专利名称：一种载脂蛋白a-i的制备方法
技术领域：
本发明属生化药物制药领域，涉及载脂蛋白A-I的制备方法，具 体涉及一种从废弃的人血浆F-IV组分分离制备载脂蛋白A-I (ApoA-I) 的方法。
背景技术：
目前载脂蛋白A-I (ApoA-I)的制备仅有常规实验室制备方法。其 方法是血浆以KBr调密度至1.34g/mL，加到铺有填液的离心管，经4 °C， 166000Xg， 20h超离心，取dl.063-1.02lg/mL部分(HDL)，经透 析、浓縮后，用乙醇/乙醚脱脂，离心分离沉淀(HDL载脂蛋白)，上 清液用乙醚再次沉淀HDL载脂蛋白，合并两次沉淀，经Bio-CAD快 速蛋白分离仪，POROS HQ-20强阴离子交换树脂分离，得电泳纯 ApoA-I。
此方法缺点是①原料是人血浆，资源严重短缺；②生产量小， 每次分离量(100mL血桨)只得到25mg左右ApoA-I，不适合企业大 规模生产；③对设备要求高，需超离心机等；④收率低，约为20%。
迄今，尚无适合企业大规模生产ApoA-I的方法。
发明内容
本发明的目的是提供适合企业大规模生产ApoA-I的新方法。 本发明利用废弃的人血浆F-IV组分，经等电点沉淀、氯仿、乙醇
处理等，获得纯度98.4±2. 06%的ApoA-I，收率达23.5% (按血浆F-IV
ApoA-I含量计算)。每克湿重F-IV可制备3.1mg纯化ApoA-I，并保持
天然ApoA-I生物活性。
本发明方法克服了现有技术的缺陷，采用包括下述的关键技术，
制成纯度和收率高，并保持天然ApoA-I生物活性的载脂蛋白A-I(ApoA画I)。
① pH7.3 65 %乙醇-10mM NaHC03抽提；
② pH5.5沉淀；
③ pH8.6 100mMTris-HCl-6MUrea溶解沉淀；
氯仿/乙醇(1:1)脱脂；
⑤乙醇沉淀。
本发明所说的废弃的人血浆F-IV组分是本领域公知的有关生物制 品企业制备血制品所废弃的人血浆F-IV组分。
本发明研究结果显示，人血浆ApoA-I是一种良好的抗内毒素 (LPS)、抗炎化合物。经动物试验证实，ApoA-I对LPS血症及LPS 诱导的急性炎症肺损伤具有优越的治疗作用。其作用机理是ApoA-I能 结合、中和LPS毒性，阻断和抑制激活巨噬细胞和中性粒细胞释放的 各种炎症介质。
本发明为开发ApoA-I药用价值奠定了良好基础。提供了一种适合 工业化生产的人血浆ApoA-I制备方法。 本发明方法通过下述步骤实现。
① 原料采用血制品企业中废弃的血浆F-IV组分，F-IV用4倍体积 含乙醇、NaHC03液于-2(TC搅拌抽提，离心取上清液，
② 上清液调pH5.5，离心收集沉淀，-4"溶解于pH8.6的 Tris-HCl-Urea溶液，
③ 加等体积氯仿/乙醇液(1:1)脱脂，-20"静置，离心取上层液，
④ 加等体积乙醇，-2(TC静置，离心取上清液， 浓縮，经碳酸盐缓冲液透析，
⑥ 巴氏灭菌，除菌过滤。
⑦ 冻干，得ApoA-I干粉。
所制得的ApoA-I收率按F-IV中ApoA-I含量计算为23.5±1.72 %， ApoA-I纯度:SDS-PAGE凝胶扫描法达98.4士2.06X (见图l)， ApoA-I鉴定SDS-PAGE分子量与天然ApoA-I相同为28.3kD (图1 )， ApoA-I的Weston blotting检测呈阳性(见图2)。
本发明对所制得的ApoA-I进行生物活性检测，结果显示，
① 体外酶标板上本方法制备的ApoA-I与天然ApoA-I即按常规超离 心法从新鲜人血桨制备ApoA-I，在结合FITC标记内毒素能力上 无显著性差异(表l)，
② 体外细胞水平抑制内毒素激活的巨噬细胞释放细胞炎症因子对 共培养L-929细胞杀伤率试验(MTT法)，本方法制备的ApoA-I 与天然ApoA-I在抑制激活巨噬细胞细胞毒功能上无显著性差异
(表2)。
表1.样品ApoA-I与天然ApoA-I与FITC-LPS在酶标板上体外结合能 力比较
组别(n=3)结合FITC-LPS的荧光读数
天然ApoA-I + FITC-LPS33.91 ±12. 94
样品ApoA-I + FITC-LPS46.09±18. 91
两组之间结合FITC-LPS能力无显著性差异。 表2.样品ApoA-I与天然ApoA-I对LPS激活巨噬细胞细胞毒性抑制作用比较
(MTT法)
组别(n=3)L-929细胞存活率(％)
L-929细胞对照组100±12. 41
LPS激活巨噬细胞组52.5±7. 17"
天然ApoA-I (10吗/mL)处理组105.6±15. 48
样品ApoA-I (lO^g/mL)处理组114.7±10. 20
经Q检验，LPS激活巨噬细胞组与其余各组之间有极显著性差异 (PO.Ol)，其余各组之间无差异。
本发明方法具有如下特点
1) 本方法操作简易，对设备要求低，适用企业大规模生产。
2) 本方法利用工业废弃血浆F-IV，有利于血浆的综合利用，节省
宝贵的血资源。
3)本方法ApoA-I收率23.5X，比从新鲜血浆按常规超离心方法的 收率20%高。平均每克湿重F-IV (其中约70%是硅藻土)，可制备 3.1mg ApoA画I。
图1是样品ApoA-I纯度的SDS-PAGE鉴定，
其中，A:低分子量标准蛋白，
B: 20吗样品ApoA-I，
C; 40吗样品ApoA-I，
D: 80pg样品ApoA-I。 图2是样品ApoA-I的Weston blotting鉴定， 其中，A:低分子量标准蛋白SDS-PAGE
B:样品ApoA-I SDS-PAGE
C:样品ApoA-I Weston blotting图谱具体实施方式
实施例l
30g F-IV加120mL 65X乙醇-10mM NaHC03 (pH7.3)溶液，-20
。C搅拌2h，离心分离上清液，调上清液pH至5.5，离心分离沉淀，沉 淀完全溶解于50mL100mMTris-HCl-6MUrea (pH8.6)溶液。加等体 积-2(TC预冷的氯仿/乙醇(1:1)液，振荡均匀，-20°0:静置211。离心， 取上层液，加等体积-20。C预冷的乙醇，振荡均匀，-20匸静置2h，离 心分离上清液。将上清液浓縮并对碳酸盐缓冲液(20mM)透析，巴氏灭 菌，除菌过滤后，冻干，得ApoA-I干粉。
权利要求
1、一种载脂蛋白A-I的制备方法，其特征是包括下述步骤①采用废弃的血浆F-IV组分为原料，采用含乙醇、NaHCO3液于-20℃搅拌抽提，离心取上清液，②上清液调pH5.5，离心收集沉淀，-4℃溶解于pH8.6的Tris-HCl-Urea溶液，③加等体积氯仿/乙醇液脱脂，-20℃静置，离心取上层液，④加等体积乙醇沉淀，-20℃静置，离心取上清液。⑤浓缩，经碳酸盐缓冲液透析，⑥巴氏灭菌，除菌过滤，⑦冻干，得ApoA-I干粉。
2、 按权利要求1所述的载脂蛋白A-I的制备方法，其特征是所述 步骤1的抽提，其中采用的乙醇、NaHC03液是4倍体积的含pH7.3 65 %乙醇-10mM NaHC03液。
3、 按权利要求1所述的载脂蛋白A-I的制备方法，其特征是所述 步骤2的pH8.6的Tris-HCl-Urea溶液是pH8.6 100mMTris —HCl -6M Urea溶液。
4、 按权利要求1所述的载脂蛋白A-I的制备方法，其特征是所述 步骤3的氯仿/乙醇液其比为1:1。
全文摘要
本发明属生化药物制药领域，涉及载脂蛋白A-I的制备方法，具体涉及一种从废弃的人血浆F-IV组分分离制备载脂蛋白A-I(ApoA-I)的方法。本发明利用废弃人血浆F-IV组分经等电点沉淀、氯仿、乙醇处理获得纯度98％和按血浆F-IV ApoA-I含量计算收率高达23.5％，并保持天然ApoA-I生物活性的载脂蛋白A-I，每克湿重F-IV可制备3.1mg纯化ApoA-I，本发明为开发ApoA-I药用价值奠定了良好基础。提供了一种适合工业化生产的人血浆ApoA-I制备方法。
文档编号C07K14/775GK101108874SQ20061002911
公开日2008年1月23日 申请日期2006年7月19日 优先权日2006年7月19日
发明者吴满平, 廖雪玲 申请人:复旦大学