专利名称：制备用于眼外伤时封闭角膜及巩膜伤口的植入物的方法
技术领域：
本发明属于眼科学领域，确切地说属于获得网状生物高聚物的方法，属眼外伤情况下用这种生物高聚物制作的用来封闭角膜和巩膜伤口的植入物，以及获取它的方法。
按照所提供的方法获得的网状生物高聚物，广泛用于生产各种形式的眼科手术用的隐形眼镜、覆盖层和植入物以及各种病因的角膜营养性疾患的非手术治疗。所提供的这种植入物，应用于治疗眼睛巩膜及角膜的外伤性疾患。
对于眼科学领域而言，目前已研制出一系列以胶原蛋白——天然蛋白质为基质的、能与眼睛组织生物学相容且具有低抗原的生物高聚物。为制做这种生物高聚物，曾对胶原蛋白的辐射稳定性进行过仔细研究，从而确定辐照的影响取决于辐照的剂量及其作用条件。当胶原蛋白溶液受到辐照时，既可发生胶原蛋白微纤维的缝合过程，又可发生退化过程。这要取决于胶原蛋白的浓度以及所用缝合促进剂的特性。已知一种胶原蛋白凝胶是用剂量为33千戈瑞的电离辐射对胶原蛋白辐照而得。由电泳图象的改变，以及在酸中溶解度的下降证明在辐照的影响下，胶原蛋白凝胶中已形成新的结构键。还曾发现，对于蛋白水解发作的素质有所提高，即可对这些胶原蛋白凝胶形成的伤口之愈合产生有利的影响。但是，这种方法不可能用来制做诸如Problemytechnikiwmedycynie，t，Ⅻ，№3，1981，Bartelik，WplywsterylizacjiradiacyjuesnaniektoreWlasciwoscifizykochemicznezelukolagenowego所说的具有给定机械强度和膨胀程度，以及发酵稳定性的任意立体形状的移植物，因为当空气中存在氧时，在这种辐照剂量下会发生胶原蛋白微纤维的解体过程。
已知一种制做眼科用胶原蛋白覆盖层的方法(参见SU，A，1321420)，它的实质是将农业牲畜眼睛的巩膜做碱——盐处理，把所得到的生物组织用有机酸水溶液(如醋酸水溶液)使之均质化以形成胶原蛋白溶液，针对缓冲液进行渗析，使胶原蛋白溶液除去低分子掺杂物，从而将胶原蛋白的溶液的PH值调整到4.5～7.5，并将得到的胶原蛋白溶液进行干燥，与此同时就用这种胶原蛋白溶液模制成能够重复出人眼睛的前面一块的曲率的球面覆盖层。
所得到的这种胶原蛋白覆盖层的特点在于，其机械强度差，膨胀度低，容易被吸收。按照这种方法无法制做任意立体形状的植入物，因为要模制这样形状的植入物只能用干燥的方法。
作为本发明的基础所提出的任务是，要拟定一种制取眼科用网状生物高聚物的方法，即通过在专门选择的条件下，用电离辐射辐照胶原蛋白溶液，以保证所得到的生物高聚物具有足够的机械强度，很高的膨胀度和发酵稳定性;而且还要用这种生物高聚物制得眼睛外伤时用来封闭角膜和巩膜伤口用的植入物，以及通过优选工艺过程来制取这种植入物的方法。在保持上述植入物的生物高聚物具有最佳性能的前提下，这种方法能保证该植入物具有给定的形状和规格，以对伤口作完全封闭。
上述任务是这样解决的。所提出的以胶原蛋白为基质制取眼科用网状生物高聚物的方法，是通过将牲畜眼睛的巩膜进行碱——盐处理，把得到的生物组织用有机酸的水溶液使之均质化，以形成胶原蛋白溶液，随后从中除去低分子掺杂物。按照本发明，将清除过掺杂物的胶原蛋白溶液用一氧化二氮使其饱和，并将其浓度调整到不高于80(质量)%，之后将所得到的胶原蛋白溶液用剂量为0.5～15千戈瑞的电离辐射进行辐照，直至形成网状生物高聚物。
由予先选好的辐照剂量、胶原蛋白溶液浓度，一氧化二氮作为缝合促进剂，可保证所得到的网状生物高聚物在胶原蛋白的整个体积范围内的缝合均匀性。缝合均匀性及缝合可调整度能够保持生物高聚物的延展性，使其机械强度和膨胀度增高两倍，同时也使发酵稳定性增加。由于该生物高聚物中不存在有害掺杂物，而且又是胶原蛋白基质，因而就能保证它与人眼组织具有良好的生物相容性。
为提高网状生物高聚物的质量，以避免其中形成空洞结构，建议在辐照前用离心方法对胶原蛋白溶液进行部分地除气，转速为3～40×103转/分，时间持续10～30分钟。
所提出的眼睛外伤时用来封闭角膜及巩膜伤口用的植入物，根据本发明是以胶原蛋白为基质由网状生物高聚物制做的。由于这种植入物的生物高聚物具有很高的膨胀度，同时又可调节，还有足够的强度，故可以保证完全封闭眼睛外伤时的伤口，而不必采用会使眼睛受到损伤的工具。
为了解决前面提出来的任务，同时提出一种制取上述植入物的方法，它包括对牲畜眼睛巩膜做碱——盐处理，把得到的生物组织用有机酸水溶液使之均质化，以形成胶原蛋白溶液，随之从中除去低分子掺杂物。按照本发明，将清除过掺杂物的胶原蛋白溶液的浓度调整到0.2～1.3(质量)%，用一氧化二氮使其饱和，然后将其装进模子里并用剂量为0.5～15千戈瑞的电离辐射照射，将这种以胶原蛋白为基质的由网状生物高聚物作成的当作植入物用的毛坯用水透析24～48小时，将其干燥至网状生物高聚物中的水气含量为30～50(质量)%，尔后使毛坯具有植入物的形状及规格，借以在眼睛外伤时对角膜及巩膜伤口完全封闭。
以上的方法保证了植入物中生物高聚物的特性参数能加以调节，同时也可保证植入物的形状及规格，而这就是植入物使用时的必要条件。
为了优化植入物的性能参数，将胶原蛋白溶液放入模子以前，最好依次采用冷冻并在20～25℃温度下化冻和离心(转速为1～2×103转/分，持续时间10～60分钟)的方法将其进行部分地除气。
为了便于将植入物放在眼睛的伤口处，最好使它具有圆柱形，尖端长为3～5毫米，底径为0.5～4.0毫米。
以胶原蛋白为基质获得网状生物高聚物的方法，按照本发明是依以下方式实现的。
将农业牲畜的眼睛巩膜进行碱——盐处理。把牲畜眼睛巩膜仔细地除去眼睛内膜、剩余的结膜和肌肉，将基质分出来并将其切成小块。将生物组织的称样在蒸馏水中清洗，直至完全去除机械杂质和血液，再将其移入烧瓶并将10%的苛性钠溶液注入饱和的硫酸钠溶液中(按每10克生物组织500毫升计算)，在18～20℃下放置48小时。将溶液倒出并使生物组织中和到PH值为6.0～7.0，使其与2%的硼酸溶液混合，不断更新溶液。用蒸馏水清洗生物组织，直到从清洗液中完全除去硫酸钠离子。把所得到的生物组织放入有机酸(如醋酸、柠檬酸、抗坏血酸)的肌肉注射(IM)液中，使其均质化，估计量须使溶液中蛋白质的浓度为1(质量)%。搅拌上述物质并置入低温冰箱1～3昼夜。使均质物质离心并低温静置若干昼夜。对所得到的胶原蛋白溶液进行过滤。为除去低分子掺杂物，需要把胶原蛋白的醋酸溶液用醋酸稀释，直到蛋白质的浓度为0.7～0.8(质量)%，并在18～20℃温度下针对磷酸或柠檬酸盐缓冲剂进行透析，调整PH值到4.5～7.5。
把胶原蛋白溶液装入烧杯并放进真空室中，以便除去随后可成为辐照过程抑制剂的空气中的氧，尔后进行离心。用化学纯的一氧化二氮使所得到的胶原蛋白溶液饱和，而一氧化二氮就是不会氧化的胶原蛋白缝合促进剂。然后将此溶液调整到浓度不高于80(质量)%，而这便是极限浓度，因为接下去得到的网状生物高聚物在膨胀之后会变得疏松。为了提高网状生物高聚物的质量，即为了避免其中形成空洞以及使机械强度降低，建议采用离心的方法进行部分地除气，转速为3～40×103转/分，持续时间10～30分钟。在这种工作状态下，能保障全部除去过量的一氧化二氮，以与胶原蛋白溶液的浓度相适应。在室温下以0.5～15千戈瑞剂量的电离辐射辐照胶原蛋白溶液，直至形成网状生物高聚物。当辐照剂量低于0.5千戈瑞时，得到的生物高聚物具有很低的机械强度及发酵稳定性;当辐照剂量超过15千戈瑞时，得到的生物高聚物将失去延展性而变得很脆。使所得到的网状生物高聚物在蒸馏水中透析1～3昼夜，以便除掉醋酸。清洗用水的PH值应低于6.3。将清洗过的网状生物高聚物放入蒸馏水，进行封闭及消毒。
按照本发明，由网状生物高聚物制取眼外伤时封闭角膜及巩膜伤口用的植入物的方法是按下述方式实现的。
如上所述，要对农业牲畜眼睛的巩膜进行碱——盐处理，用有机酸水溶液使所得到的生物组织均质化，从所形成的胶原蛋白溶液中除去低分子掺杂物。将制得的胶原蛋白溶液稀释或浓缩，从而调整浓度到0.2～1.3(质量)%，以便保证随后构成植入物的生物高聚物具有最佳的机械强度和快速膨胀特性及良好的延展性。把胶原蛋白溶液移入烧杯，进行真空及离心处理，以便最大限度地除去空气中的氧。将化学纯的一氧化二氮于不断搅拌中喷进所得到的溶液中，直到它对一氧化二氮完全饱和。为对胶原蛋白溶液进行部分地除气，最好将它在冰箱中冷冻，再在20～25℃的室温下缓慢解冻，之后再以1～2×103转/分的速度离心作用10～60分钟。在这样一些条件下，可保障完全除掉在植入物的网状生物高聚物结构中可能形成的空洞中的过量一氧化二氮。然后把胶原蛋白溶液装入模子并用0.5～15千戈瑞的电离辐射照射。将所形成的以胶原蛋白为基质的网状生物高聚物构成的毛坯在蒸馏水中透析24～48小时，使PH值达到6.5～7.0。再将所形成的毛坯干燥，直到上述生物高聚物中的水气含量为30～50(质量)%。这样就能保证植入物用于封闭眼睛的伤口时，其膨胀度为7～10倍。将干燥过的毛坯在液氮中迅速冷冻并冷冻干燥48小时，然后使刚性毛坯具有植入物的形状及规格，以便保证能完全封闭角膜及巩膜伤口。最好使植入物具有圆柱形，尖端长为3～5毫米，底径为0.5～4.0毫米。之所以选择这种形状，是为了保证把植入物送入眼睛手术切口时最方便;长度的选择是为了外科医生工作的方便;底径的选择是为了保持在将其固定到伤口时，伤口的边缘与圆柱表面必要的接触程度。
以下援引了实施本发明的一些具体实例。
例1将1公升含10%苛性钠的饱和硫酸钠溶液倒入数量为20克的由牲畜眼睛切下并清洗过的基质中，在18～20℃温度下静置48小时。将溶液倒出，用必要量的蒸馏水清洗生物组织，倒进2%的硼酸溶液1公升并搅拌2小时，更换硼酸溶液两次。在不停地搅拌的情况下，在5公升体积的蒸馏水中仔细地清洗该生物组织，直到从清洗液中完全除掉硫酸钠离子为止。把所得到的250毫升量含水的生物组织中添加350毫升0.5(重量)克分子浓度的醋酸，使之均质化。对其浆液进行搅拌并在4℃温度下静置若干昼夜。在2×103转/分速度下将此均匀浆液离心30分钟，并在4℃温度下静置3昼夜。让所得到的胶原蛋白溶液通过玻璃过滤器过滤。此溶液中蛋白质浓度为1(质量)%。为了取出低分子掺杂物，要用0.5(重量)克分子浓度的醋酸溶液将此胶原蛋白的醋酸溶液稀释到蛋白质浓度为0.8(质量)%，并在18～20℃的温度下对0.2(重量)克分子浓度的柠檬酸盐缓冲液透析到PH值为4.5。在室温下使该胶原蛋白溶液抽取真空至出现气泡。并在2×103转/分的速度下离心30分钟。然后将所得的溶液倒入烧杯，通过将化学纯的一氧化二氮气体(消耗量为5毫升/秒)向20毫升溶液中喷露20分钟的办法，使该溶液饱和。饱和之后通过离心方法(转速为3×103转/分)使胶原蛋白溶液部分地除气。再重复一次饱和及离心作用过程。将胶原蛋白溶液冷冻干燥到1(质量)%的浓度，并用1千戈瑞剂量的电离辐射进行辐照。把所获得的胶原蛋白基质的网状生物高聚物从烧杯中取出，并在蒸馏水中透析1昼夜，直至透出的水PH值为6.4止。再将网状生物高聚物放在盛有蒸馏水的长颈小瓶中，并将其密封。把长颈小瓶放在-196℃的液氮中，并用剂量为30千戈瑞的γ射线照射。将长颈小瓶放入盛有80℃水的容器中6～7秒钟，以使该网状生物高聚物化冻。按照上述方法加工出来的网状生物高聚物，其特点是无菌、具有良好的机械强度和发酵稳定性。
例2将按照例1所述经一氧化二氮饱和所得的胶原蛋白溶液浓缩。为此，往其中添加6克干的胶原蛋白膜，按20毫升的0.8(质量)%的胶原蛋白溶液计算，并在氮气氛中通过搅拌使其均质化，以便获得30%的胶原蛋白溶液。再将此溶液在2×103转/分的转速下离心20分钟，然后倒入烧杯，用10千戈瑞剂量的电离辐射进行照射。将得到的胶原蛋白基质的网状生物高聚物放进盛有10%福尔马林水溶液的杯中，置2小时。这可提高生物高聚物的憎水性。将上述生物高聚物在蒸馏水中透析2昼夜，直到透出水的PH值为6.7止。随后，如例1所述将其消毒，例外的是γ-射线照射的剂量为15千戈瑞。所制得的胶原蛋白基质网状生物高聚物是无菌的，具有良好的机械强度和发酵稳定性。
例3将按照例1所述经一氧化二氮饱和所得到的胶原蛋白溶液浓缩。为此，将浸入处于一氧化二氮气氛中的SefadexG-10中模子里的胶原蛋白溶液进行干燥处理。根据模子的一半里面的胶原蛋白溶液的重量变化实现对干燥处理的控制，它的出发点在于使溶液重量每减少百分之一就再补充一份进去。重复这种操作过程，直到整个模子都被80%的胶原蛋白溶液充满。然后把装有溶液的模子移到离心容器上进行离心;转速为40×103转/分。盖住模子的第二半，并用15千戈瑞的γ-射线进行照射。将得到的胶原蛋白基质的网状生物高聚物在蒸馏水中透析3昼夜，直到透出水的PH值为6.8止。对此生物高聚物进行消毒，是按照例1那样实现的，例外的是对它的照射用的是30千戈瑞剂量的γ-射线。这样加工出来的网状生物高聚物是无菌的，具有很好的机械强度和发酵稳定性。
例4将1公升含10%苛性钠的饱和硫酸钠溶液倒入数量为20克的，由农业牲畜眼睛切下并清洗过的巩膜基质中，在19～20℃温度下静置48小时。将溶液倒出，倒入1公升2%的硼酸溶液并搅拌2小时，更换硼酸溶液两次。在不停搅拌的情况下，在5公升体积的蒸馏水中仔细地清洗该生物组织，直到从清洗液中完全除掉硫酸钠离子为止。将所得到的250毫升量含水的生物组织中添加0.5(重量)克分子浓度的醋酸使之均质化，对其进行搅拌并在4℃温度下静置1昼夜。在2×103转/分的转速下将此均匀的浆液离心，并在4℃温度下静置3昼夜。让所得到的胶原蛋白溶液经玻璃过滤器过滤，所含的胶原蛋白浓度为1(质量)%。将此溶液用0.5(重量)克分子浓度的醋酸稀释到浓度为0.8(质量)%，并在18～20℃温度下对0.5(重量)克分子浓度的柠檬酸盐缓冲液透析到PH值为7.0。以四倍的0.25(重量)克分子浓度的醋酸将0.8(质量)%的胶原蛋白溶液稀释到0.2(质量)%的浓度，在室温下使胶原蛋白溶液抽真空至出现气泡，并在1×103转/分的转速下离心60分钟。用化学纯的一氧化二氮使所得到的胶原蛋白溶液完全饱和，而为了除去不溶性气体，要在1×103转/分的转速下离心60分钟。通过把该溶液放入冰箱1昼夜使其冷冻，然后在室温下化冻，再在1×103转/分的转速下离心。借助超静力学泵(перестатический насос)将所得到的胶原蛋白溶液送入直径0.5毫米的毛细管，并在室温下以15千戈瑞剂量的电离辐射进行照射。将所得到的圆柱形胶原蛋白基质的网状生物高聚物在室温下透析24小时，直到透出水的PH值为6.4止。然后将圆柱形毛坯挂在无尘的柜橱内，在室温下使其干燥到此生物高聚物的含水量为30(质量)%。使该毛坯在液氮中迅速地冷冻，并进行亲液性脱水。干燥处理7个小时。从所加工出来的毛坯中，用刀片切成带有3毫米长尖端的圆柱体。把这里得到的封闭角膜及巩膜伤口用的植入物装入密封的长颈小瓶，并用25千戈瑞剂量的γ-射线进行灭菌。这种植入物的网状生物高聚物是无菌的，具有良好的机械强度和发酵稳定性，而且是光学透明的。
例5按例4所述制备0.8(质量)%的胶原蛋白溶液。随后在12×103转/分的转速下将此胶原蛋白溶液离心30分钟，并用一氧化二氮使其饱和，尔后再用2×103转/分的转速使其离心。为了对这个胶原蛋白溶液部分地除气，将它放在冰箱中冷冻若干昼夜，并在室温下化冻，然后在2×103转/分的转速下离心30分钟。把所得到的溶液倒入直径4毫米的圆柱形模子里，并以5千戈瑞剂量的电离辐射进行照射。将此胶原蛋白基质的网状生物高聚物毛坯放在蒸馏水中(透析)48小时，并且要换水，一直到透出水的PH值相应为6.8时为止。将毛坯以其一端悬挂在无尘的柜橱中，并在室温下使其干燥至生物高聚物中的水份含量为50(质量)%。将毛坯放在液氮中冷冻，并进行亲液性脱水7个小时。由此毛坯中切出尖端长度为4毫米的圆柱体。把这样得到的封闭角膜及巩膜伤口用的植入物装入密封的长颈小瓶，并用25千戈瑞剂量的γ-射线进行灭菌。最后得到的植入物的网状生物高聚物是无菌的，具有良好的机械强度和发酵稳定性。
例6按照例4所述制备0.8(质量)%的胶原蛋白溶液。在AMICON过滤器XM50设备上实现该溶液的浓缩。根据该设备的容器里的溶液高度的下降监控其浓缩。将得到的1.3(质量)%的胶原蛋白溶液抽真空至出现气泡，再以2×103转/分的转速离心30分钟。将此胶原蛋白溶液在冰箱中缓慢冷冻1昼夜并在室温下化冻，再以2×103转/分的转速再离心30分钟。把所形成的溶液倒入直径2毫米的圆柱形模子里，并以0.5千戈瑞剂量的电离辐射进行照射。将圆柱形毛坯模子里得到的网状生物高聚物在蒸馏水中透析48小时，直至透出的水PH值为6.8止。将毛坯以其一端悬挂在无尘的干燥用柜橱里，并在室温下使其浓缩，达到生物高聚物中的水份含量为50(质量)%。将毛坯在液氮中冷冻，并进行8小时的亲液性脱水。将毛坯切成带有5毫米长尖端的圆柱形。将得到的封闭角膜及巩膜伤口用的植入物装入密封的长颈小瓶，并以30千戈瑞剂量的γ-射线进行灭菌。最后得到的植入物的生物高聚物是无菌的，具有良好的机械强度和发酵稳定性。
权利要求
1.一种制备用于眼外伤时封闭角膜及巩膜伤口的植入物的方法，包括对牲畜眼睛巩膜进行碱--盐处理，再用有机酸水溶液使得到的生物组织均质化，以形成胶原蛋白溶液，随后从中取去低分子掺杂物，其特征在于将清除过掺杂物的胶原蛋白溶液浓度调整到0.2-1.3(质量)%，以一氧化二氮使其饱和，然后将其装在模子里用0.5-15千瑞剂量的电离辐射照射，将所形成的胶原蛋白基质网状生物高聚物的植入物毛坯用水透析24-48小时，再将其干燥至网状生物高聚物中的水份含量为30-50(质量)%，最后再使毛坯具有植入物的形状的规格，以保证眼外伤时能完全封闭角膜及巩膜伤口。
2.按权利要求1所述的方法，其特征在于将胶原蛋白溶液放入模子之前，要按顺序使其冷冻、在20-25℃温度下化冻和以1-2×103转/分的转速离心10-60分钟，以对其进行部分地除气。
3.按权利要求2所述的方法，其特征在于该植入物具有圆柱形，尖端长3-5毫米，底径为0.5-4.0毫米。
全文摘要
本发明所述方法在于，将清除过低分子掺杂物的胶原蛋白溶液用一氧化二氮使其饱和，调整其浓度到80(质量)％以下，并以0.5～15千戈瑞剂量的电离辐射进行照射。眼外伤时用于封闭角膜及巩膜伤口的植入物，是由这种生物高聚物制做的，具有一定的形状和规格，以保证能完全封闭这些伤口。其制取方法在于，将装在模子里的浓度为0.2～1.3(质量)％的一氧化二氮饱和过的胶原蛋白溶液，用0.5～15千戈瑞的电离辐射进行照射。将网状生物高聚物的毛坯干燥至含水量30～50(质量)％，再使其具有植入物的形状和规格。
文档编号A61L27/00GK1098944SQ9410488
公开日1995年2月22日 申请日期1994年5月5日 优先权日1994年5月5日
发明者斯威阿托斯拉夫·尼可拉维奇·费道罗夫, 塞尔盖·尼可拉维奇·巴格罗夫, 符拉狄斯拉夫·伊凡洛维奇·特洛费莫夫, 塔吉安娜·斯捷潘诺夫娜·安姆斯季斯拉夫斯卡娅, 亚历克塞·瓦伦季诺维奇·奥西波夫 申请人:梦兹诺特拉斯列夫科技联合体“眼科显微技术”