专利名称：生产重建脂蛋白的方法
技术领域：
本发明涉及以工业规模由载脂蛋白和脂类生产重建高密度脂蛋白(rHDL)的方法。rHDL具有如下性质在生物体内与脂类和类脂物质结合，能够转运这些物质并能影响其活性。因此，rHDL可用于对与脂类和类脂物质有关的疾病进行各种预防和治疗。
人血液中的脂蛋白能够使一系列的各种功能。脂蛋白的一种经过详细研究而为人所熟知的功能是转运脂类。脂蛋白具有与不溶性脂类结合、在水性环境中转运这些脂类并将其带至其目的地的能力。有时把个别的几类脂蛋白与脂代谢失调较为紧密地联系起来进行研究。在多数西方国家中，流行病学研究表明心血管病与血浆胆固醇高或低密度脂蛋白胆固醇(LDL胆固醇)高之间有正相关关系，与HDL高或HDL胆固醇高之间有负相关关系。虽然在市场上可以买到已证明有降脂效果的全套药物，但可以想象，在某些病例中宜置换合适的脂蛋白。在这些病例中，合适的脂蛋白首先就是“好”脂蛋白，如HDL或HDL样颗粒，例如由分离的载脂蛋白和合适的脂类得到的重建HDL(rHDL)。
除了由食物摄入的脂类外，还可以转运或结合由其他脂类或类脂物质得到的脂蛋白。例如，死细胞的一些组分能与脂蛋白结合并被赋予新的功能。类脂物质如脂多糖(LPS)也可以与脂蛋白结合。脂多糖或内毒素是革兰氏阴性菌细胞膜的组分。如果有足够大量的内毒素能够进入心血管系统，就会导致脓毒性休克甚至死亡。由于LPS与脂蛋白结合，可以调节改变LPS的功能或活性。通过加入脂蛋白或脂蛋白样颗粒，可以在体内或体外显著改变LPS活性。例如在体内可以证明加入重建HDL后抑制了肿瘤坏死因子(TNF)的形成，而肿瘤坏死因子是脓毒症的一种重要介体。在体内，通过给予HDL或rHDL可使休克症状大大减轻。
除了脂蛋白或重建脂蛋白与脂类或类脂物质的相互作用外，文献中还描述了脂蛋白与蛋白的相互作用脂蛋白能参与补体系统个别组分的相互作用，并因此而影响其活性;
同样，已知凝血系统的一些组分也存在于脂蛋白部分中，也就是说，这些组分与某些脂蛋白相关联;
在HDL部分中发现了急性期蛋白，如血清淀粉状蛋白A(SAA);
此外，某些蛋白在表面上的吸附会由于用蛋白预处理而受到影响。
通过与细胞的特异性或非特异性结合，脂蛋白也能影响细胞活性血小板被激活的能力会由于HDL的结合而下降，也会由于加于LDL而受到刺激;
单核细胞和巨噬细胞同样具有脂蛋白受体，脂蛋白的结合或吸收会引起这些细胞活性的变化;
参与宿主防御系统的其他细胞如中性白细胞的活性，也同样会由于脂蛋白的结合而得到改变或调节;
此外，用成胶质细胞瘤细胞作例子表明，肿瘤细胞的生长也会由于脂蛋白而受到影响。
在科技文献中还可以找到描述脂蛋白与病原体相互作用的报道。例如，据说脂蛋白有一种抗微生物活性。现已证明，也可以借助脂白使病毒影响。
在科技文献中还可以找到描述脂蛋白与病原体相互作用的报道。例如，据说脂蛋白有一种抗微生物活性。现已证明，也可以借助脂蛋白使病毒灭活，或者(以锥虫为例)可以使寄生虫受到影响或分别受到抑制。
这些例子表明了将脂蛋白或rHDL用于预防或治疗应用的多种可能性。
脂蛋白分为四大类乳糜微粒、VLDL(极低密度脂蛋白)、LDL(低密度脂蛋白)和HDL(高密度脂蛋白)，其中乳糜微粒是主要由甘油三酯组成的颗粒，正常情况下只在进食脂肪性食物后较大量地出现在血浆中。上述命名方法源于利用超离心来分离脂蛋白的方法。经典方法用密度梯度来分离脂蛋白。这种方法只能以实验室规模应用，因为它需要专门的装置且耗时很长。用这种方法在几天内至多只能制得几百毫克脂蛋白或载脂蛋白。分离载脂蛋白或脂蛋白的其他方法也曾一度为人所知，这些方法在许多情况下都是基于沉淀法，例如借助二价阳离子和/或聚乙二醇或葡聚糖进行沉淀。分离载脂蛋白的另一个可能方法是如欧洲专利EP0329605B1所述利用醇分级分离法进行沉淀。利用最后提到的这种方法，有可能分离出较大量的载脂蛋白A-Ⅰ(apoA-Ⅰ)或富含apoA-Ⅰ的部分，并使其可供在治疗上应用。利用如此分离出的apoA-Ⅰ或富含apoA-Ⅰ的蛋白部分已进行了一系列实验，既有用动物也有用人进行的实验。根据这些实验，不仅可以证明这些产品就病毒而言的安全性，而且apoA-I的使用形式不会在人或动物体内引起明显的副反应。尽管如此，在体外试验中却一种所希望的活性也测不出，例如测不出胆固醇转运或apoA-Ⅰ对诸如中性白细胞、巨噬细胞、单核细胞或血小板的作用。在动物体和人体内进行的体内试验中，都观察到apoA-Ⅰ在血浆中的半寿期很短。由于游离apoA-Ⅰ的分子量小(28000道尔顿)，存在apoA-Ⅰ被肾脏排出的可能。实际上，在家兔尿可检测到apoA-Ⅰ。这些结果证实，大量输注的apoA-Ⅰ并不分布到所希望的脂蛋白部分中。由于其半寿期短，apoA-I的体内作用至多也只能持续很短的时间。因此，要通过以脂蛋白或脂蛋白样颗粒输注apoA-I来实现一种更为合适的施用形式。
生产重建脂蛋白的方法已在科技文献中有描述，尤其是生产载脂蛋白A-Ⅰ、A-Ⅱ、A-Ⅳ、apoC和apoE的方法(A.Jonas，Methods in Enzymology 128∶553-582，1986)。最常用于重建的脂是由卵或大豆中提取出的磷脂酰胆碱。也使用其他磷脂以及诸如甘油三酯或胆固醇等脂类。重建时，将脂类先溶于有机溶剂，然后在氮气下蒸发。在该方法中，脂以薄膜状粘在玻璃壁上，然后加入载脂蛋白和一种去污剂(通常是胆酸钠)并混合。加入的胆酸钠使脂分散。经过合适的保温期后，将混合物用大量的缓冲液透析较长的时间，从而除去大部分胆酸钠，同时脂类和载脂蛋白自发地自身形成脂蛋白或所谓的重建脂蛋白。作为透析法的替代方法，可以利用能吸附去污剂的疏水性吸附剂(Bio-Beads SM-2，Bio-Rad;Amberlite XAD-2，Rohm & Haas)(E.A.Bonomo，J.B.Swaney，J.Lipid Res.，29∶380-384，1988)，也可以利用凝胶色谱法(Sephadex G-25，Pharmacia)除去去污剂。还可以不用去污剂来生产脂蛋白，例如通过将合适脂的水性悬浮液与载脂蛋白一起保温，在载脂蛋白中加入溶于有机溶剂中的脂并对该混合物另外加热或不另外加热，或者通过对apoA-Ⅰ脂混合物进行超声处理。利用这些方法，由(例如)apoA-Ⅰ和磷脂酰胆碱起始，可以得到相应于新生态脂蛋白的盘形颗粒。通常在保温后利用离心法或凝胶色谱法分离未结合的载脂蛋白和游离脂，以分离出均一的重建脂蛋白颗粒。
美国专利5，128，318描述了一种生产重建HDL的方法，该方法借助有机溶剂将磷脂酰胆碱溶于一种溶液中。
上述的生产重建脂蛋白的方法，只适于几毫克到至多几克的较小量实验室规模生产，原因如下
溶液在中间产品中的高度稀释使混合物不可能在要求的时间内进行加工;
通常得不到大体积所必需的基础结构;
所用的有机溶剂对环境有害;
最终产品不能贮存;
最终产品的浓度过低，因此给患者输注的体积将会过大;
产品通常必须进一步纯化，例如利用凝胶色谱法从所要的rHDL颗粒中分离出残留的游离脂和/或游离蛋白。
另外，A.Hubsch等人(Circulatory Shock 40∶14-23，1993)描述了一种生产重建脂蛋白的方法，该方法采用的载脂蛋白与脂比例为1∶200。该方法的结果是所得的产品含有可观的一部分游离脂，这对其治疗应用有不利影响。
就rHDL在人体中的治疗或预防应用而言，rHDL的剂量必须以克计才能使apoA-Ⅰ或HDL的血浆水平显著提高。因此，用上述方法不可能以千克规模或更大规模经济地生产出用于临床目的的rHDL。
因此，本发明的目的是提供一种生产不具有上述缺点的rHDL的方法，具体地说，该方法的产品不含大部分游离脂或游离apoA-Ⅰ。本发明的另一个目的是提供一种不加有机溶剂就能够进行的方法。现已发现，利用简单、快速且在工业上适用的手段，能够由载脂蛋白和脂类生产出重建脂蛋白，尤其是重建HDL(rHDL)。
所以，本发明的主题是一种由载脂蛋白和脂类工业生产含重建脂蛋白颗粒的制备物的方法，该制备物在蛋白含量为20±2g/l，温度为20℃±2℃时的浊度小于40NTU(比浊法浊度单位)，其中，在不加有机溶剂的条件下，使浓度为1-40g蛋白/升的载脂蛋白水溶液与脂-去污剂水溶液混合，脂与去污剂的摩尔比在1∶0.5至1∶4.0范围内，载脂蛋白与脂的重量比在1∶1.5至1∶5.0范围内，所得的载脂蛋白-脂-去污剂混合物随后在脂在水中的相转变温度±10℃范围内的温度下保温，利用排阻法或吸附剂吸附法分离去污剂，直到形成直径5-50nm、分子量50000至1000000道尔顿的蛋白-脂颗粒，其中，如果不经过进一步的纯化步骤，有大于95%的所用蛋白与大于90%的总脂结合。
本发明的主题也是一种由载脂蛋白和脂类工业生产含重建脂蛋白颗粒的稳定冰冻干燥物的方法，其中，不必加入有机溶剂，使浓度为1-40g蛋白/升的载脂蛋白水溶液与脂-去污剂水溶液混合，脂与去污剂的摩尔比在1∶0.5至1∶4.0范围内，载脂蛋白与脂的重量比在1∶1.5至1∶5.0范围内，所得的载脂蛋白-脂-去污剂混合物随后在脂在水中的相转变温度±10℃范围内的温度下保温，利用排阻法或吸附剂吸附法分离去污剂，直到形成直径5-50nm、分子量50000至1000000道尔顿的蛋白-脂颗粒，其中，如果不经过进一步的纯化步骤，有大于95%的所用蛋白与大于90%的总脂结合，得到一种流体产品，该产品在蛋白含量为20±2g/l，温度为20℃±2℃时的浊度小于40NTU，所得产品利用选自碳水化合物如蔗糖或甘露醇的稳定剂通过冰冻干燥来稳定化。
所用的载脂蛋白有例如，重组载脂蛋白、由人血浆载脂蛋白A-Ⅰ的浓缩部分得到的载脂蛋白、载脂蛋白片段、或具有两亲性质的天然、合成或重组多肽。载脂蛋白的片段可以通过天然或合成载脂蛋白的化学或酶断裂来制取。作为化学断裂的实例，可以提出用溴化氰处理，作为酶断裂的实例，可以提出蛋白酶，如胰蛋白酶。
本发明所用的脂-去污剂溶液中所含的脂的例子有可来源于大豆或卵的磷脂、胆固醇、胆固醇酯、脂肪酸或甘油三酯。去污剂优选胆酸或其盐，例如胆酸钠或脱氧胆酸钠。
本说明书中给出的温度20±2℃包括落在18℃至22℃范围内的所有值。蛋白含量20±2g/l包括18g/l至22g/1范围内的所有浓度。术语“相转变温度±10℃”包括落在低于相应脂在水性环境中的相转变温度10℃的温度到高于该脂的相转变温度10℃的温度之间这一范围内的所有温度。这些温度值涵盖了从溶液的冰点到50℃之间的范围，其中优选低于25℃的温度。
优选的起始材料是由人血浆纯化出来的脂蛋白，该脂蛋白已用合适的手段如巴氏消毒法进行过病毒灭活。通过该方法产生的变性蛋白(聚集体)随后通过在弱碱性pH和略高的温度下保温而得以复性，保温过程在一种离液序列高的组分如脲或盐酸胍存在下进行，从而在蛋白于10mMNaCl中进行缓冲液交换后，有大于70%的apoA-Ⅰ呈单体形式(利用分析排阻色谱法测定将40μg apoA-Ⅰ加到TSKG3000SWUltropac柱(LKB)上，缓冲液为10mM磷酸钠、0.02%叠氮钠，pH7.4;流速为0.4ml/分;在280nm处测定流出液)。
在进一步的加工过程中，将高浓度的脂蛋白与脂(诸如磷脂酰胆碱等磷脂、胆固醇、甘油三酯等)在胆酸或其盐(如胆酸盐、脱氧胆酸盐、乌索脱氧胆酸盐)的溶液中的溶液混合，溶液中不含有机溶剂。与Hubsch等人(Circulatory Shock 40∶14-23，1993)所述的工作不同的是，载脂蛋白与脂的比例的选择方式是使终产物中既没有大量的游离脂，也没有大量游离载脂蛋白，因此使可以不对rHDL进行进一步的纯化。具体地说，apoA-Ⅰ磷脂酰胆碱比例降低了，该比例明显低于1∶200(摩尔比;重量比约为1∶5.5)，即降低到1∶50至1∶180范围内的比例，优选1∶100至1∶150(摩尔比;对apoA-Ⅰ和大豆磷脂酰胆碱而言相应的重量比为1∶2.8至1∶4.2)。这一做法与透滤法相结合，致使游离脂的含量(利用排阻色谱法、Superose6凝胶过滤法定量测定，见下文)急剧下降，同时也使终产物中的胆酸浓度大大降低。高浓度的胆酸和高含量的游离磷脂酰胆碱都能在体外和体内造成细胞损伤，因此必须对其加以准确控制。一方面，胆酸盐浓度要针对apoA-Ⅰ磷脂酰胆碱比例进行优化，同时又要在必要时与脂尤其是胆固醇的额外加入相适应。这里的最佳浓度也是通过在终产物中取尽可能少量的游离脂和游离apoA-Ⅰ来测定的。对apoA-Ⅰ磷脂酰胆碱比例为1∶150的rHDL制备物来说，测得胆酸钠的摩尔比为1∶200(即，在将要叙述的保温过程中apoA-Ⅰ磷脂酰胆碱胆酸钠＝1∶150∶200(摩尔比))。于0℃-2℃下保温4-16小时后(对大豆磷脂酰胆碱而言)利用透滤法降低胆酸浓度，所用超滤膜的孔径相应于1000到10000道尔顿，优选30000道尔顿以下的球蛋白。因此，必要的缓冲液具有低于100毫摩尔/升，优选低于10毫摩尔/升的低离子强度，其pH高于6，优选7.5-9，并含有低浓度的碳水化合物，例如1%蔗糖。在这些条件下，每克蛋白使用1升至最多2升缓冲液就足以一方面达到必要的低去污剂浓度，另一方面达到要求的粒度分布。这些缓冲液体积比以前所述的方法小许多倍(10-200倍)。必要时，用一个额外的Amberlite XAD-2吸附步骤将去污剂浓度降低至要求的浓度。利用前面提到的透滤技术，将产物调至10-50g蛋白/升的高浓度，然后在稳定剂如蔗糖存在下加工成稳定的、耐贮存的终产物(流体或经过冰冻干燥的)。冰冻干燥物在使用前用水溶解，得到澄清的、略呈乳色的溶液，该溶液依其脂含量而呈浅黄色。在该溶液中，加工后测定的rHDL颗粒(盘形)可以以实际上不变的形式重新检测到。利用排阻色谱法，测出小于10%比例的聚集体(大部分是游离脂)和小于5%比例的游离载脂蛋白。冰冻干燥前后测定的流体终产物的浊度，在蛋白浓度为20g/l时为40NTU以下。用酶显色测定法测得的胆酸盐含量通常小于每克蛋白0.5g胆酸钠(胆酸的检测是借助3-α-羟基类固醇脱氢酶通过在NAD+存在下形成NADH来进行，所形成的NADH在心肌黄酶催化下与硝基四唑蓝反应，形成蓝色的甲替衍生物，再用光度法检测)。
冰冻干燥rHDL在溶解于适当体积的溶剂(优选水)中后，通过电子显微镜观察发现，rHDL的存在形式为与新生HDL类似的盘形颗粒，其直径为5-50nm，通常为8-20nm，厚度为2-6nm。利用测定粒度及其相对分布的分析方法，例如用Superose 6HR10/30柱(Pharmacia Biotech)在生理缓冲液中进行凝胶过滤(排阻色谱)，测得大于80%的颗粒处于10000至1000000道尔顿的分子量范围内。同样，根据梯度凝胶电泳(A.V.Nichols等人的方法，见Methods in Enzymology 128∶417-431，1986)结果，大于80%的颗粒的分子量分布在50000至1000000道尔顿范围内。
附图
有助于更好地理解本发明，并支持上述的实施方案。该附图显示了用不同apoA-Ⅰ与磷脂酰胆碱比例生产的rHDL颗粒的凝胶过滤洗脱图(吸收-洗脱对时间作图)。[apoA-Ⅰ和rHDL颗粒的高效排阻色谱;在用PBS(10mM磷酸钠、150mM NaCl，pH7.4)平衡的Superose 6HR10/30柱(Pharmacia Biotech)上分离100μl 0.9%NaCl中的200μg rHDL，流速为0.5ml/分]。在280nm处测定柱流出液的光吸收(L.L.Rudel，C.A.Marzetta和F.L.Johnson，Methods in Enzymology 129∶45-57，1986)。为确定色谱图中各部分的含量，计算曲线下的面积。由1∶200产物的洗脱曲线可见，洗脱开始时游离脂被洗出，而1∶100-1∶150产物则不是这样。作为比较，同样也画出了纯载脂蛋白(apoA-Ⅰ)的曲线。
下列实施例进一步说明本发明，但这些实施例不应认为是限制本发明的定义。
实施例1将1kg apoA-Ⅰ溶解于500升0.15摩尔/升NaCl中。另外如下制备脂溶液将大豆油磷脂酰胆碱(Phospholipon 90 ，Nattermann，Cologne，Germany)溶解于由10毫摩尔/升Tris/HCl、150毫摩尔/升NaCl、1毫摩尔/升EDTA组成的缓冲液(pH8.0)中，将2.8Kg磷脂酰胆碱和2.325Kg胆酸钠溶于上述缓冲液使体积为100升。搅拌1-2小时，必要时加热至约40℃，直到溶液澄清。然后冷却到4℃，使100升该脂-胆酸盐溶液与1kg apoA-Ⅰ混合使体积达到500升。将混合物于2-4℃下缓慢搅拌过夜。经过这一保温过程后进行过滤灭菌，并用带有PTGC槽的Pellicon于4℃下透滤，该透滤装置的额定分子量极限(NMWL)为10000道尔顿。透滤时先用4倍体积的5毫摩尔/升碳酸氢钠，然后再用2倍体积的10%蔗糖，并保持产物的体积恒定。然后缓慢提高浓度，直到蛋白浓度达到20g/l。将溶液再次过滤灭菌并装入小瓶中，然后进行冰冻干燥。在整个操作过程中要特别小心保护脂溶液使其不接触空气、光和过高的温度。终产物溶于适量的水中之后得到20±1g/l的蛋白浓度，该产物的apoA-Ⅰ与磷脂酰胆碱的摩尔比为1∶100，游离脂少于5%，浊度小于40NTU。
实施例2将10kgapoA-Ⅰ溶解于2000升10毫摩尔/升NaCl中。将1.38kg胆固醇和29.9kg胆酸钠置于200升缓冲液中搅拌，该缓冲液中含有10毫摩尔/升Tris-HCl、150毫摩尔/升NaCl、1毫摩尔/升EDTA，pH8.0。将温度提高到65℃，将混合物搅拌2小时直到得到澄清溶液。然后冷却到20℃，加入27.9kg磷脂酰胆碱。然后将溶液冷却到4℃，再搅拌2小时。将该混合物加到蛋白溶液中，混合后过滤灭菌。于4℃下将滤液缓慢搅拌过夜(至少16小时)。然后保持产物的体积恒定，用4倍体积的50毫摩尔/升NaCl、1毫摩尔/升EDTA，pH7.5透滤2-4小时，然后用2倍体积的10%蔗糖进行透滤。然后将溶液的浓度提高到蛋白浓度为20g/l。然后将溶液过滤灭菌，装入玻璃小瓶内并冰冻干燥。将小瓶真空密封并在4℃下置于暗处。用这一方法以apoA-Ⅰ∶磷脂酰胆碱胆固醇摩尔比为1∶100∶10的摩尔比得到rHDL。
实施例3以apoA-Ⅰ∶磷脂酰胆碱为1∶150比例生产rHDL将3.08kg胆酸钠溶解于25升缓冲液中，该缓冲液为10毫摩尔/升Tris-HCl、10毫摩尔/升NaCl、1毫摩尔/升EDTA，pH8.0。在该溶液中于室温下再溶解4.2kg磷脂酰胆碱。然后加入1kgapoA-Ⅰ在200升10毫摩尔/升NaCl中的溶液，将该混合物于0-4℃下保温过夜。然后以恒定的体积进行透滤，先用4倍体积的50毫摩尔/升NaCl、1毫摩尔/升EDTA，pH7.5透滤4小时，再用2倍体积的1%蔗糖进行透滤。最后将浓度提高到20g/l蛋白。再加入一些固体蔗糖使蔗糖浓度提高到10%。将该溶液过滤过菌并冰冻干燥。
实施例4以apoA-Ⅰ∶磷脂酰胆碱胆固醇为1∶100∶10的比例生产rHDL将4.61kg胆酸钠溶于25升缓冲液中，该缓冲液含有10毫摩尔/升Tris-HCl、10毫摩尔/升NaCl、1毫摩尔/升EDTA，pH8.0。于65℃下将138g胆固醇溶解于此缓冲液-胆酸盐混合物中2小时。然后将该混合物冷却至室温，在其中溶解2.8kg磷脂酰胆碱1小时。加入1kgapoA-Ⅰ在200升10毫摩尔/升NaCl中的溶液。将该混合物如前一实施例所述进行保温，同样进行透滤，并如上所述提高浓度。
实施例5apoA-Ⅰ∶磷脂酰胆碱∶胆固醇比例为1∶150∶10∶将5.38kg胆酸钠溶解于实施例3和4所述的缓冲液中。于65℃下在该溶液中溶解180g胆固醇2小时。然后加入4.2kg磷脂酰胆碱，并于室温下溶解1小时。将该混合物加到200升5g/lapoA-Ⅰ在10毫摩尔/升NaCl中的溶液中，并于4℃下保温过夜。如上所述透滤并生产出终产物。
实施例6以低胆酸钠含量生产rHDL。如实施例1-5所述生产出rHDL。在经过透滤并提高浓度后，将1倍体积的rHDL溶液与Amberlite XAD-2(2倍体积)混合，在充分混合的同时将该混合物于4℃下保温1小时。保温后，如实施例1-5所述过滤分离出rHDL，过滤灭并冰冻干燥。
实施例7将400gapoA-Ⅰ在80ml10毫摩尔/升NaCl中的溶液与一种脂溶液混合，所述脂溶液由1.66kg磷脂酰胆碱、1.23kg胆酸钠在实施例3-6中所述的缓冲液中构成。将该混合物于0-2℃下保温16小时。然后先用4倍体积的EDTA(0.1毫摩尔/升)，再用2-4倍体积的蔗糖(1%)进行透滤，最后将浓度提高到蛋白浓度为21-25g/l。然后把rHDL溶液调至终浓度为10%蔗糖和20g/l蛋白。过滤灭菌后以50g为一份分装(50ml小瓶中装1grHDL)，并冰冻干燥。
实施例8用醇沉淀法由980kg沉淀Ⅳ(Kistler，P.，Nitschmann，H.;Vox Sang，7∶414-424，1962)制得11.2kg沉淀apoA-Ⅰ。将其悬浮于3倍体积的4M盐酸胍溶液中。将pH调至5.2，将溶液于60℃下巴氏灭菌10小时。在pH7.5和45℃下使蛋白溶解。过滤后，利用Sephadex G-25(Pharmacia Biotech)凝胶过滤法，与10mMNaCl溶液进行缓冲液交换。得到总共含1040gapoA-Ⅰ的160kgapoA-Ⅰ溶液。在0-2℃下使蛋白溶液与脂溶液一起保温2-16小时。脂溶液是在室温下用以下方法另外制备的将大豆油磷脂酰胆碱溶解于实施例3-7所述的缓冲液中。在26kg该缓冲液中溶解3203g胆酸钠和4460g磷脂酰胆碱。在后续的透滤中(NMWL＝10000道尔顿)，先将蛋白-脂混合物的浓度提高到7g蛋白/升。然后用1%蔗糖溶液进行透滤，直到胆酸盐含量达到小于4g/l。pH一直保持在至少7.5。最后，将溶液的浓度提高到25g/l蛋白，并加蔗糖使其稳定化。将终产物调至蛋白浓度为20g apoA-Ⅰ，蔗糖浓度为100g/l，并过滤灭菌。在排阻色谱中，测得游离脂不到5%，游离apoA-Ⅰ不到1%。将该蛋白-脂混合物以50ml为一份分装，并冰冻干燥。终产物溶于适量水中后显示apoA-Ⅰ磷脂酰胆碱的摩尔比为1∶140。
权利要求
1.一种由载脂蛋白和脂类工业生产含重建脂蛋白颗粒的制备物的方法，该制备物在蛋白含量为20±2g/l，温度为20℃±2℃时的浊度小于40NTU，其中，使浓度为1-40g蛋白/升的载脂蛋白水溶液与脂-去污剂水溶液混合，脂与去污剂的摩尔比在1∶0.5至1∶4.0范围内，载脂蛋白与脂的重量比在1∶1.5至1∶5.0范围内，所得的载脂蛋白-脂-去污剂混合物随后在脂在水中的相转变温度±10℃范围内的温度下保温，利用排阻法或吸附剂吸附法除去去污剂，直到形成直径5-50nm、分子量50000至1000000道尔顿的蛋白-脂颗粒，其中，如果不经过进一步的纯化步骤，有大于95%的所用蛋白与大于90%的总脂结合。
2.权利要求1的方法，其中脂-去污剂水溶液不含必要量的有机溶剂。
3.权利要求1的方法，其中通过排阻法或透滤法除去去污剂，每克蛋白最多使用2升缓冲液。
4.权利要求1的方法，其中在脂-载脂蛋白-去污剂混合物保温后，通过用分批吸附法或柱吸附法在疏水性吸附剂上吸附来结合去污剂。
5.权利要求4的方法，其中疏水性吸附剂是不溶性的交联聚苯乙烯共聚物。
6.权利要求1的方法，其中脂-去污剂溶液含有磷脂、胆固醇、胆固醇酯、脂肪酸和/或甘油三酯。
7.权利要求1的方法，其中作为载脂蛋白使用的是富含载脂蛋白A-Ⅰ的人血浆的一个部分，该部分已用至少一个病毒灭活步骤处理过，处理方法是先在一种含有高离液序列组分的溶液中保温，然后在离子强度小于50毫摩尔/升的溶液中进行缓冲液交换，其后有大于70%的脂蛋白呈单体形式。
8.权利要求1的方法，其中脂-去污剂溶液中主要含有磷脂作为脂组分。
9.权利要求8的方法，其中磷脂是合成的磷脂酰胆碱。
10.权利要求1的方法，其中磷脂是天然磷脂，优选从大豆或卵中提取出的磷脂。
11.权利要求10的方法，其中磷脂是大豆磷脂酰胆碱，载脂蛋白-脂-去污剂混合物的保温在0-15℃的温度下进行。
12.权利要求1的方法，其中所用的去污剂选自胆酸类或其盐。
13.权利要求12的方法，其中去污剂是胆酸钠或脱氧胆酸钠。
14.权利要求1的方法，其中载脂蛋白水溶液中含有载脂蛋白、重组载脂蛋白、得自人血浆富含载脂蛋白A-I部分的载脂蛋白、载脂蛋白片段、或合适的具有两亲性质的天然、合成或重组多肽。
15.权利要求1的方法，其中在脂-载脂蛋白-去污剂混合保温后，利用透析法或透滤法将去污剂的含量降低至浓度低于每克蛋白0.5克去污剂。
16.权利要求1的方法，其中在分离出去污剂之前或之后，利用透滤法将蛋白浓度提高到10-50g/l。
17.权利要求1的方法，其中载脂蛋白水溶液或脂-去污剂溶液被缓冲在pH6-pH9范围内的pH。
18.权利要求17的方法，其中载脂蛋白水溶液或脂-去污剂溶液被缓冲在pH7.5-pH8.5范围内的pH。
19.一种由载脂蛋白和脂类工业生产含重建脂蛋白颗粒的稳定冰冻干燥物的方法，其中，使浓度为1-40g蛋白/升的载脂蛋白水溶液与脂-去污剂水溶液混合，脂与去污剂的摩尔比在1∶0.5至1∶4.0范围内，载脂蛋白与脂的重量比在1∶1.5至1∶5.0范围内，所得的载脂蛋白-脂-去污剂混合物随后在脂在水中的相转变温度±10℃范围内的温度下保温，利用排阻法或吸附剂吸附法除去去污剂，直到形成直径5-50nm、分子量50000至1000000道尔顿的蛋白-脂颗粒，其中，如果不经过进一步的纯化步骤，有大于95%的所用蛋白与大于90%的总脂结合，得到一种流体产品，该产品在蛋白含量为20±2g/l，温度为20℃±2℃时的浊度小于40NTU，所得产品在选自碳水化合物的稳定剂存在下通过冰冻干燥来稳定化。
20.权利要求19的方法，其中脂-去污剂水溶液不含必要量的有机溶剂。
21.权利要求19的方法，其中将产品调至蛋白浓度为5-50g/l，并在5-15%二糖如蔗糖或2-10%单糖如甘露醇存在下，对溶液进行冰冻干燥以使产品稳定化。
全文摘要
由载脂蛋白和脂类生产重建高密度脂蛋白(rHDL)，其中不必加有机溶剂，使浓度为1－40g蛋白/升的载脂蛋白水溶液与脂-去污剂水溶液混合，脂与去污剂的摩尔比为1∶0.5至1∶4，脂与去污剂的重量比为1∶1.5至1∶5，所得的载脂蛋白-脂-去污剂混合物再在脂在水中的相转变温度±10℃范围的温度下保温，至少部分除去去污剂，rHDL可用于对与脂类和类脂物质有关的疾病进行各种预防和治疗。该方法特别适于工业生产。
文档编号A61P3/06GK1108662SQ94119129
公开日1995年9月20日 申请日期1994年12月31日 优先权日1993年12月31日
发明者P·勒希, G·霍德勒, V·福尔施 申请人:瑞士红十字会创立血液捐赠服务中央实验室