带有至少一种含聚氧乙烯和聚氧丙烯片段的嵌段共聚物或聚乙二醇十六烷基醚的生理学上可接受的表面活性剂。这种表面活性剂市场上可购到的有如下商标的产品Pluronic
、Poloxamer
、Poloxamine
、Synperonic
或BRIJ
。
本发明的颗粒在制备后可经灭菌、然后冷冻干燥，得到可长期贮存的灭菌粉剂。在这种情况下，将粉剂分散于生理学上可接受的液体载体中，即从冷冻干燥的粉末状制剂重新制得本发明的对比剂。所得的悬浮液即可注射。
本发明进一步涉及作为人或动物体NMR成像对比剂的颗粒的制备方法及其使用。


图1a是本发明颗粒的氧化铁刺猬样结构的横截面示意图，在颗粒周围有非离子表面活性剂形成三维壳。
图1b是本发明颗粒的氧化铁刺猬样结构三维视图的一部分。
图2是本发明氧化铁颗粒和现有技术颗粒的保留时间或“活性”(表示为曲线下面积(AUC))比较的示意图。
本发明颗粒主要由氧化铁芯核和两亲化合物与非离子表面活性剂分子构成的外层所组成。两亲化合物具有粘在氧化铁表面的带有相当强电荷的亲水部分，它可以是单烷基或环烷基或链烯基的磷酸酯或带负电荷的磷脂。此处所用的术语“环”指分子的环状部分可以是5-7元的，可以是饱和或不饱和的(芳香族的)或可含杂原子(杂环)。在任一情况，具有三维壳形状的外层均含有非离子表面活性剂，其疏水部分与酯的烷基或链烯基链交织或相互盘绕，进一步稳定了三维结构。非离子表面活性剂还必须能使磷酸单酯或磷脂胶粒化，因为只有当呈胶粒状时，这些化合物才会对氧化铁芯核显示足够的亲和力，因而可用作磁性氧化铁颗粒的稳定剂。磷酰基头和Fe3O4之间的亲和力必须是这样的，以致于在非离子表面活性剂存在和声处理下，胶粒状的磷脂或单酯形成刺猬样前体，继而成为构建三维外壳的模板，该三维外壳是通过表面活性剂的疏水片段和两亲化合物的疏水部分相互作用而构成的。然后该三维结构则提供“RES不能识别的”颗粒。因此，在本发明的血池试剂中，重要的是形成外层的两亲化合物(以甘油磷脂为佳)不形成围绕氧化铁芯核的脂质体泡囊或脂质体样薄膜，因为从磷脂分子形成了三维壳，磷脂分子的带负电的磷酰基头部指向氧化铁芯核，其疏水性尾部向外伸出，形成刺猬样前体结构。该刺猬样结构总是作为构建三维壳或层的基础，不管起始两亲化合物是单烷基或单链烯基的磷酸酯或胶粒状的甘油磷脂。在任一情况下，得到的颗粒的抗清除稳定性增加，并将显示良好的对比剂性能。应当记住的是，参与脂质体样薄膜的两亲分子是以尾对尾倒序排列的，其亲水头端向外伸出。
当使用甘油磷脂以获得围绕氧化铁颗粒的刺猬样基质，由此构建完整的三维壳时，重要的是(a)在甘油磷脂和非离子表面活性剂同时存在下使氧化铁颗粒活化，或(b)制备带有甘油磷脂的氧化铁颗粒悬浮液，使此悬浮液活化，加表面活性剂，然后可选择地重复活化步骤。活化是这样进行的将氧化铁颗粒均匀地分散或均化分散体系，这加速胶粒化和/或破坏早先形成的脂质体或薄片。可用各种方法包括搅拌来实施活化过程;但是较可取的是声波处理、微流化处理，在适度加热(30-50℃)下处理更为有利。
我们假定，稳定颗粒的三维壳是通过在氧化铁和胶粒状甘油磷脂之间形成的刺猬样基本结构而进行构建的。首先在表面活性剂的存在下经声波或微流化处理使磷脂胶粒化，然后胶粒中两亲分子的负电荷与氧化铁芯核相互作用，而它们的电中性疏水端被表面活性剂吸引。
实验证明，在三维壳的形成过程中，表面活性剂起几种作用。它使两亲分子胶粒化，它帮助芯核周围胶粒的定位和构建(促进刺猬样前体的形成)，最后将其本身固定在两亲分子的疏水片段以提供围绕颗粒的三维壳。
显然，形成如图1(a和b)所示的中间体刺猬样结构是特别重要的，因为已发现单靠非离子表面活性剂不足以保护磁性氧化铁颗粒不被RES快速摄取。我们发现，除非按本发明进行制备，单用磷脂或与非离子表面活性剂合用均不能得到实际有用的长效血池对比剂介质颗粒。因此，只有当通常存在于现有技术制剂颗粒周围的磷脂脂质体结构被破坏时，通过使用磷脂才可成功地稳定氧化铁颗粒，使其免于过早地从血流中清除。甚至在使用除磷脂外还含聚氧乙烯(POE)/聚氧丙烯(POP)表面活性剂的磁性氧化铁悬浮液时，也是如此。因此，嵌段共聚物只有当它适当地稳定化在围绕磁性氧化铁芯核的壳的外部位置时，才会如期望的那样起作用。它在悬浮液中的简单存在是不够的;即使含有用磷脂稳定化的磁性氧化铁的同样悬浮液也是如此，即若磁性颗粒先以磷脂包裹(它然后在Fe3O4表面扩展成一薄层)，然后加入表面活性剂而不活化，也是不够的。上述结论得到如下观察的支持，即只有用胶粒状磷脂形成的三维的即刺猬样的结构才能捕捉和固定足够的表面活性剂以提供稳定的RES稳秘氧化铁颗粒。
表面活性剂(图1(3)的固定可能经其疏水性聚氧丙烯(POP)片段与甘油磷脂或磷酸单酯(图1(2))的疏水部分相互作用而完成。如图1(a和b)所示，疏水部分通过范德华引力与聚氧丙烯(POP)片段固定，而亲水性的聚氧乙烯(POE)片段向外伸展到溶液中，这样可能抑制磁性氧化铁颗粒(图1(1))的调理作用和凝聚作用。
在磷酸的烷酯或链烯酯的情况下，刺猬样结构的形成基本同上，非离子表面活性剂的疏水部分与磷酸酯的烷基或链烯基链交织或相互盘绕，其亲水部分伸向溶液。
氧化铁芯核和磷酰基头部之间相互作用的精确本质尚未被确切了解。但是，我们发现，对于本发明的“隐秘”氧化铁颗粒在血中的良好耐久性，重要的是磷酰基基团上两个氧原子的负电荷都可用于与芯核相互作用。因此，当只有一个负氧部位可用时，所产生的颗粒没有同样的稳定性，较易从循环中清除。至今，这种相互作用的重要性和稳定性没有在现有技术中被认识，因而可解释为何以往制备长效磁性氧化铁血池颗粒的努力均告失败。
我们发现，当采用负电荷被中和的磷脂时，例如在用二棕榈酰磷酯酰胆碱(DPPC)或二肉豆蔻酰磷酯酰胆碱(DMPC)时，形成的相应颗粒结构防护性差，用这些化合物制成的对比剂对于肝脾造影可能是有用的，但不能作长效血池试剂，因为这样的颗粒不能被保护以免从血流中过早地被清除。这同样适用于其磷酰基头部只有一个负电荷可用于和磁性体芯核相互作用的磷脂。例如，二棕榈酰磷酯酰甘油(DPPG)、二肉豆蔻酰磷脂酰甘油(DMPG)或联十六烷基磷酸酯(DCP)是这样的两亲物，它们产生的颗粒结构不足以防止从血中被快速清除。因而这样制成的对比剂不能用作血池试剂，因为它们在血流中的保留时间相当短。另一方面，当使用其磷酰基部分两个氧原子的负电荷均可用于和芯核相互作用的磷脂时，所得到的结构极稳定，用这些化合物制得的氧化铁颗粒能很好地受保护以免从血流中被清除。这些化合物的例子有二棕榈酰磷脂酸(DPPA)和二肉豆蔻酰磷脂酸(DMPA)。
为了确保颗粒有好的稳秘特性，紧靠颗粒的化合物除了在磷酰基头端两个氧原子上负电荷都可利用外，还应有相当长的烷基或链烯基链或疏水性环烷基直接地或经亚烷基或氧桥中介，连接于磷原子上。因此，为了获得稳定的隐秘颗粒并由此得到本发明的对比剂，紧靠磁性氧化铁芯核的化合物必须是含单烷基或链烯基或环烷基的磷酸酯、单烷基膦酸酯或甘油磷脂，其烷基或链烯基链有相当强的疏水性。实验表明，只有足够长的烷基或链烯基链才能与另一两亲化合物合适地相互作用，固定足够量的非离子表面活性剂或嵌段共聚物，以产生围绕铁芯核的稳定的三维结构。有至少8个碳原子的、较好有至少10个、更好有至少12个碳原子的烷基或链烯基链是特别令人满意的。短的疏水性烷基或链烯基链或大环配位体不能提供稳定的颗粒，表明必须在中间层和表面活性剂之间有牢固的相互作用，或有足量固定的表面活性剂可供利用，才能获得满意的结果。对此特征缺乏正确评价可能是为何至今未能得到RES觉察不出的或稳秘的氧化铁颗粒作为实际有用的长效血池试剂的另一原因。在适用于本发明的一磷酸酯中，可举出C8-C18烷基或链烯基磷酸酯、胆甾烯基-磷酸酯、环己基-癸基-磷酸酯、十六烷基磷酸酯、枯基磷酸酯及类似化合物。
从而，按照本发明，如果紧靠颗粒的基层包含具有相当强烈离子化的负功能团和相当长和有效的疏水性有机链的两亲物质，与其交织或相互盘绕的另一层是由相继具有亲水性和疏水性片段的嵌段共聚物构成，例如Poloxamer
、Synperonic
或Pluronic
型表面活性剂，就能使颗粒获得有效的保护，使它不被从循环中清除。限定为单烷基或链烯基磷酸酯或膦酸酯的基层物质的作用是完全意料不到和使人惊讶的，特别是由于现有技术(见WO91/09629第17页第1段)提出，脂质体膜上带负电荷的磷脂的存在会增加所述脂质体被网状内皮系统的摄取。
我们发现，对于本发明的颗粒，单烷基磷酸酯或甘油磷脂与嵌段共聚物之间相对量应当不太悬殊，即前者与后者的重量比应在1∶100至10∶1的范围内，较佳为1∶30至5∶1，更佳为1∶10至1∶1。而且，单烷基磷酸酯与氧化铁芯核的重量比应在1∶5和100∶1之间，较佳的为20∶1和1∶1之间。一些实验资料也揭示，表面活性剂与胶粒状磷脂或磷酸单酯的比例应保持在一定限度内，因为太多的表面活性剂会使磷脂或单酯过于分散，使它们对磁性氧化铁颗粒的亲和力减小，刺猬样结构的形成受阻。同理，用太少表面活性剂制成的颗粒会凝聚，不足以防止调理作用。
现确定，从两种或两种以上化合物可制备RES不可觉察的稳定颗粒，这些化合物选自离子化和中性磷脂、磷脂的单烷基或链烯基酯和/或其它非磷脂化合物，制备方法是将氧化铁颗粒与带负电荷的两亲化合物或带负电荷的磷脂和其他非磷脂的混合物和表面活性剂一起悬浮在生理学上可接受的水相中，或在其中混合。将形成的混合物作声波处理或微流化处理以使两亲化合物胶粒化，建立刺猬样结构，并从该结构上形成围绕氧化铁颗粒的三维壳。得到的颗粒被很好地保护，不被从循环中过早地清除，并被发现作为好的血池成像剂是非常有用的。可用于本发明的稳定的磁性氧化铁颗粒的非磷脂化合物的例子为诸如胆固醇，麦角甾醇、植物甾醇、谷甾醇、羊毛甾醇、生育酚等化合物。
在声波处理或微流化处理后，可将混合物进一步灭菌和/或冷冻干燥以制备具有长贮藏寿命的干燥粉剂。
在另一种方法中，可在声波处理或微流化处理后将表面活性剂加到氧化铁和两亲化合物混合物中。但是在这种情况下，所有成分加在一起后可任选重复声波处理、微流化处理或加热步骤。
本发明的悬浮液也可从含氧化铁颗粒的粉末制剂加以制备。粉末状制剂通常是将新鲜制备的含氧化铁颗粒、磷脂和非离子表面活性剂的溶液冻干或干燥而成。在冻干或干燥前，将这些溶液灭菌。可用任何已知技术即加热、过滤、γ-射线等进行灭菌。或者，也可将用长期贮存的冻干粉末制得的悬浮液进行灭菌。
我们发现，按本发明制备的颗粒可用作人或动物体器官体内NMR成像的血池对比剂。成像是这样进行的通常将本发明所述磁性氧化铁颗粒在生理学可接受的水性载体中的悬浮液经静脉注射给与病人，并分析在NMR分析仪产生的磁场中被研究的器官邻近处水的质子自旋磁性弛豫(magnetic relaxation)(T1和T2成分)的变化。
下面的实施例进一步阐明本发明。
实施例1在40ml水中，溶解81.1mg(0.3mmol)FeCl3·6H2O和25.8mg(0.13mmol)FeCl2·4H2O(总Fe＝0.43mmol或24.01mg)。向其中加入FeCl3形式的0.1mCi59Fe(示踪物数量)。将混合物搅拌，滴加7.5%氨水溶液直至pH达到稳定值8.6。将形成的黑色颗粒悬浮液在75℃下加热5分钟，然后在室温下放置使颗粒沉淀。沉淀以100ml水用倾析法洗涤三次。洗涤后，将颗粒再在搅拌下悬浮于45ml水中，悬浮液中铁浓度为0.533mg/ml。
向10ml此种悬浮液(5.33mg Fe)中加入成分(a)100mg二棕榈酰磷酯酸-钠盐(DPPA Na)，进行20分钟声波处理(BRANSON 250 Sonifier，1/8″微探针，输出20(15-20W))。使声波处理时升至68℃的温度降到室温，加入成分(b)100mg Synperonic -F-108(ICI制)或Poloxamer -338。然后在同样条件下再继续作15分钟声波处理以确保完全分散并破坏脂质体囊，在氧化铁颗粒周围提供胶粒状磷脂层。
按本发明所述得到的颗粒悬浮液(样品1A)每ml含0.5mg铁，10mg DPPA和10mg Synperonic 表面活性剂((a)和(b)的重量比＝1∶1)。用COULTER Nanosizer计数仪测量结果表明，平均颗粒大小为120nm，多分散指数为3。
在类似条件下，但用DPPC取代部分DPPA，制得其他样品，得到以下样品(DPPC/DPPA摩尔比)1C(9∶1);1D(7.5/2.5);1E(5∶5);1F(2.5/7.5)最后，制得只含DPPC的对照样品(1B)。
＝DPPC/DPPA摩尔比另外用现有技术文献EP-A-0271091的方法制对照样品。重复该文件实施例1的步骤，制得样品1V1。先用单分子数量的棕榈酸覆盖磁性氧化铁颗粒，然后用二硬脂酰磷脂酰胆碱和胆固醇(DSPC/CHOL)2∶1混合物制成的脂质薄膜包裹。样品1V2是用一层Synperonic
F-108进一步保护1V1的结果。
各种悬浮液样品是这样作试验的注射1ml样品到Sprague-Dawley实验室大鼠的尾静脉中，然后以指定的时间间隔取出血样;用γ-计数分析血样中残留铁，结果用原始注入铁(ID)的百分数表示，计为时间的函数。通过测定注射后时间O和120分钟之间%ID-时间曲线的曲线下面积(AUC)来表示一定制剂在血中保留的特性。结果列于表1。
结果表明，缺乏DPPA的所有样品(1B、1V1、1V2)均迅速消除，相反，含DPPA的样品消除得慢得多，作用随带负电磷脂的量而变。当DPPA对总磷脂的摩尔比或重量比为1∶4或更多时，这个作用变得特别明显实用。
从表中结果还可看出，对于保护颗粒不被从循环中清除，DPPA的重量对应于芯核最好为5∶1或更多。
在上述实验中，如果一钠盐形式的DPPA被游离酸或被其他水溶性盐(从其它金属得到)取代，也得到类似的结果。此外，如果DPPA被其他磷脂酸如二硬脂酰一、二肉豆蔻酰一、二月桂酰-类似物及更高级同亲物(C20-26酸)取代，结果并无明显不同。还应注意到，在缺乏成分(b)时，单有成分(a)，磁性氧化铁颗粒仍得到一定程度的保护。但是，对于用于诊断目的的颗粒，这保护是不足的，如上面表1A的结果所示。除略去Synperonic外，样品1D2、1E2和1F2分别与相应的样品1D、1E和1F相同。表1A所给的结果表示为在以分钟计的不同时间后保留的原始铁剂量的百分数。
表2中结果(得自与表1所报告同样进行的实验)显示，当DPPA(成分(a))被在磷酸酯基团上只有一个离子功能团的类似化合物即二棕榈酰磷酯酰甘油(DPPG)取代时(样品1G)，所得到的层实际上无保护作用。甚至当加Synperonic
时(样品1H)，也是如此。作为对照(样品1J)，表2也提供了用葡聚糖包裹的磁性氧化铁样品(按Advanced Magnetics，Inc的EP-A-0274 285制备的AMI-25)得到的结果。
实施例2在实施例1所述条件下进行的实验和图2及表3所给出的说明进一步支持了实施例1结果讨论中所报告的现象观察。b)、c)、d)和f)组的代表性样品分别是按EP-A-0272091和EP-A-0274285的方法制备的，而其他样品都是按实施例1中所描述的本发明的方法制备。结果清楚地证明，只用非离子表面活性剂制得的磁性氧化铁颗粒(a组)只能在循环中停留短时间。有或无非离子表面活性剂的DSPC/胆固醇脂质体囊的使用并不改善血池试剂的特性(b组)。各种磷脂被称作制备稳定的氧化铁颗粒的有用材料。但是，事实上如果采用负电荷被中和的磷脂如二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)或二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC)的情况下(C组)，所形成的相应结构受保护差，制成的对比剂对肝、脾或骨髓成像可能是有用的，但不能作为长效血池试剂。对于其磷酰基头部只有一个负电荷可用来与磁性氧化铁芯核相互作用的磷脂而言，结果几乎相同。例如，二棕榈酰磷脂酰甘油(DPPG)、二肉豆蔻酰磷脂酰甘油(DMPG)或联十六烷基磷酸酯(DCP)就是这样的磷脂，它们制成的结构不足以防止从血中被快速清除(d组)。进一步确定，在无非离子表面活性剂存在时，即使采用其磷酰部分上两个氧原子的负电荷均可用来与芯核相互作用的磷脂，所得到的结构仍然不能用作本发明的长效血池试剂。这表明，即使使用二棕榈酰磷脂酸(DPPA)或二肉豆蔻酰磷脂酸(DMPA)，除非它们呈胶粒状，所制成的氧化铁颗粒也不能很好地防止从血流中被清除(e组)。
但是，令人惊讶地发现，用葡聚糖比用现有技术的磷脂制剂能更好地达到对磁性氧化铁的保护(f组)。即使当这些典型的脂质体制剂含非离子表面活性剂时也是如此。葡聚糖包裹的磁性氧化铁颗粒通常用作为肝脾成像特殊设计的对比剂，并为从血流中快速清除而设计。
当使用其磷酰部分上两个氧原子的负电荷均可用来与芯核相互作用的磷脂时，如果磷脂是胶粒状的，则所得磁性氧化铁颗粒在血循环中极其稳定。因此，使用本发明的方法，用诸如胶粒状二棕榈酰磷脂酸(DPPA)和Synperonic
F108制得的氧化铁颗粒会受到很好的保护，不被从血流中清除。当DPPA被DMPA、DSPA或鲸蜡醇磷酸酯或被卵磷脂和磷脂酸混合物取代时(g组)，结果也相同。
表 3
<p><
>图表说明表面活性剂Pluronic＝Poloxamer 338＝Synperonic F108＝具有(氧乙烯)n-(氧丙烯)m-(氧乙烯)n共聚物序列的嵌段共聚物磷脂酸类DLPA＝1，2-二月硅酰-甘油基-3-磷脂酸(饱和脂肪酸C12)DMPA＝1，2-二肉豆蔻酰-甘油基-3-磷脂酸(饱和脂肪酸C14)
DPPA＝1，2-二棕榈酰-甘油基-3-磷脂酸(饱和脂肪酸C16)DSPA＝1，2-二硬脂酰-甘油基-3-磷脂酸(饱和脂肪酸C18)SPA-3＝1，2-二烷酰基-甘油基-3-磷脂酸(从大豆中加氢得到;脂肪酸C16和C18混合物)胆碱磷酸(卵磷脂)类DMPC＝1，2-二肉豆蔻酰-甘油基-3-胆碱磷酸DPPC＝1，2-二棕榈酰-甘油基-3-胆碱磷酸DSPC＝1，2-二硬脂酰-甘油基-3-胆碱磷酸DAPC＝1，2-二花生酰-甘油基-3-胆碱磷酸P90H＝1，2-二烷酰基-甘油基-3-胆碱磷酸-加氢大豆卵磷脂(脂肪酸C16和C18混合物＝同DPPC)磷酸甘油类DMPG＝1，2-二肉豆蔻酰-甘油基-3-磷酸甘油DPPG＝1，2-二棕榈酰-甘油基-3-磷酸甘油其他CHOL＝胆固醇CETYL PHOSPHATE＝鲸蜡醇(C16)的磷酸单酯TWEEN＝多乙氧基醚＝聚氧乙烯脱水山梨糖醇脂肪酸酯BRIJ＝聚乙二醇十六烷基醚MAG(V)＝按EP-A-0272091制备的有脂质体的磁性氧化铁AMI25＝按EP-A-0275285制备的葡聚糖包裹的磁性氧化铁DPPC/DPPA2＝DPPC与DPPA重量比为7.5/2.5DPPC/DPPA3＝DPPC与DPPA重量比为5.0/5.0DPPC/DPPA4＝DPPC与DPPA重量比为2.5/7.5
在结果分析中明显地看到，血流中物质的稳定性可用一种模型加以合理的说明，在这种模型中，在起始阶段，带有足够长疏水链的磷脂的磷酰基头部与磁性氧化铁芯核相互作用，形成刺猬样结构，该结构为非离子表面活性剂提供固定层，从而构建成围绕芯核的三维层。不同的实验还证明，使用不同来源的表面活性剂对最终结果只有次要影响。
所假设的这种模型被以下发现进一步支持，即磷脂与非离子表面活性剂的比例虽然不很严格，但应维持在0.01-10之间，以0.1-1为佳，如表4所示，实验证明，对于恒定的氧化铁浓度，用过量非离子表面活性剂(与DPPA的数量比较)制备的磁性氧化铁颗粒不足以防止它被从血中快速清除。
另一方面，实验也表明，在同样条件下但表面活性剂用量低得多而制备的颗粒显示同样差的防护过早被清除的作用。在这些结果后面的基本原理表明，表面活性剂太多会使磷脂或单酯过于分散，使其对磁性颗粒的亲和力受损，同时破坏了形成刺猬样结构的适当条件。同理，用太少表面活性剂制备的颗粒易凝聚，不能防止从血液中快速清除。
权利要求
1.用于患病的人或动物NMR成像的颗粒，包括氧化铁芯核和由至少一种具有结合于疏水性尾部的带负电荷含磷头部的两亲化合物及一种或一种以上表面活性剂组成的外层，其特征在于两亲化合物是胶粒状的，该层是三维壳形态的，包括至少一种表面活性剂，它使两亲化合物呈胶粒状。
2.按权利要求1所述的颗粒，其中两亲化合物分子是相对于氧化铁芯核排列的，以使两亲化合物的含磷头部指向氧化铁芯核，而疏水性尾部向外伸出，形成刺猬样结构。
3.按权利要求1或2所述的颗粒，其中头部是磷酰基头部，其上两个氧原子的负电荷均用于和芯核相互作用。
4.按权利要求3所述的颗粒，其中两亲化合物是磷酸的烷基，链烯基或环烷基单酯或磷酯。
5.按权利要求4所述的颗粒，其中烷基或链烯基包括至少8个碳原子，较佳地为至少10个碳原子，更佳地为至少12个碳原子。
6.按权利要求4所述的颗粒，其中胶粒状的磷脂由取代或部分取代的多元醇的单磷酸酯组成，所述多元醇的其他醇官能团至少有一个被一饱和或不饱和长链脂肪酸酯化或被一饱和或不饱和长链醇醚化，磷酸的其他两个酸官能团可以是游离的也可以与碱金属或碱土金属成盐。
7.按权利要求1、2或3所述的颗粒，其中两亲化合物是选自二肉豆蔻酰磷脂酸、二棕榈酰磷酯酸或二硬脂酰磷脂酸的脂肪酸甘油酯的单磷酸酯。
8.按权利要求1、2或3所述的颗粒，其中表面活性剂是与两亲化合物交织在一起的生理学上可接受的非离子表面活性剂。
9.按权利要求8所述的颗粒，其中非离子表面活性剂包括至少一种具有聚氧乙烯片段和聚氧丙烯片段的嵌段共聚物或聚乙二醇烷基醚。
10.按权利要求9所述的颗粒，其中表面活性剂为Pluronic 、Poloxamer 、Poloxamine 、Syneronic 或BRIJ 。
11.按权利要求1、2或3所述的颗粒，其中两亲化合物为选自离子或中性磷脂、磷酸的单烷基或链烯基酯和/或胆固醇，麦角甾醇、谷甾醇、羊毛甾醇和生育酚的两种或两种以上化合物的混合物。
12.按权利要求1、2或3所述的颗粒，其中磷脂与表面活性剂的重量比为1∶10至10∶1。
13.按权利要求1、2或3所述的颗粒，其中两亲化合物和外层表面活性剂的重量与芯核的重量之比为小于1∶1。
14.权利要求1-13的氧化铁颗粒在人或动物体器官NMR成像上的应用。
15.含权利要求1-13所述的任一种氧化铁颗粒的粉状制剂，该制剂分散在生理学上可接受的液态载体中时会形成用作NMR成像对比剂的悬浮液。
16.含权利要求1-13所述的任一种氧化铁颗粒的可注射水悬浮液，该悬浮液悬浮在生理学上可接受的液态载体中，用作人或动物体NMR成像的对比剂。
17.制备权利要求1所述的颗粒的方法，其特征在于包括以下步骤a)选择氧化铁颗粒，将氧化铁颗粒与两亲化合物及表面活性剂悬浮在水相中，形成混合物，b)用声波处理，微流化处理或加热使混合物活化，产生围绕氧化铁颗粒的三维壳状层。
18.按权利要求17所述的方法，其中在作声波处理、微流化或加热后，将混合物灭菌和/或冷冻干燥。
19.按权利要求17或18所述的方法，其中在所述活化后将表面活性剂加到氧化铁和二亲化合物的混合物中，并可任选地重复声波处理、微流化处理或加热。
20.按权利要求17或18所述的方法，其中表面活性剂是包括至少一种具有聚氧乙烯片段和聚氧丙烯片段的嵌段共聚物或聚乙二醇烷基醚的生理学上可接受的非离子表面活性剂。
21.按权利要求17或18所述的方法，其中两亲化合物是被表面活性剂转变成胶粒状的磷脂。
22.按权利要求21所述的方法，其中胶粒状磷脂包括取代或部分取代的多元醇的有机单磷酸酯;所述多元醇的至少另一个醇官能团被饱和或不饱和的长链脂肪酸酯化，或被饱和或不饱和的长链醇醚化，磷酸的另两个酸官能团可为游离的或与碱金属或碱土金属成盐。
23.按权利要求22所述的方法，其中磷脂为选自二肉豆蔻酰磷脂酸、二棕榈磷脂酸或二硬脂酰磷脂酸的脂肪酸甘油酯的单磷酸酯。
全文摘要
抗凝集和抗肝脾RES摄取的作用增强的适于注入患者血流的磁性氧化铁颗粒，包括氧化铁芯核和围绕芯核的磷酸单烷基或链烯基酯或甘油磷脂/表面活性剂三维壳。芯核和单酯或胶粒状甘油磷脂形成刺猬样结构，再与非离子表面活性剂交织或互相盘绕形成保护性的三维壳。该颗粒在血循环中能长期存在，是极好的长效血池试剂。
文档编号A61K49/00GK1089470SQ9311650
公开日1994年7月20日 申请日期1993年8月12日 优先权日1992年8月13日
发明者H·图尼耶, R·亚森特, M·施奈德 申请人:辛苔蒂加股份有限公司