专利名称：投用生物制剂的方法及该方法和其他方法所用微粒组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及给鸟类投用生物制剂，特别是在孵化前向卵或蛋(egg)内投用这些制剂的方法。本发明还涉及在实践上述方法和在给动物输送这些材料之方法中适用的微颗粒组合物，以及制备这些组合物的方法。
若干时间以来就已认识到向卵内注射的可行性。最初，注射卵的目的是使用卵作为制备疫苗的生长培养基，然后从卵中收获疫苗并按需要使用。卵内注射也已用于毒理学研究。最近，注射卵的一个目的是对最终将从卵中孵出鸟达到某些有益的或治疗的作用。给卵注射而不是给活鸟注射的一个优点是更容易注射。与新生的或较老的鸟相比，卵可以被固定住并可以很有效地操作。再者，注射卵除了机械上易于操作外，接种或处理胚胎而不是活鸟似乎还有某些治疗优点。这些优点在家禽如鸡和火鸡饲养业中已变得尤为重要。
基于上文已描述的或其他目的而注射卵的可行性，已尝试了几种基本技术。总的来说这些技术包括使用某种加压系统推动液体通过卵壳，或者用物理方法在卵壳中造成一个开口，然后加入所需的液体。为此目的，使用某种类型的针头排布进行注射已是在卵上物理造成开口的基本技术之一。
在过去，已采用向卵的气泡(aircell)内注入所需液体，或直接注入卵黄囊束或羊水中的方法投用。输送到气泡中的液体简单地通过卵的内膜深入到血管附近。这种方法具有不需要使装置通过内膜的优点，但需要无菌操作和装置。输送到羊水中还可能造成危险，即注射器，通常是针头，可能会损伤甚至破坏活的胚胎。
向发育的胚胎内投用制剂的其他潜在问题与其发育阶段有关。某些制剂最适于在特定的发育阶段输入。然而胚胎可能是以不同的速度发育的。因此，对于一个卵来说可能较好在发育的第17天给药，而对于其他卵则可能是在第16或18天。但当处理很大数目的卵时，实践中不可能对每一单个卵进行监测。另外，有些制剂可能期望定期投用即需要定期重复投用。
因此需要有一种针对上述各种问题的向卵内投用生物制剂的方法。例如，该方法应操作简单并且不需要无菌技术。另外，所用技术较好能避免胚胎发育速度不同的问题，并且不必进行重复投用。本发明满足了上述要求并提供了现有技术方法所没有的优点。
应提到的是，本发明还涉及用于实践上述方法和向动物体内输送生物材料之方法的微颗粒组合物。
微颗粒是粒度由一微米以上到2000微米的球形聚合物颗粒。微颗粒包括其中生物制剂被均匀地包含在囊腔内的微胶囊，和其中制剂分散于整个微颗粒中的微球。可使用许多方法制备微颗粒，包括溶剂蒸发法、有机相分离法、界面聚合法、乳液聚合法和喷雾干燥法。但只有很少数方法适用于制备肽微颗粒。许多肽的物理化学性质使它们很难的配制，并可能在掺入微颗粒期间失活。
已使用许多聚合物作为微颗粒的基质，包括多糖、聚酯和非生物降解性合成聚合物。肽微型胶囊化的大多数方法是使用聚酯，特别是聚(D，L-丙交酯-共-乙交酯)。聚酯特别适用于这一目的，因为它们是生物可降解和生物可腐蚀的，它们易于获得、易于加工并且无毒性。
可用溶剂蒸发法常规制得乳酸和羟基乙酸的微球，尽管有某些限制，但该方法仍适用于处理许多的肽。但对于肽的颗粒配制来说，主要限制在于这些分子的高水溶性。微胶囊化的典型方法是基于化合物对聚合物或乳液之亲脂相的亲和性。结果，以过去使用的溶剂蒸发法制得的微胶囊中的肽药物负载量一般只有不足10%。
因此现有技术中做了许多努力来克服这些问题，如包括使用双乳剂技术，以及经加入硅油进行诱导的相分离方法。然而，仍需要建立一种制备掺入肽的生物可降解微颗粒的方法，其中所说的肽是稳定和有活性的，而且是可在长时间内以预期的速率释放的。
简要说来，本发明的一个方面提供了一种向卵内或蛋内投用生物制剂的方法，该方法包括向卵的气泡中输送含有该制剂的颗粒载体。颗粒载体在内和外膜(该膜将气泡限定在圆拱端)之间迁移到离开气泡的位置。优点在于，生物制剂可在长时间内从载体中释放出来。此外，由于孵化后颗粒载体掺入鸟体内，因此可使幼年鸟持续接受该生物制剂。
本发明的一个目的是提供一种向卵内并进一步给发育的幼鸟投用生物制剂的方法。本发明的再一个目的是提供一种投用生物制剂的方法，该方法易于完成、不需要无菌技术，并可使损伤卵内的发育胚胎的危险减到最小。本发明的另一个目的是提供一种可长时间向发育胚胎内，并向由此得到的幼年鸟体内输送生物制剂的方法。
本发明的进一步的目的和优点可从下述优选实施方案中看出。
图1和2是图解显示从负载CHRH的微球中释放GHRH之速率的体外研究结果，图中Lot＃指批号。
为了有助于了解本发明的原则，现参照优选实施方案并使用特定语言描述本发明。应明确的是，这些描述无意限制本发明的范围，对本发明相关技术领域的技术人员来说，对本发明之原则的改变、修饰和进一步应用也将包括在本发明范围内。
本发明提供了一种投用生物制剂的有利方法。所提供的颗粒载体包含以可向发育胚胎和由之得到的幼年鸟体内输送的形式存在的一种或多种生物制剂。鸟卵中有两个主壳膜。只有一薄层白蛋白反将这些相邻的内外膜分开，不同的是它们在宽端分离而形成气泡。本发明的方法总的包括将颗粒载体放入卵的气泡中。已令人惊奇地发现，颗粒载体将从内和外膜间的气泡迁移到卵的对侧端。
可通过选择颗粒载体和生物制剂来提供长时间释放制剂。当胚胎发育成幼小鸟时，颗粒载体即被包藏在鸟体内。因此载体可适用于向卵内，甚至在幼鸟从卵内孵出后向鸟体内输送生物制剂，延长释放可避免必须在特定时间投用生物制剂的要求，例如根据胚胎的发育速度，如果输入制剂的特定时间范围为胚胎的16至18天(E16-E18)，那么按照本发明就可以在E15天给药，且由于制剂可在几天时间内延时释放，而确保制剂在所需的时间被得到。本发明同样提出了在胎儿发育的期间，特别是在胎儿对操作更为敏感的后期，需要制剂存在特别长的时间的问题。
如众所周知，鸟卵包括有内膜和外膜，并且在其一端内外膜之间限定了一个气泡。外膜一般正好在相对硬的壳的下方，在胚胎发育期间借以保护胚胎。内膜也提供了一种保护胚胎的措施，因为它可作为屏障阻挡许多害物质，例如可能会感染胚胎的细菌。本方法包括将颗粒载体置入卵之内外膜之间的气泡内。
向气泡内投用颗粒载体具有显著的优点。用来将颗粒载体放入卵内这一位置的方法和仪器便于得到。另外，由于气泡容易定位，并且可通过注射很容易而安全地完成植入步骤，所以其严格程度相对较低。因为卵的内膜上未造成缺口，所以不必使用无菌技术。也不存在损伤胚胎的危险。
将材料输入卵的气泡内的各种技术是已知的。方法并不严格，但较好是对卵的破坏要尽可能地小。较好直接注射到气泡内。为此目的，典型地是使用配有一般约为18至22口径针头的皮下注射器。为了注入气泡内，针头只须插入卵内几毫米。在插入针头前可通过壳刺或钻个导向孔，以避免损坏或弄钝针头。必要时，可用适当材料如胶、蜡等重新密封卵上的孔，也可以继续开放着。
本发明的一个优点是可很好地适用于高速、自动注射系统。现已可得许多这样的系统，包括在已转让给NorthCarolina的Embrex公司的美国专利5，136，979号(Paul等人)、美国专利5，056，464号(Lewis等人)、美国专利4，681，063号和4，903，635号(Hebrank)以及美国专利4，040，388号、4，469，047号和4，593，646号(Miller)中描述的系统。前述专利的公开内容均供本文参考。这些装置关于以相对更快的速度向卵的气泡内给药。另外，可得到的装置如Paul等人专利中描述的装置可适用于不同大小、形状和定向的卵。已使用一个Embrex，Inc.的商标名为INOVOJECT的自动注射系统获得了良好的结果。
本发明方法可用于向鸟体内或鸟卵内输送多种不同的生物学活性制剂。术语“鸟”意欲包括任何一种鸟，特别是商业上产卵或产肉的家禽。因此，术语鸟具体可包括母鸡、公鸡、公鸭、火鸡、雌鸭、鹅、鹌鹑和野鸡。
待投用的制剂包括任何一种可期望向胚胎或幼年鸟体内投用的、与所利用的颗粒载体相容并可从其中释放的制剂。生物制剂可包括神经肽、肽模拟物、抗原、基因(DNA或RNA)、酶、激素、抗生素和各种其他生物化学物质，这些制剂可以单独或联合投用。此外，制剂可包括进行研究的制剂，如进行毒性研究的试验化合物。因为本发明基本上是作为一种物理现象，即颗粒载体的定位放置和迁移而工作的，所以应理解到所选择的生物制剂并不是严格的。
这些生物制剂是已知的，并且在许多文章和专利中列举过。例如，Federicksen等人公开的美国专利5，106，617号描述了当在卵内(inovo)接种约18天时投用包括白介素(Interleukin)-2在内的T细胞生长因子的实用性。Federicksen还公开了同时在卵内给用疫苗的方法，包括给用活疫苗如火鸡疱疹病毒疫苗和粘液囊病疫苗、Lukert株，和非复制疫苗、肽、蛋白质及抗同种异型抗体。1991年8月22日公开的PCT申请WO91/12016号中报导了给用生理学活性肽的方法。举例的垂体肽包括生长激素、促甲状腺激素、α-黑素细胞刺激激素、催乳激素、黄体生长成激素、促肾上腺皮质激素和β-内啡肽。可举例的下丘脑释放激素包括甲状腺激素释放激素(TRH)、促性腺激素释放激素、生长激素释放抑制素、促肾上腺皮质激素释放激素和生长激素释放激素。可举例的胃肠肽包括血管活性肠多肽、缩胆囊素、胃泌激素、物质P、神经降压素、胰高血糖素、韩蛙皮素、促胰液素和能动素。
各种其他制剂是已知的，并基于一个连续的基础逐步被鉴定。Wiegland的美国专利4，917，045号描述了使用生理学上可接受的有机硅化合物或硅酸以刺激骨组织生长。经卵内注射二硝基苯基化 孔钥血兰蛋白(DNP-KLH)或葡聚糖(DNP-D)致敏免疫系统(“Elicitation of delayed type hypersensitivity in chicks after in ovo sensitization with different molecular forms of the same hapten”，O.Moriya;Y.Ichikawa，Microbiol.Immunol.;27(9)pp.779-785(1983)。已显示在E11天给鸡卵内投用加在用NaHCO3缓冲到pH8.3之等渗盐中的羊生长激素(oGH)，可增加鸡的体重、骨骼生长和饲养效率(“In Ovo Growth Hormone Alters Growth and Adipose Tissue Development of Chickens”P.S.Hargis，S.L.Pardue，A.M.Lee，and G.W.Sandel，Growth，Development & Aging，1989，53，pp.93-99)。
文献中有许多描述可望进行卵内输送之物质的报导。例如参见“EffectsofDiazinonontheAnatomicalandEmbryologicalChangesintheDevelopingChickEmbryo”J.H.Cho，C.E.Lee，Res.Rep.Rural.Dev.Adm.(Suweon)，32(3Vet.)1990，pp.35-47(diazinonondayE3);"BilirubinandHemeasGrowthInhibitorsofChickenEmbryosInOvo，”
R.Vassilopoulou-Sellin，P.Foster，C.O.Oyedeji，pediatr.Res.27(6)1990，pp.617-621(bilirubinandheme);"BoilerSafetyStudiesofMarek'sVaccinationInOvoUsingtheInovoject，”C.M.Hoyle，R.P.Gildersleeve，Poult，Sci.，69(Suppl.l)1990，p.65(Marek'sdiseasevaccine);”post-NatalDevelopmentofMaleandFemaleBroilersAfterOneorSeveralThyrotropinReleasingHormoneTRHInjectionsDuringEggIncubation，”J.C.Blum，M.R.Salichon，J.P.Vigneron，ArchGefluegelkd，53(6)，1989，pp.265-268(thyrotropinreleasinghormone);"IncreasedHatchabilityofTurkeyEggsbyBiotinEggInjection，”E.J.Robel，V.L.Christensen，Poult.Sci.，65(Suppl.1)1986，p.112(biotin).所有上述文章中公开的内容均供本文参考。
生物制剂由适用的、生物相容性的(生理学上可接受的)颗粒载体所包含。载体可以是任何形式的，本文称为“微颗粒”的颗粒材料，如微球、脂质膜泡或其修饰形式。微球一般由二氧化硅、玻璃、各种生物可降解的高聚物(如聚丙交酯和聚乙交酯聚合物及其共聚物、聚羟基丁酸、纤维素、淀粉、碳水化合物树胶等)或蛋白质(如白明胶、白蛋白)。脂质膜泡(如酯质体)似乎是向卵内注射的理想的输送载体，因为它们可适应预期应用与生物制剂，如可带有不同的电荷(负的、正的、中性的)、可通过适当选择磷脂而与卵膜产生融合、可以携带水溶性和非水溶性化合物、并使用天然或天然呈现赋形剂。脂质可以是磷脂或非磷脂。优选的非磷脂脂质体膜泡是由MicroVesicularSystems，Inc.生产并称为“Novasome”膜泡的少量薄片脂质体，该脂质体具有最大限度减小氧化问题的优点。
可用已知技术将生物制剂掺入到微颗粒中，如在颗粒形成期间掺入、吸收到微颗粒中，或包被在微颗粒上。以任何一种方式包含生物制剂均应使制剂能够长时间从微颗粒中释放。结果，即可选择生物制剂的颗粒载体和包含方式，以使制剂能在胚胎发育和孵化后幼鸟生长期间，以所需的时间和速度释放。
颗粒应至少如膜间液体一样致密。较高的密度将简单地影响颗粒向卵的底端迁移的速度。垂直放置卵可使有小于膜间液体之密度的颗粒通过液体上升，但这不是优选的，因为这需要一个对适当选择颗粒密度来说不必要的附加步骤。又由于气体空间允许进行气体交换，所以这样还会使卵窒息。
包括载体之颗粒材料的大小将随着所选择材料及其他因素的不同而变化。确定微颗粒的大小应允许微颗粒在卵的内和外膜间迁移。结果，微颗粒移出气泡到达远离气泡的某位置，导致颗粒在孵化时掺入鸟体内。微颗粒的大小最好能使之在卵的内和外膜间自由迁移。例如，适当确定微颗粒大小时，其大小为不大于内和外膜相邻部分间的一般距离，较好不大于这个距离的一半。典型的颗粒大小约为5至500微米。微颗粒大小范围较好约为125至250微米。可以理解到，优选大小将依据微颗粒的类型和不同种鸟的卵内和外膜间的距离有所变化。
将生物学有效量的制剂导入气泡中。可以理解的是，所用制剂的量将取决于所用的制剂和希望达到的效果。这些因素包括给用量、期望的释放速度、给药的浓度和时间长短以及现有技术中已知的其它因素。同样，颗粒载体的量将依据微颗粒的大小、微颗粒所含制剂的量和浓度、制剂从微颗粒中释放的速度及其他因素来选定。
另外，选择含生物制剂的颗粒载体向卵内输送的时间以产生所需的结果。投用时间也将取决于所投用的制剂、胚胎发育阶段和期望达到的效果等已知因素。这些因素是本领域已知的，并且文献已经描述了或经不是太多的实验来确定各种生物制剂的优选投用日期。如期望在特定优选的日期投用，如在保温的第16天，则一般是在该日期之前一天或两天提供颗粒载体。这样就可确保在预期的日期得到生物制剂，同时也可允许微颗粒的释放速度和达到峰值浓度的时间有所变化。
颗粒载体在内和外膜间迁移，达到远离载体原来在气泡内的位置。在载体输入到气泡内之后，较好将卵以气泡在顶端的位置垂直放置至少一段时间。最好在注射微颗粒后立即以垂直方向放置，并且持续的时间应足以促进微颗粒向相对气泡的卵底端迁移。这段时间较好是连续的，但并不是必须连续的。为方便起见，投用时间可与基于其他因素考虑的对卵的正常操作协调起来。例如，通常使卵在保温箱中保留一段日期，对于鸡一般约为17天，并在此期间内定期移动卵。然后常常将卵移入孵化器，此期间便不再对卵作大的移动。将会理解到，从保温箱转移到孵化器内时常常是向卵内投用颗粒载体和所含生物制剂的方便时间。但这一投用时间的选择应从更为方便着想而不是一成不变的，在这一时间前后的其他时间投用也将是可以接受的。
已确定了许多化合物的优选投用日期。选择投用的日期，以使生物制剂能够在胚胎内或后来的发育鸟体内产生预期的生理反应。例如，已报导在保温的大约E25天，给用有效量的外源吡哆素(维生素B6)可提高受精火鸡卵的孵化能力。已报导在卵内保温的后四分之一时间里给鸡投用生理活性肽，如包括垂体肽、下丘脑释放激素和胃肠肽，特别是那些引发内分泌反应的激素肽是有利的。本领域的技术人员可以选择各种制剂的所需投用日期。可以确定各选用制剂的优选投用日期。
下列实施例举例说明本发明，而不是限制本发明。
为了证明本发明适用范围，使用DL-丙交酯-共-乙交酯(PLA/PGA)(一种乳酸和羟乙酸的随机共聚物)制备用于试验的微颗粒。所使用的一种PLA/PGA中PLA对PGA的比例为85∶15，比浓对数粘度为0.85dL/g，且分子量约为90，900道尔顿。该聚合物可由BirminghamPolymers，Incorporated(BPI)得到，并可通过乳酸和羟乙酸之各自环二聚体的离子、开环、加成聚合物制得。在暴露于水之后，该脂族聚酯通过水解酯键发生降解，而产生生物相容性产物乳酸和羟乙酸。已报导根据其表面积、孔隙率和分子量，该85∶15共聚物的生物降解时间约为5个月。PLA/PGA的其他混合物降解时间为2-24个月。已报导的一种可代用的50∶50PLA/PGA聚合物降解时间为2个月。
实施例1红/绿着染的半成品PLA/PGA微颗粒的制备制备用来在鸡卵或蛋中进行评估的半成品PLA/PGA微颗粒。第一组微颗粒使用American Gyanamid公司的Calco Oil Red N-1700染料染色，第二组微颗粒使用Calco Victoria Green Base染料(American Gyanamid公司)染色。各微颗粒的制备程序基本相同。将3g在CHCI3中30℃下比浓对数粘度为0.58dL/g的PLA/PGA(85/15)(MW＝90，900道尔顿，MN＝50，100道尔顿)(BPI)溶解在大约40ml二氯甲烷中。向聚合物溶液内加入小量油溶性的染料。搅拌下将有机相乳化成250ml含有0.25%w/v Air Products V-205聚(乙烯醇)的去离子水中。于室温和大气压下持续搅拌16小时，以确保二氯甲烷完全散失。经真空过滤回收所得的微颗粒。真空下干燥微颗粒并干燥过筛以确定颗粒大小。
实施例2黄色着染的半成品PLA/PGA微颗粒的制备使用从Dulbecco磷酸盐缓冲盐水中进行溶剂蒸发的微颗粒制备技术，以50/50PLA/PGA(BPI)为原料制备半成品黄色着染的微颗粒。向250mlDulbecco磷酸盐缓冲盐水(PBS)溶液中加入0.625gAirProductsV-205聚(乙烯醇)(PVA)，而制成PVA在PBS中的0.25%w/v溶液。将PVA加到室温PBS中，搅拌加热至55℃以促进溶解。让该溶液冷却至室温备用。
在30℃HFIP中比浓对数粘度为0.42dL/g的2.00g PLA/PGA(50/50)(BPI)(MW＝29，000道尔顿，MN＝20，000道尔顿)溶解在大约40ml二氯甲烷中。向该聚合物溶液中加入微量(少于0.1g)FLUOROLYELLOW 088(BASF ＃205671)，将聚合物溶液染成荧光黄色。将聚合物溶液全部加入含PVA溶液的旋转搅拌器中以300RPM搅拌。连续搅拌过夜以使二氯甲烷完全蒸发。使用真空过滤法回收所得的黄色微颗粒。用Dulbecco PBS 将微颗粒洗几次，然后放在干燥器内的干燥皿上真空干燥。
回收1.98g干燥的微颗粒，将其过筛分出下列筛目的颗粒(美国标准)＞60目(＞250微米)-微量(弃去)
60-120目(250-125微米)-0.34g＜120目(＜125微米)-1.64g实施例3使用干燥的微颗粒显现卵内注射后，在整个保温后期和孵化后颗粒的定位。于E14天，将5mg加在100ml0.15M蔗糖中的实施例1制成的60-120目红染微颗粒注射到胚胎化卵的气泡中。在后续保温时，每天连续打开3至5只卵。另外，在孵化当天和以后的每三天的每一天解剖3-5只小鸡。注射后24小时，大多数微颗粒在两膜间迁移到尖端的位置或相对着气泡的卵的底部。微颗粒沉浸在白蛋白液中，并定位在有高度血管生成的两薄膜之间。整个保温期间微颗粒一直保留在这一位置。
当胚胎形成达到保温的最后一天(E21)，染色的颗粒即显出开始在连同内膜和卵黄囊的腹部内在化。显微镜检查球形微颗粒，证明它们在整个保温周期间慢慢降解。此外，随时间进程其形状逐渐变得不规则并且变大，好象微颗粒已被融合。对孵出的小鸡进行解剖后，发现微颗粒存在于脐周围的腹膜上。甚至在出生三天后还存在大量的完整聚合物。
在孵化后于鸡体内鉴定有完整的生物可降解性微颗粒这一事实表明，这种卵内投用方式可在胚胎生命期和新生期期间有效地释放所需的化合物。如实施例1中制得的60-120目绿色着染的微颗粒，在注射到气泡中后24小时内同样在两膜之间迁移，但胚胎因染料的毒性而于48小时内死亡。
实施例4还制备含生长激素释放激素(根据UnitedStatesAdoptedNames Council(USAN)的提议，下文将其称为生长激素生成素(somatogenin)的非磷脂脂质体。本文所说的生长激素生成素是指4-甲基马尿酰(1)猪GHRH(2-76)-OH，为天然猪GHRH前体的类似物。该化合物分子量为8846.86道尔顿，其分子式为C379H624N127O118。申请日为1991年4月26日，题目为“超反应性GRF类似物”的美国专利申请系列号07/692，090中描述了制备生长激素生成素的方法。
下式代表生长激素生成素的结构
＊酰基基团＝对位甲基苯甲酰基组成数Ala7Gly5Pro0Arg11His1Ser5Asp4Ile3Thr3Asn4Leu12Tyr1Cys0Lys0Trp1Glu4Met0Val3Gln11Phe1按下述方法制备脂质体。使用聚氧乙烯十六烷基醚(0.696g)、半琥珀酸胆固醇酯(0.073g)、磷酸双十六烷基酯(0.055g)和加在0.01M乙酸中的生长激素生成素(10ml，浓度约1mg/ml)制备带负电荷的脂质膜泡。从同样材料制备带正电荷的脂质体，不同的是用十六基三甲基铵(0.036g)代替磷酸双十六基酯。
首先将脂质材料放入烧杯中并加热到大约80℃。将生长激素生成素溶解到10ml 0.01M CH3COOH中达到1mg/ml。在热平板上将30cc注射器和3通道活栓预加热到约80℃。将生长激素生成素溶液也加热到约80℃。然后将脂质和含水成分装入不同的注射器并置于3通道活栓的右上角。通过活栓将脂相用力注射到水相中。然后尽可能迅速地向后和向前推动材料2分钟。将材料移入空管内，然后以2500rpm离心20分钟而不进行分离。取少量样品(约1ml)以10，000rpm离心15分钟，仍不进行分离。合并这些材料并放入冰箱备用。然后将脂质膜泡注入卵的气泡内，发现基本上与PLA/PGA微颗粒一样在卵内两层膜间迁移。
实施例5生长激素生成素/PLA/PGA(85/15)微颗粒使用PLA/PGA(85/15;BPI)和溶剂蒸发制备微球的技术从含有聚乙烯醇(PVA)的Dulbecco 磷酸盐缓冲盐水(PBS)制备微球。向250ml新鲜制备的Dulbecco PBS(w/o CaCl2)中加入1.0g Air Products Airvol 205聚乙烯醇，以制得溶于PBS中的0.4%(w/v)PVA溶液。使用磁力搅拌将PVA分散在室温下的PBS中，并将温度升至45℃以完全溶解PVA。将含有PVA的Dulbecco PBS溶液放回室温备用。
将1.80g在30℃ CHCI3中比浓对数粘度为0.58dL/g的PLA/PGA，85/15，BPI(MW＝90，900道尔顿，MN＝50，100道尔顿)溶解在约50ml二氯甲烷中。向该聚合物溶液中加入0.20g气流粉碎的生长激素生成素。经轻轻涡旋搅拌和超声波处理约1分钟使活性生长激素生成素分散成基本颗粒大小。将聚合物溶液一生长激素生成素悬浮液加到搅拌的含PVA的Dulbecco PBS的旋流中。搅拌速度为270-280RPM。使用400ml Pyrex烧杯和带三叶片旋转浆的塑料搅拌棒盛放并搅拌所得的水包油型乳液。将其继续搅拌过夜，使二氯甲烷完全蒸发并继而形成微球，然后经真空过滤回收之。将微球放在干燥器内的干燥皿中真空干燥。回收1.80g+1.85g(3.65g)干燥的微颗粒，并筛分成下列不同大小范围的颗粒＞60目-微量60-120目-2.66g＜120目-0.94g分析合并的产物，显示负载量为9.8%w/w(10.2，9.4，9.7)，与10%理论值差不多。
实施例6生长激素生成素/PLA/PGA(85/15)微颗粒使用PLA/PGA(85/15)，BPI和溶剂蒸发制备微颗粒的技术，从含聚乙烯醇Dulbecco的磷酸盐缓冲盐水(PBS)制备含生长激素生成素的微颗粒。向250ml Dulbecco PBS (w/o CaCl2)中加入1.02g Air Products Airvol 205聚乙烯醇，以制备PVA在PBS中的0.4%(w/v)溶液。于室温下将PVA分散于PBS中，使温度升至45℃以利于溶解。将含PVA的PBS溶液放回室温下备用。
将1.75g在30℃CHCI3中比浓对数粘度为0.58dL/g的PLA/PGA(85/15)，BPI(MW＝90，900道尔顿，MN＝50，100道尔顿)溶解于大约50ml二氯甲烷中。向该聚合物溶液内加入0.25g气流粉碎的生长激素生成素。经轻轻搅拌和超声波处理约1分钟使生长激素生成素分散成基本颗粒大小。将聚合物溶液一生长激素生成素悬浮液加到搅拌的含PVA的DulbeccoPBS旋流中，继续搅拌过夜以使二氯甲烷完全蒸发。经真空过滤回收所得的微颗粒并放在干燥器内的干燥皿中真空干燥，得到1.81g干燥的微颗粒，筛分成下列粒度范围的颗粒(美国标准)＞60目-无60-120目-0.96g＜120目-0.08g检验60-120目范围的颗粒显示负载12.9%(w/w)的生长激素生成素(理论值12.5%)。
实施例7生长激素生成素/PLA/PGA(85/15)微颗粒使用PLA/PGA(85/15)，BPI和溶剂蒸发制备微颗粒的技术，由含有聚乙烯醇(PVA)的Dulbecco磷酸盐缓冲盐水(PBS)制备含生长激素生成素的微颗粒。向250ml Dulbecco PBS(w/o CaCl2)中加入1.0g Air Products Airvol 205聚乙烯醇，以制备加在PBS中的0.4%(w/v)PVA溶液。室温下将PVA的分散于PBS中并将温度升高到45℃以促进溶解。将此含PVA的溶液放回室温下备用。
将1.52g在30℃ CHCI3中比浓对数粘度为0.58dL/g的PLA/PGA(85/15，BPI)(MW＝90，900道尔顿，MN＝50，100道尔顿)溶解在大约50ml二氯甲烷中。向该聚合物溶液内加入0.50g气流粉碎的生长激素生成素，并经轻轻搅拌和超声波处理约1分钟，使活性生长激素生成素分散成基本颗粒大小。将聚合物溶液一生长激素生成素悬浮液加到经过搅拌的含PVA之Dulbecco PBS的旋流中。使用400ml Pyrex烧杯和塑料3叶轮搅拌器及旋柄盛放并搅拌水包油型乳液。持续搅拌过夜，从而完全蒸发掉二氯甲烷。用真空过滤法回收所得的微颗粒并放在干燥器内的干燥皿中真空干燥。回收到1.80g微颗粒并按下列大小范围筛分(美国标准)＞60目-无60-120目-1.30g＜120目-0.17g对60-120目颗粒的分析结果显示生长激素生成素负载量为24.9%(w/w)(理论值为25%)。
实施例8生长激素生成素/PLA/PGA(85/15)微颗粒使用PLA/PGA(85/15;BPI)和从含聚乙烯醇(PVA)Dulbecco PBS中蒸发溶剂的微颗粒制备技术制备含生长激素生成素的微颗粒。向250ml新鲜制备的Dulbecco磷酸盐缓冲盐水(BPS)(w/oCaCl2)中加入1.0gAir Products V-205 PVA，以制备PVA在PBS中的0.4%(w/v)溶液。室温下将PVA分散于PBS中，使温度升高到45℃以促进溶解。将溶液冷却至室温备用。该溶液含有0.4%(w/v)PVA(在PBS中)。
将1.5g在30℃ CHCI3中比浓对数粘度为0.58dL/g的PLA/PGA(MW＝90，900道尔顿，MN＝50，100道尔顿)溶解在大约50ml二氯甲烷中。向该聚合物溶液中加入0.5g微粉化的生长激素生成素(在与生长激素生成素接触之前，所有玻璃器皿和搅拌棒/柄均浸没入乙腈冲洗)。经轻轻搅拌和超声波室温处理约1分钟使生长激素生成素分散成基本颗粒大小。将聚合物溶液/生长激素生成素悬浮液加到搅拌的含PVA之Dulbecco PBS溶液旋流中。继续搅拌过夜，使二氯甲烷溶剂完全蒸发掉。经真空过滤回收微颗粒，并放在干燥器内的干燥皿中真空下干燥。回收到1.84g干燥的微颗粒并按下列大小范围(美国标准)筛分＞60目-0.01g(弃去)60-120目-0.86g＜120目-0.94g重复前述过程得到1.87g干燥的微颗粒，再次筛分如下(美国标准)＞60目-微量(弃去)60-120目-1.10g＜120目-0.71g对这些颗粒分析结果如下60-120目＝15.7±2.1%负载量(生长激素生成素)＜120目＝15.2±0.8%(w/w)负载量(生长激素生成素)实施例9
按下述方法，使用实施例8的产物制备用于卵内注射研究的试验材料。制备下列处理(Trt)材料TrtA水作为对照，TrtB将微细化的生长激素生成素分散在50ml纯化水中，达到浓度为60mg/100ml水;
TrtC将微细化的生长激素生成素分散在50ml纯化水中，达到浓度为600mg/100ml水;
TrtD将微颗粒(生长激素生成素PLA/PGA，60-120目)分散于50ml2%(w/v)羧甲基纤维素钠(NaCMC330)中，得到相当于60mg生长激素生成素/100ml(基于颗粒负载量而分散的量)的含微颗粒悬浮液;
TrtE将微颗粒(生长激素生成素PLA/PGA，60-120目)分散于50ml2%(w/v)NaCMC330中，以得到相当于600mg生长激素生成素/100ml(基于颗粒负载量而分散的量)的含微颗粒悬浮液。
TrtF将半成品微颗粒(PLA/PGA，60-120目)分散于50ml2%(w/v)NaCMC330中，约相当于高剂量生长激素生成素PLA/PGA(TrtE)。将上述材料注射到卵的气泡内之后，颗粒一般在几小时内迁移到卵的底部。任何处理均未记录到有孵化能力的增加。
实施例10将1.8g由Birmingham Polymers，Inc.生产的，在30℃ CHCl3中比浓对数粘度为0.58dL/g的85/15聚(丙交酯-共-乙交酯)(MW＝90，900道尔顿，MN＝50，100道尔顿)溶解于约50ml二氯甲烷中，并加入0.2g微细化的生长激素生成素以制得10%(w/w)生长激素生成素微球。将聚合物溶液/生长激素生成素悬浮液乳化到含有聚(乙烯醇)的磷酸盐缓冲盐水中。将此水包油型乳液搅拌约16小时，使溶剂完全蒸发并继而形成微球。经真空过滤收集微球，在干燥器内真空下干燥并按大小筛分之。
实施例11使用按实施例10所述方法制备的微颗粒证明生长激素生成素内容物的长时间释放。以200ml/分的流速，用0.1N乙酸灌注以进行体外研究。研究的结果示于图1和2中。这些结果证明微颗粒可长时间释放其所含的制剂，并且还证明释放的速度受制剂中负载量之百分比的控制。
虽然上文已举例说明并详细描述了本发明，但它们应被看作是具体实施例而不是限制本发明的特征还应明确的是，这里给出和描述的只是优选实施方案，而落入本发明基本特征范围内的所有改变和修饰也应受到保护。
在本发明的另一个方面，提供了包含生物相容性、生物可降解性微颗粒的组合物，所说的微颗粒具有聚酯基质和约占5%至25%重量的分散于整个基质中的生物学活性的水溶性多肽。在本发明的另一个方面，含有生物学活性肽的微颗粒是按下述步骤制备的将聚酯溶解在有机溶剂中;将生物学活性制剂悬浮在聚酯溶液中;将悬浮液乳化到不溶解该制剂的含水介质中并从乳液中蒸发掉溶剂以产生微颗粒本发明的一个优点是能够方便地制备具有相对高的肽对聚酯比例的微颗粒。本发明的再一个方面，提供了给生物体投用生物活性剂的方法，其中包括将微颗粒悬浮在适当液体中并注射到生物体内。
本发明的一个目的是提供在生物可降解和生物相容性基质中掺入生物学活性剂如肽的微颗粒。
本发明的再一个目的是提供制备含肽制剂之微颗粒的方法，该方法可使制剂的负载量高达25%。
本发明的再一个目的是提供含有在体内条件下以延迟的可预测速度释放之肽制剂的微颗粒。
本发明的再一个目的是提供制备含有肽制剂之微颗粒的方法，该方法不会导致肽的失稳、破坏或失活。
本发明的再一个目的是提供微颗粒和其制备方法，其中可通过调整基质特性来修饰微颗粒的释放特征。
根据下文对本发明优选实施方案的描述，可对本发明组合物和方法的这些及其他目的，优点与特征的进一步了解。
图3-6图解显示对猪的体内研究，借以证明控制生长激素生成素从微颗粒中释放的生物学意义。
为了帮助了解本发明的原则，现将参照其优选实施方案，并使用特定语言描述本发明。应明确的是，这些描述并不是旨在限制本发明的范围，对本发明原则的改变、修饰和进一步应用将是本技术领域相关技术人员容易实现的。
本发明提供了包含作为载体基质之聚酯和作为所含生物活性剂之肽的微颗粒配方。该微颗粒是以溶剂蒸发技术制备的，其中肽是以稳定的和有活性的形式掺入的。该微颗粒是生物可降解的，并提供了肽的受控制的延迟释放。通过调整肽负载量的大小、生物可降解聚合物的分子量、以及在某些情况下调整共聚物成分的比例等因素来控制药物释放的速度。本发明的微颗粒的制备方法不同于现有技术，其中所提供的配方中肽保留了化学稳定性、物理稳定性(构象)和生物学活性。本发明的方法与用于制备掺入水溶性多肽之微颗粒的现有溶剂蒸发技术相比，可达到更大的肽对聚合物比例。
本发明的微颗粒提供了所含肽的延迟释放。作为实践制备微颗粒之方法的结果，生物学活性化合物如肽等在制作期间被截留在聚合物网络中。然后肽在基质降解期间长时间释放，并且其中一定程度上通过聚合物网络扩散。
可通过适当选择或控制各种参数来调整释放曲线。例如，释放特性将随着聚合物组成特别是聚合物的类型和比例、聚合物的分子量、重量平均分子量(MW)、根据重量平均分子量(MW)对数目平均分子量(MN)的比例即MW/MN测得的分子量范围(或多分散性)、微颗粒的大小和形状，以及肽对聚合物的比例即负载量而改变。
可由聚酯如聚(D，L-丙交酯)、聚(D，L-丙交酯-共-乙交酯)、聚(ε-已丙酯)、聚氨基酸、聚(原酸酯)、聚酐、聚氰基丙烯酸烷基酯制备本发明的微颗粒。所有生物可降解和/或生物可腐蚀的，并在降解后产生生物相容性材料的聚酯均包括在内。
聚丙交酯特别适用于本发明。可从商业途径购得用于制备微颗粒的聚合材料。术语聚丙交酯在一般意义上包括单一乳酸的聚合物和聚合物的混合物、乳酸与羟乙酸的共聚物和这些共聚物的混合物，以及这些聚合物和共聚物的混合物，其中乳酸可以是外消旋或光学活性形式的。本文所用术语PLA/PGA是指乳酸和羟乙酸的各种共聚物。聚合物的分子量范围大约29，000至90，900道尔顿。丙交酯单位对乙交酯单位的比例范围为1000至5050。例如，所用的一种PLA/PGA聚合物具有8515的PLA和PGA比例，0.58dL/g的比浓对数粘度，以及大约90，900道尔顿的分子量。该颗粒聚合物可由BirminghamPolymers，Inc.(BPI)购得，并可由乳酸和羟乙酸之各自环状二聚体的离子的、开环的、加成聚合作用而制得。
在暴露于水之后，聚酯通过酯键的水解作用而降解以产生生物相容性产物。例如，优选的PLA/PGA聚合物降解成乳酸和羟乙酸。已报导85∶15PLA/PGA共聚物基于其表面积、孔隙率和分子量可具有大约5个月的生物降解时间。PLA/PGA的其他混合物则具有2至24个月的降解时间。已被选用的50∶50PLA/PGA聚合物的降解时间，据报导为2个月。同样，用于本发明的其他聚酯也具有适当的生物相容性和降解时间。
按照本公开方法制备的微颗粒适用于投用各种肽制剂。本发明的优点是它提供了含有小的、生物学活性多肽的微颗粒。一般说来，分子量高达10，000道尔顿的肽称为多肽，而分子量在10，000道尔顿以上的肽称为蛋白质。在过去，由于小的水溶性肽与所用溶剂蒸发技术不相匹配，所以用这一工艺制备微颗粒一般都致使这类肽的负载量很低。一般来说，已报道的负载量均低于10%。微颗粒的低负载量不可能提供适用的剂量。尽管有其限制，但因为它很易于操作并且可靠性好，所以仍优先选用溶剂蒸发法。本发明的方法利用生物制剂不在其中溶解的含水介质，以及可产生负载量高达25%之微颗粒生产工艺。本发明适应了5-25%的负载量在微颗粒中掺入多肽之常规方法的要求。
下列实施例举例说明本发明的制备方法。一般说来，该方法包括将聚合物材料溶解在适当的有机溶剂如二氯甲烷或氯仿中，并向其中加入有生物活性的水溶性肽如生长激素生成素。较好已用气流粉碎法降低了生长激素生成素的颗粒大小(参见美国专利5，021，554号，其部分内容供本文参考)。较好用超声波处理聚合物溶液/肽悬浮液使颗粒达到基本颗粒大小。然后将悬浮液乳化到生物活性肽在其中不溶的适当含水介质较好是磷酸盐缓冲盐水内。介质可含有稳定剂如聚(乙烯醇)、十二烷基硫酸钠、十六烷基三甲基溴化铵、甲基纤维素或明胶。可加入浓度约达到10%的各种赋形剂。赋形剂可包括脂肪酸如硬脂酸、月桂酸、肉豆蔻酸和较好的棕榈酸。蒸发除去溶剂并继而形成微颗粒。较好借助搅拌蒸发溶剂。较好用真空过滤法收集颗粒然后可在干燥器内于真空下干燥颗粒。并筛分成适当大小备用。
本发明可适用于多肽，以下列出的只是表明这些多肽可应用于本发明的配方但没有列出所有这类多肽生长激素释放因子、生长激素生成素、催产素、加压素、促肾上腺皮质激素(ACTH)、表皮生长因子(EGF)、催乳激素、luliberin或黄体生成激素释放激素(LH-RH)、转化生长因子、胰岛素、生长激素释放抑制因子、胰高血糖素、干扰素、促胃液素、四肽胃泌素、五肽胃泌素、尿抑胃素、促胰液素、降钙素、脑啡肽、内啡肽、血管紧张素、肾素、缓激肽、杆菌肽、多粘菌素、粘菌素、短杆菌酷肽、短杆菌肽，及其合成的类似物和修饰产物以及其有药理学活性的片段。
收集微颗粒后，可经筛分直接得到有所需大小的颗粒。另外，可将颗粒磨碎如使用超离心研磨机。微颗粒的大小较好是小于约250微米，更好在约120-250微米之间。
将所得颗粒与用来投用的适当液体合并。可将微颗粒分散如悬浮在其他已知的、适于投用的液体载体如水、葡萄糖溶液、甘油、或含2%(w/v)羧甲基纤维素钠330(NaCMC)或羟丙基甲基纤维素(HPMC)的水中，以提高粘度而防止微颗粒从悬浮液中沉淀出来。颗粒可用于活生物体，包括猪或其他哺乳动物，以及鸟如鸡或火鸡。例如，可将生长激素生成素微颗粒配方放在悬浮液中并经皮下注射到猪的胁腹部。微颗粒配方也可直接注入鸟体内或按上文所述注入卵的气泡或囊内以间接向鸟胚胎内投用。
本领域技术人员将会理解到，为向把细胞或组织内释放已掺入的药物，可单独给用含该药物的微颗粒，或作为与适当的药物稀释剂、载体、赋形剂或根据给药途径和常规给药实践而适当选择的佐剂的混合物给药。这些医药上可接受的惰性佐剂在本领域是已知的。例如，为进行胃肠道外注射，可利用剂量单位形式实现静脉内、肌肉内或皮下给药，而为了进行这种胃肠道外给药，可使用任意含有适当溶质以影响等渗性的适当无菌含水或不含水溶液或悬浮液。
提供下列实施例是为了举例说明本发明，而不是借以限制本发明。
实施例12含10%生长激素生成素的PLA/PGA(85/15)微颗粒使用PLA/PGA，85/15(BPI)和从含聚乙烯醇(PVA)的Dulbecco磷酸盐缓冲盐水(PBS)中经溶剂蒸发制备微颗粒的技术制备微颗粒。向250ml新鲜制备的Dulbecco PBS(未加CaCl2)中加入1.0g Air Products Airvo1205聚乙烯醇，以制备PVA在PBS中的0.4%w/v溶液。使用磁力搅拌在室温下将PVA分散于PBS中，将温度升高至45℃以完全溶解PVA。然后将含有PVA的Dulbecco PBS溶液放至室温备用。
将1.8g在30℃下CHCl3中比浓对数粘度为0.58dL/g的PLA/PGA，85/15(BPI)(MW＝90，900道尔顿，MN＝50，100道尔顿)溶解在大约50ml二氯甲烷中。向该聚合物溶液中加入0.20g气流粉碎的生长激素生成素。经轻轻涡旋并超声处理约1分钟，使活性生长激素生成素分散成基本颗粒大小。将聚合物溶液-生长激素生成素悬浮液加到搅拌的含PVA的Dulbecco PBS的旋流中。搅拌速度为270-280RPM。使用400ml Pyrex烧杯和带三叶片的塑料搅拌棒包含和搅拌所得到的水包油型乳液。使其持续搅拌过夜，以完全蒸发掉二氯甲烷并继而形成微球，然后经真空过滤回收之。将微球放在干燥器内的干燥皿中真空干燥。回收到1.80g+1.85g(两批共3.65g)干燥的微颗粒并按下列大小范围筛分＞60目-微量60-120目-2.66g＜120目-0.94g分析合并的产物显示负载量为9.8%w/w(10.2，9.4，9.7)，而理论值为10%。
实施例13含12.5%生长激素生成素的PLA/PGA(85/15)微颗粒使用PLA/PGA，85/15(BPI)和从含聚乙烯醇的Dulbecco PBS中蒸发溶剂的微颗粒制备技术制备含生长激素生成素的微颗粒。向250ml Dulbecco PBS(无CaCl2)中加入1.02gAirProductsAirvol205聚乙烯醇，以制备PVA在PBS中的0.4%w/v溶液。在室温下将PVA分散于PBS中，并将温度升至45℃以利于溶解。然后将含PVA的PBS溶液放至室温备用。
将1.75g在30℃下CHCl3中比浓对数粘度为0.58dL/g的PLA/PGA，85/15，BPI(MW＝90，900道尔顿，MN＝50，100道尔顿)溶解在大约50ml二氯甲烷中。向该聚合物溶液内加入0.25g气流磨碎的生长激素生成素。经轻轻搅拌并超声处理约1分钟使生长激素生成素分散成基本颗粒大小。将聚合物溶液-生长激素生成素悬浮液加到搅拌的含PVA之Dulbecco PBS的旋流中并继续搅拌过夜，以使二氯甲烷完全蒸发。经真空过滤回收所得微颗粒并放在干燥器内的干燥皿中真空干燥。得到1.81g干燥的微颗粒，筛分成下列大小范围(美国标准)＞60目-无60-120目-0.96g＜120目-0.08g分析60-120目颗粒显示负载量为12.9%(w/w)生长激素生成素(理论值12.5%)。
实施例14含15%生长激素生成素的PLA/PGA(85/15)微颗粒使用PLA/PGA，85/15(BPI)和从含聚乙烯醇(PVA)的Dulbecco'sPBS中蒸发溶剂的微颗粒制备技术制备含生长激素生成素的微颗粒。向250ml新鲜制备的Dulbecco磷酸盐缓冲盐水(PBS)(无CaCl2)中加入1.0g Air Products V-205 PVA，以制备PVA在PBS中的0.4%(w/v)溶液。室温下将PVA分散于PBS中，并将温度升至45℃以促进溶解。将该溶液放至室温备用。该溶液含0.4%(w/v)PVA(在PBS中)。
将1.5g在CHCl3中30℃下比浓对数粘度为0.58dL/g的PLA/PGA，85/15(MW＝90，900道尔顿，MN＝50，100道尔顿)溶解在大约50ml二氯甲烷中。向该聚合物溶液内加入0.5g微细化的生长激素生成素。经轻轻搅拌并超声处理约1分钟(室温下)使生长激素生成素分散成基本颗粒大小。将聚合物溶液/生长激素生成素悬浮液加到搅拌的含PVA之Dulbecco PBS溶液的旋流中。持续搅拌过夜以使二氯甲烷溶剂完全蒸发。用真空过滤法回收微颗粒并放在干燥器内的干燥皿中真空干燥。回收到1.84g干燥的微颗粒并按下列大小范围进行筛分(美国标准)＞60目-0.01g(弃去)60-120目-0.86g＜120目-0.94g重复前述过程得到1.87g干燥的微颗粒，按下列大小范围进行筛分(美国标准)＞60目-微量(弃去)60-120目-1.10g＜120目-0.71g对这些颗粒分析如下60-120目＝15.7±2.1%负载量(生长激素生成素)
＜120目＝15.2±0.8%w/w负载量(生长激素生成素)实施例15含25%生长激素生成素的PLA/PGA(85/15)微颗粒使用PLA/PGA，85/15(BPI)和从含聚乙烯醇之Dulbecco磷酸盐缓冲盐水(PBS)中蒸发溶剂的微颗粒制备技术制备含生长激素生成素的微颗粒。向250ml Dulbecco PBS(无CaCl2)中加入1.0g Air Products Airvol 205聚乙烯醇以制备PVA在PBS中的0.4%(w/v)溶液。在室温下将PVA分散在PBS中并升温至45℃以促进溶解。将此含PVA的溶液放至室温备用。
将1.52g在CHCl3中30℃下比浓对数粘度为0.58dL/g的PLA/PGA，85/15(BPI)(MW＝90，900道尔顿，MN＝50，100道尔顿)溶解在大约50ml二氯甲烷中。向该聚合物溶液内加入0.50g气流磨碎的生长激素生成素，并经轻轻搅拌和超声处理约1分钟使活性生长激素生成素分散成基本颗粒大小。将聚合物溶液/生长激素生成素悬浮液加到搅拌的含PVA之Dulbecco PBS的旋流中。使用400ml Pyrex烧杯和塑料3叶片搅拌器与旋柄包含和搅拌水包油型乳剂。持续搅拌过夜，以使二氯甲烷完全蒸发。经真空过滤回收所得微颗粒并放在干燥器内的干燥皿中真空干燥。回收1.80g干燥的微颗粒并按下列大小范围进行筛分(美国标准)＞60目-无60-120目-1.30g＜120目-0.17g
分析60-120目颗粒显示有24.9%(w/w)生长激素生成素负载量(理论值25%)。
实施例16含25%生长激素生成素的PLA/PGA(50/50)微颗粒使用PLA/PGA，50/50(BPI)和从含聚乙烯醇(PVA)之Dulbecco磷酸盐缓冲盐水(PBS)中蒸发溶剂的微颗粒制备技术制备含生长激素生成素的微颗粒。向250ml Dulbecco PBS(无CaCl2)中加入1.0g Air Products Airvol 205聚乙烯醇以制备PVA在PBS中的0.4%(w/v)溶液。在室温下经磁力搅拌将PVA分散在PBS中并升温至45℃以促进PVA完全溶解。将此含PVA的溶液放至室温备用。
将1.50g在CHCl3中30℃下比浓对数粘度为0.42dL/g的PLA/PGA，50/50(BPI)(MW＝29，000道尔顿，MN＝20，000道尔顿)溶解在大约50ml二氯甲烷中。向该聚合物溶液内加入0.50g气流磨碎的生长激素生成素，并经轻轻搅拌和超声处理约1分钟使活性生长激素生成素分散成基本颗粒大小。将聚合物溶液/生长激素生成素悬浮液加到搅拌的含PVA之Dulbecco PBS的旋流中。搅拌速度为270-280RPM。使用400ml Pyrex烧杯和塑料搅棒连同3叶片搅拌器包含和搅拌水包油型乳剂。持续搅拌过夜，以使二氯甲烷完全蒸发，并继而形成微球。经真空过滤回收后，将微球放在干燥器内的干燥皿中真空干燥。回收到1.92g干燥的微颗粒，并按下列大小范围筛分之＞60目-微量(弃去)60-120目-1.11g
＜120目-0.77g实施例17含10%生长激素生成素的聚(DL-丙交酯)微颗粒使用聚(DL-丙交酯)PLA/PGA，85/15(BPI)和从含聚乙烯醇(PVA)之Dulbecco磷酸盐缓冲盐水(BPS)中蒸发溶剂的微颗粒制备技术制备含生长激素生成素的微颗粒。向250ml Dulbecco PBS(无CaCl2)中加入1.0g Air Products Airvol 205聚乙烯醇以制备PVA在PBS的0.4%(w/v)溶液。在室温下将PVA分散在PBS中并升温至45℃以促进PVA完全溶解。将此含PVA的溶液放至室温备用。
将1.80g在CHCl3中30℃下比浓对数粘度为0.34dL/g的聚(DL-丙交酯)(BPI)(MW＝38，300道尔顿，MN＝24，300道尔顿)溶解在大约50ml二氯甲烷中。向该聚合物溶液内加入0.20g气流磨碎的生长激素生成素，并经轻轻搅拌和超声处理约1分钟使活性生长激素生成素分散成基本颗粒大小。将聚合物溶液/生长激素生成素悬浮液加到搅拌的含PVA之Dulbecco PBS的旋流中。使用400ml Pyrex烧杯和塑料3叶片搅拌器与旋柄包含和搅拌水包油型乳剂。持续搅拌过夜，以使二氯甲烷完全蒸发。使用真空过滤法回收所得微颗粒并放在干燥器内的干燥皿中真空干燥。回收到1.68g干燥的微颗粒并按下列大小范围筛分(美国标准)＞60目-0.02g60-120目-1.36g＜120目-0.18g
实施例18含10%生长激素生成素的聚(已内酯)微颗粒使用聚(已内酯)(BPI)和从含聚乙烯醇(PVA)之Dulbecco磷酸盐缓冲盐水(BPS)中蒸发溶剂的微颗粒制备技术制备含生长激素生成素的微颗粒。向250ml Dulbecco PBS(无CaCl2)中加入1.0g Air Products Airvol 205聚乙烯醇以制备PVA在PBS中的0.4%(w/v)溶液。在室温下将PVA分散在PBS中并升温至45℃以促进溶解。将此含PVA的溶液放至室温备用。
将1.80g在CHCl3中30℃下比浓对数粘度为1.27dL/g的聚(已内酯)(BPI)(MW＝143，000道尔顿，MN＝83，000道尔顿)溶解在大约50ml二氯甲烷中。向该聚合物溶液内加入0.50g气流磨碎的生长激素生成素，并经轻轻搅拌和超声处理约1分钟使活性生长激素生成素分散成基本颗粒大小。将聚合物溶液/生长激素生成素悬浮液加到搅拌的含PVA之Dulbecco PBS的旋流中。使用400ml Pyrex烧杯和塑料3叶片搅拌器与旋柄包含和搅拌水包油型乳剂。持续搅拌过夜，以使二氯甲烷完全蒸发。使用真空过滤回收所得微颗粒并放在干燥器内的干燥皿中真空干燥。回收1.85g干燥的微颗粒并按下列大小范围筛分(美国标准)＞60目-微量60-120目-1.27g＜120目-0.58g实施例19含10%生长激素生成素的聚(已内酯)-棕榈酸(1%)微颗粒使用聚(已内酯)和从含聚乙烯醇(PVA)之Dulbecco磷酸盐缓冲盐水(PBS)中蒸发溶剂的微颗粒制备技术制备含生长激素生成素的微颗粒。向250ml Dulbecco PBS(无CaCl2)中加入1.0g Air Products Airvol 205聚乙烯醇以制备PVA在PBS中的0.4%(w/v)溶液。在室温下将PVA分散在PBS中并升温至45℃以促进溶解。将此含PVA的溶液放至室温备用。
将1.78g低分子量聚已内酯(Polysciences)溶解在大约50ml二氯甲烷中。向该聚合物溶液内加入0.02g棕榈酸。再向该聚合物一脂肪酸溶液内加入0.20g气流磨碎的生长激素生成素，并经轻轻搅拌和超声处理约1分钟使活性生长激素生成素分散成基本颗粒大小。将聚合物溶液/生长激素生成素悬浮液加到搅拌的含PVA之DulbeccoPBS的旋流中。使用400mlPyrex烧杯和塑料3叶片搅拌器与旋柄包含和搅拌水包油型乳剂。持续搅拌过夜以完全蒸发掉二氯甲烷。经真空过滤回收所得的微颗粒并放在干燥器内的干燥皿中真空干燥。回收到1.89g干燥的微颗粒并按下列大小范围(美国标准)筛分＞60目-0.03g60-120目-1.15g＜120目-0.74g实施例20含10%生长激素生成素的聚(已内酯)-棕榈酸(5%)微颗粒使用聚(已内酯)和从含聚乙烯醇(PVA)之Dulbecco磷酸盐缓冲盐水(PBS)中蒸发溶剂的微颗粒制备技术制备含生长激素生成素的微颗粒。向250ml Dulbecco PBS(无CaCl2)中，加入1.0gAirProductsAirvol205聚乙烯醇以制备PVA在PBS中的0.4%(w/v)溶液。在室温下将PVA分散在PBS中并升温至45℃以促进溶解。将此含PVA溶液放至室温备用。
将1.70g低分子量聚(已内酯)(Polysciences生产)溶解在大约50ml二氯甲烷中。向该聚合物溶液内加入0.10g棕榈酸。再向该聚合物-脂肪酸溶液内加入0.20g气流磨碎的生长激素生成素，并经轻轻搅拌和超声处理约1分钟使活性生长激素生成素分散成基本颗粒大小。将聚合物溶液/生长激素生成素悬浮液加到搅拌的含PVA之DulbeccoPBS的旋流中。使用400mlPyrex烧杯和塑料3叶片搅拌器与旋柄包含和搅拌水包油型乳剂。持续搅拌过夜以完全蒸发掉二氯甲烷。经真空过滤回收所得微颗粒并放在干燥器内的干燥皿中真空干燥。回收到1.93g干燥的微颗粒并按下列大小范围(美国标准)筛分＞60目-0.01g60-120目-1.06g＜120目-0.82g实施例21含10%生长激素生成素的聚(已内酯)-棕榈酸(10%)微颗粒使用聚(己内酯)和从含聚乙烯醇(PVA)之Dulbecco磷酸盐缓冲盐水(PBS)中蒸发溶剂的微颗粒制备技术制备含生长激素生成素的微颗粒。向250ml Dulbecco PBS(无CaCl2)中加入1.0g Air Products Airvol205聚乙烯醇以制备PVA在PBS中的0.4%(w/v)溶液。在室温下将PVA分散在PBS中并升温至45℃以促进溶解。将此含PVA溶液放至室温备用。
将1.60g低分子量聚(已内酯)(Polysciences公司生产)溶解在大约50ml二氯甲烷中。向该聚合物溶液内加入0.20g棕榈酸。向所得聚合物-脂肪酸溶液内加入0.20g气流磨碎的生长激素生成素，并经轻轻搅拌和超声处理约1分钟使活性生长激素生成素分散成基本颗粒大小。将聚合物溶液/生长激素生成素悬浮液加到搅拌的含PVA之DulbeccoPBS的旋流中。使用400mlPyrex烧杯和塑料3叶片搅拌器与旋柄包含和搅拌水包油型乳剂。持续搅拌过夜以完全蒸发掉二氯甲烷。经真空过滤回收所得微颗粒并放在干燥器内的干燥皿中真空干燥。回收到1.91g干燥的微颗粒并按下列颗粒大小范围(美国标准)筛分＞60目-微量60-120目-1.71g＜120目-0.69g实施例22生长激素生成浓度对释放曲线的影响使用按前述实施例制备的微颗粒确定不同PLA/PGA微颗粒中生长激素生成素(LY293404)浓度所带来的影响。根据成年猪体内尿液尿素氮排泄量和血清生长激素水平检测释放特征。将微颗粒配制品加在使用2%(w/v)羧甲基纤维素钠330(NaCMC)(在Nano-pureⅡ纯化水中)制成的悬液中。将此悬浮液经皮下注入猪的胁腹部。制备下列处理(Trt)材料TrtA水作为对照;
Trt B5%生长激素生成素PLA/PGA(85∶15)微颗粒(60-120目，MW＝90，900，在30℃，CHCl3中粘度＝0.58dL/g)悬浮在含有2%(w/v)Na CMC 330的水中，给出42mg生长激素生成素/动物的剂量;
Trt C10%生长激素生成素PLA/PLG(85∶15)微颗粒(60-120目，MW＝90，900，在30℃，CHCl3中粘度＝0.58dL/g)悬浮在含2%(w/v)NaCMC 330的水中，给出42mg生长激素生成素/动物的剂量。
Trt D25%生长激素生成素PLA/PLG(85∶15)微颗粒(60-120目，MW＝90，900，在30℃，CHCl3中粘度为0.58dL/g)悬浮在含有2%(w/v)NaCMC 330的水中，给出42mg生长激素生成素/动物的剂量。
这项研究的结果证明微颗粒延长释放所含肽的效率。尿氮降低是由微颗粒中释放之生长激素生成素所刺激的生长激素水平的度量标准。如图3中所示，在处理的前6天内，所有用微颗粒处理的猪所排泄的尿液尿素氮均降低。最高负载量(25%)的微颗粒降低最大，而最低负载量(5%)的微颗粒降低最小。图4显示了微颗粒处理的猪血清生长激素的直接测量结果，进一步为长时间从微颗粒中延迟释放生长激素生成素提供了证据。图中的垂直栏代表相对标准偏差。
实施例24不同PLA/PGA微颗粒配方之生长激素生成素的释放曲线使用按照前述实施例制备的微颗粒，确定如根据成年猪体内尿液尿素氮排泄量和血清生长激素水平所测知的，以不同的PLA/PLG微颗粒配方给药时生长激素生成素(LY293404)的释放特征。将微颗粒配制物放在使用2%(w/v)羧甲基纤维素钠(NaCMC)330(溶在Nano-pureⅡ纯化水中)制成的悬浮液中。经皮下将悬浮液注射到胁腹部。制备下列处理(Trt)材料TrtA水作为对照;
TrtB生长激素生成素(3μg/kg/天;每天注射两次)作为阳性对照;
Trt C11.7%生长激素生成素PLA/PLG(50∶50)微颗粒(60-120目，MW＝60，700)悬浮在含有2%(w/v)NaCMC 330的水中，给出22.68mg生长激素生成素/动物的剂量。
Trt D11.4%生长激素生成素PLA/PLG(50∶50)微颗粒(60-120目，MW＝29，000)悬浮在含有2%(w/v)NaCMC 300的水中，给出7.56mg生长激素生成素/动物的剂量。
Trt E11.4%生长激素生成素PLA/PLG(50∶50)微颗粒(60-120目，MW＝29，000)悬浮在含有2%(w/v)NaCMC 300的水中，给出22.68mg生长激素生成素/动物的剂量。
Trt F13.6%生长激素生成素PLA/PLG(85∶15)微颗粒(60-120目，MW＝90，900)悬浮在含有2%(w/v)NaCMC330的水中，给出7.56mg生长激素生成素/动物的剂量。
Trt G13.6%生长激素生成素PLA/PGA(85∶15)微颗粒(60-120目，MW＝90，900)悬浮在含有2%(w/v)NaCMC 330的水中，给出22.68mg生长激素生成素/动物的剂量。
如图5和6中所示，在整个15天期间生长激素生成素注射(BID)的阉公猪(barrow)均有尿中尿素氮排泄降低和血清GH水平升高。处理的前6天所有被微颗粒处理的猪均可见尿中尿素氮排泄较少而血清GH水平升高。在处理后大约9天尿中尿素氮排泄和血清GH水平回到基线水平。
虽然上文已详细描述了本发明，但这些描述是作为举例说明而不是限制本发明的特征;应明确的是，这里只示出并描述了优选实施方案，而所有落入本发明的构思和范围内的改变与修饰也应得到保护。
权利要求
1.微颗粒用于制造适于注射到卵内的可注射配制品，所说的卵除在其一端有膜限定空泡外还包括外膜和内膜及膜间的液体，所说的微颗粒的大小和密度可使其通过膜间液体迁移到卵中与气泡相对的一端。
2.权利要求1的应用，其中微颗粒适于被注射到气泡位于顶端的卵的气泡内，并且该微颗粒具有至少与膜间的液体一样致密的密度。
3.权利要求1或2的应用，其中微颗粒平均大小小于约500微米。
4.权利要求1-3中任一项的应用，其中微颗粒用于输送选自生长激素释放因子、生长激素释放因子的合成类似物及其有药理学活性的片段的生物学活性剂。
5.权利要求1-4中任一项的应用，其中微颗粒包含选自聚丙交酯聚合物、聚乙交酯聚合物和乳酸与羟乙酸之共聚物的聚合物。
6.制备生物可降解的、含生物学活性剂之聚酯微颗粒的方法，该方法包括a.将聚酯溶解在有机溶剂中;b.向步骤(a)的溶液内加入水溶性生物学活性剂，以形成悬浮液;c.将步骤(b)的悬浮液乳化到生物活性剂在其中不可溶的含水介质中;d.从乳液中蒸发出溶剂以产生微颗粒;并且e.收集微颗粒。
7.以权利要求6的方法制备的生物可降解的聚酯微颗粒组合物。
8.权利要求7的组合物，其中生物活性剂选自生长激素释放因子、生长激素释放因子的合成类似物、以及其药理学活性片段。
9.权利要求7或8的组合物，其中聚酯是选自单一乳酸之聚合物、乳酸和羟乙酸的共聚物、这些聚合物的混合物，这些共聚物的混合物以及这些聚合物和共聚物的混合物的聚交酯。
全文摘要
本发明公开了向卵内投用生物制剂的方法，该方法包括提供加在颗粒载体中的制剂并将该载体注射到卵的气泡中。卵最好保持在垂直位，使气泡在顶端以利于颗粒载体在限定气泡的内和外膜之间迁移，达到卵的较低端。颗粒载体将生物制剂释放到周围液体和血管内。另外，载体被包含在孵化后的鸟体内，因而能继续向孵化后鸟体内释放生物制剂。本发明还公开了含有生物活性多肽制剂之聚酯微颗粒组合物和制备该组合物及投用生物活性剂的方法。
文档编号A61K38/25GK1097984SQ94105759
公开日1995年2月1日 申请日期1994年5月25日 优先权日1993年5月27日
发明者L·S·克拉夫特, T·H·费古森, M·L·海曼, W·W·汤普森 申请人:伊莱利利公司