专利名称：用作纤维蛋白封闭剂的组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及纤维蛋白单体的组合物，尤其是涉及包含其它血液蛋白或组分的浓缩纤维蛋白单体溶液，其中纤维蛋白单体以及血液蛋白或组分均为自身固有的。这些组合物可用作，例如，纤维蛋白封闭剂。
背景技术：
美国专利5,750,657中Edwardson等描述了一种利用纤维蛋白单体组合物制备纤维蛋白封闭剂的全新方法。纤维蛋白单体是以非动力态的形式使用的，它是通过用类似凝血酶的酶对纤维蛋白原进行预处理生成的。当将它用于需要治疗的患者身上时，这种非动力状态则被逆转，以便该单体可以聚合形成一种可用作纤维蛋白封闭剂的纤维蛋白聚合物。
在使用纤维蛋白封闭剂时，纤维蛋白溶解的稳定性是令人关注的焦点之一。一般认为纤维蛋白溶解因子会过早地分解封闭剂凝块，从而得不到所需的效果。WO 93/05067中Baxter International描述了一种封闭剂组合物，此组合物中的纤溶酶原含量极低，以确保在体内的保留时间较长或稳定性较好。WO 93/05067的组合物优选不超过10μg/ml纤溶酶原。
还已知对于有效的纤维蛋白封闭剂来说，需要有较高的纤维蛋白或纤维蛋白原的预传递浓度。例如，Immuno的市售Tissucol含有约70-100mg/ml纤维蛋白原，Behringwerke的Beriplast含有约65-115mg/ml纤维蛋白原，Kaketsuken的Bolheal含有约80mg/ml纤维蛋白原，以及Baxter封闭剂包含约100mg/ml纤维蛋白原。
发明概述现已发现，包含大量纤溶酶原并且与现有技术相比含有较低浓度的纤维蛋白或纤维蛋白原的组合物可以提供有用的纤维蛋白封闭剂，这种封闭剂至少与现有技术的封闭剂相当。根据本发明，发现含有约10-30mg/ml纤维蛋白单体、约10-40μg/ml凝血酶原和约100-200μg/ml纤溶酶原的组合物非常适用于作为纤维蛋白封闭剂。这种组合物优选包括自身固有的纤维蛋白单体、凝血酶原和纤溶酶原，且可包含其它自身固有的组分。更优选通过浓缩纤维蛋白单体溶液的方法得到的组合物，其中自身固有的组分是按固有形式与纤维蛋白单体一同采集的，此组分选自纤溶酶原、凝血酶原、纤维结合素、因子XIII、因子X和抗凝血酶III中的一种或多种。发明详述本发明的新的组合物具有以下优点，即优选自身固有的组合物。因此，当与混合产品相比较时，将这些组合物用作纤维蛋白封闭剂可减少病毒传播的可能性。由于本发明组合物包括一种暂时被抑制聚合(如通过降低pH的方法)的纤维蛋白单体形式，因此，在不需要添加外原凝血酶的情况下，它们可用于患者身上而形成一种如美国专利5,750,657所述的封闭剂/纤维蛋白聚合物。应用后，这种纤维蛋白单体可以转化回到可聚合的形式，如通过将pH升回至中性，以便形成一种纤维蛋白聚合物封闭剂。虽然本发明组合物可以通过任何已知/合适的方法制备，但优选根据美国专利5,750,657所使用的方法。因此，可以从全血中分离出血浆部分，再用一种类似凝血酶的酶(可以是凝血酶)对上述血浆部分进行处理，这种酶优选凝血酵素，更优选其衍生形式，如生物素化凝血酵素，以形成一种会立即聚合成酸溶性聚合物的纤维蛋白I单体。将聚合物溶解在例如酸中，得到一种纤维蛋白单体溶液。较低的pH可抑制纤维蛋白聚合，因此可认为该纤维蛋白单体是’657专利中所述的非动力态。这种生产纤维蛋白单体溶液的方法通常会导致其中截留了其它血液因子/组分，或者它们被吸收到溶解前的聚合物中。典型的是，为了将纤维蛋白单体溶液作为纤维蛋白封闭剂的组分之一，将它与一种物质共同使用，以便催化纤维蛋白单体的聚合作用。例如，pH4的纤维蛋白单体溶液可以与碱性缓冲液例如pH10的缓冲液一同使用，从而升高纤维蛋白单体的pH，由此形成一种环境，在此环境中该单体将聚合成一种纤维蛋白聚合物即封闭剂。优选可以加入钙离子。这一点在’657专利中已描述了。突出的是，当使用本发明组合物时，共同采集的因子XIII和凝血酶原、以及钙离子，可使得因子XIII被激活、凝血酶原转化为凝血酶；而因子XIIIa、凝血酶和钙离子有助于纤维蛋白I聚合物(或单体)向纤维蛋白II聚合物、交联纤维蛋白II聚合物即优选的封闭剂凝块的转化。
因此，优选的本发明组合物是在含较低pH即pH为5或小于5的缓冲液的溶液中包含约10-30mg/ml纤维蛋白单体(I、II或des BB)。乙酸盐缓冲液或任何在美国专利5,750,657中所述的缓冲液或其它类似缓冲液都是适用的。这些优选的组合物还进一步包括10-40μg/ml凝血酶原和100-200μg/ml纤溶酶原(在正常血浆中约含50-100％纤溶酶原)。这三种组分优选自身固有者，更优选与纤维蛋白单体一同采集的组分。本发明的组合物也可进一步包括5-100μg/ml可激活的因子XIII、45-150μg/ml纤维结合素、2.0-7.0μg/ml因子X和/或50-200μg/ml抗凝血酶III。
下面实施例的表1提供了本发明的典型组合物与上述Tissucol(Immuno)和Beriplast(Behringwerke)组合物的对比。
本发明的优选组合物是方便、安全的纤维蛋白封闭剂的一部分，其中该组合物是自身固有的，且可制成本身含有其它重要因子--而不是纤维蛋白本身的组合物，它为纤维蛋白I单体转化成交联纤维蛋白II聚合物提供了必需的转化和交联。对于现有技术的封闭剂产品来说，组分的各自提取和纯化是必需的，这是由于它们是混合产品。共同采集纤维蛋白单体和其它血液组分(这可在上述的聚合/加溶制备方法中自然地进行)是一种得到极高效率的封闭剂产品的简单方法，这种产品具有增强的安全性，并且至少可与Beriplast和Tissucol相提并论。另外，当将本发明的新的组合物与一种试剂共同用于外科手术部位以提供可聚合的纤维蛋白单体(优选pH为7的缓冲溶液；纤维蛋白单体溶液缓冲液约7∶1)和钙离子时，所得到的封闭剂在不需添加抗纤溶蛋白溶解的稳定剂即抑肽酶、和/或不需要去除纤溶酶原的情况下具有可与现有技术相比的稳定性。
使用下面所述的方法可以制备本发明的组合物。该方法优选在EP654669、WO 96/16715、WO 96/16713和WO/16714所述的装置中进行。实施例1抽取120cc患者的血液与17cc用于抗凝的4％柠檬酸三钠USP混合。离心分离到约60cc血浆，通过缓缓地搅拌使它与生物素-凝血酵素在37℃反应10分钟。此生物素-凝血酵素催化纤维蛋白肽A仅从纤维蛋白原释放，而不激活因子XIII。这样就形成了酸溶性的纤维蛋白I聚合物。该纤维蛋白I聚合物通过离心而分离，并溶解在存在于钙离子中的3.5ml 0.2M的醋酸钠缓冲液(pH4)中。将与琼脂糖共价结合的亲和素加入溶液中，该溶液与生物素-凝血酵素化学地结合，然后通过过滤从纤维蛋白I聚合物中分离出生物素-凝血酵素亲和素-琼脂糖复合体。所得到的纤维蛋白单体溶液具有表1所示的组成。实施例2-24按实施例1所述处理另外二十三个血样，分析所得到的组合物。结果换算为如表1所示的范围。表1还显示了24个病人中每一组分的血浆水平，并且进一步将本发明制剂与Tissucol(Immuno)、Beriplast(Behringwerke)和Bolheal(Kaketsuken)封闭剂进行了比较。
权利要求
1.一种组合物，它包含一种含下列组分的溶液10-30mg/ml纤维蛋白单体；10-40μg/ml凝血酶原；和5-100μg/ml可激活的因子XIII。
2.权利要求1所述的组合物，其特征在于它还包括100-200μg/ml纤溶酶原。
3.权利要求1所述的组合物，其特征在于它还包括45-150μg/ml纤维结合素。
4.权利要求1所述的组合物，其特征在于它还包括2.0-7.0μg/ml因子X。
5.权利要求1所述的组合物，其特征在于它还包括50-200μg/ml抗凝血酶III。
6.权利要求1所述的组合物，其中所述组分是从单个供血者血浆中一同采集的。
7.权利要求2所述的组合物，其中所述组分是从单个供血者血浆中一同采集的。
8.权利要求3所述的组合物，其中所述组分是从单个供血者血浆中一同采集的。
9.权利要求4所述的组合物，其中所述组分是从单个供血者血浆中一同采集的。
10.权利要求5所述的组合物，其中所述组分是从单个供血者血浆中一同采集的。
11.一种制备可在患者体表或体内产生医疗用途的纤维蛋白聚合物的方法，其特征在于它包括下列步骤从上述患者中采取血样；从上述血液中采集一种溶液，它包括10-30mg/ml纤维蛋白单体、10-40μg/ml凝血酶原和5-100μg/ml可激活的因子XIII；和应用上述溶液以形成可在患者体表或体内使用的上述纤维蛋白聚合物。
12.权利要求11所述的方法，其中所述溶液还包括100-200μg/ml纤溶酶原。
13.权利要求11所述的方法，其中所述溶液还包括45-150μg/ml纤维结合素。
14.权利要求11所述的方法，其中所述溶液还包括2.0-7.0μg/ml因子X。
15.权利要求11所述的方法，其中所述溶液还包括50-200μg/ml抗凝血酶III。
16.权利要求11所述的方法，其中所述溶液是通过以下步骤形成的(a)从上述血液中分离出血浆部分；(b)用一种酶对上述血浆部分进行处理以形成一种纤维蛋白聚合物，这种酶可催化纤维蛋白肽A和/或B从上述血浆内的纤维蛋白原中裂解；(c)从如此形成的聚合物中彻底去除所有残余的血浆；和(d)溶解该聚合物以提供一种纤维蛋白单体溶液，该溶液包含一种或多种共同采集的自身固有组分。
全文摘要
本发明涉及可用于纤维蛋白封闭剂中的新的纤维蛋白单体组合物,这种组合物是包含添加的共同采集组分的溶液,该组分例如为凝血酶原和因子ⅫⅠ。对于接受这种封闭剂治疗的患者来说,此组合物优选自身固有的,该组合物也可包括共同采集的纤溶酶原、因子Ⅹ、抗凝血酶Ⅲ和/或纤维结合素。
文档编号A61P7/00GK1260720SQ98805974
公开日2000年7月19日 申请日期1998年6月9日 优先权日1997年6月9日
发明者P·A·D·爱德华森, J·E·费尔布洛特, D·A·霍林斯贝, S·A·塞德霍尔姆－威廉斯 申请人:布里斯托尔-迈尔斯斯奎布公司