人造神经管的制作方法

专利名称：人造神经管的制作方法
技术领域：
本发明涉及人造神经管。
末梢神经通过手术被切断，或由于外伤而折断的情况下，首先会尝试将断了的末梢神经的断端相互直接吻合的方法。然而，多数情况下不可能准确地将折断的神经直接吻合，只好维持折断状态。由此，朝向末梢侧欲再生的神经被缔合组织等阻隔，从而长不到末梢侧神经断端，造成断端神经肿而终止再生，其结果是多数情况下，术创或创伤被治愈后，断了的神经的功能得不到恢复，留下后遗症。在直接吻合不可能的情况下，也曾进行过自身移植的试验，即从同一患者身上切下部分功能不太重要的末梢神经，将其移植到神经折断的部分。但是，即便采用这种方法，不仅多数情况下神经功能无法充分恢复，而且采用移植神经的部位也多数功能呈低下状态。
于是，将断了的末梢神经的两个断端用管状医用材料，也就是人造神经管接起来，从干神经的中枢侧端朝向末梢侧神经断端引导轴索再生，向正确方向伸展，从末梢干神经使其到达神经筋接合部或末梢感觉接受器，通过这一原理使其断了的神经恢复功能的尝试越来越多起来了。做为人造神经管，以往试验过的有有机硅、聚乙烯、聚氯乙烯做成的非多孔性管；用拉伸聚四氟乙烯、纤维素等作成的多孔管；用聚丙烯晴及聚砜制作的半透膜管，用生物体内可降解材料聚乙二醇酸、聚乳酸或它们的共聚物制作的管；也试过明胶管，或与动脉、静脉属于同类的生物组织管。然而，用这些材料进行的末梢神经的再生试验，由于它们妨碍了生物体的再生，因此到目前为止可再生的神经长度，最长也不过15mm左右。此外，多数情况下再生的神经较细，不仅神经的形态恢复不到正常状态，而且再生的神经的功能也恢复不了。还有用神经生长因子NGF填充进管子内的实验例报道，但由于NGF较早就流失、扩散光了，因而也未取得优良结果。
最近，也有人尝试在用胶原制作的管子内填入被复了昆布氨酸(Laminine)和血浆纤维结合蛋白(Fibronectin)的胶原纤维的人造神经管(Tong,X.,et al.Brain Research 663:155-162(1994))，然而由于为使神经再生得更长的这段时间内，胶原管无法保证不分解地存留下来，因而也未获得良好结果。
另一方面，一直认为脊髓一旦受伤就不会再生。由于外伤、肿瘤等原因导致脊髓受伤时，受伤脊髓无法再生，损伤部位以下的功能丧失殆尽，将留下对麻痹这样的后遗症。然而，最近正开始进行证明脊髓也能再生的动物实验。将脊髓削尖切断，正确地进行再缝合后，功能或会得以恢复，脊髓损伤部位也得到相当程度的恢复；或将脊髓的一部分削成管状，在这一部位埋植肋间神经束的话，脊髓的一部分有可能再生，功能也部分地得到恢复；还有，将脊髓的一部分削成管状后，向这一部位移植胎儿的脊髓时，使脊髓的功能、形态都得以恢复。这些正通过大白鼠实验进行观察。即使在上述场合，只当使欲移植的胎儿脊髓片对准各个神经突起移植时，观察到了再生现象的产生。从上述观点出发可以判断出，通过正确地诱导使再生组织的间隔一致的话，可能引起脊髓的再生，但是实际上，能使脊髓再生的人工脊髓还根本没开发出来。
因此，促进神经组织再生的人造神经管的开发为人瞩目。到神经获得再生为止，应使它能存在于生体内，在生体内的降解速度能被控制；由于在神经再生的同时在生物体内能被降解吸收，因而神经再生后，不会压迫再生的神经；从断开的神经断端再生出来的轴索沿正确方向延伸，通过促进生物体毛细管的伸入带来早期的血流恢复。不仅能接末梢神经，而且能连接脊髓的缺损部分，使脊髓组织正常再生并促进功能恢复的人工脊髓管的开发也受到瞩目。
本发明是有关人造神经管的。它由生物体内可降解吸收的材料制作的管11、21，至少其外表面有明胶或胶原被复层13,23的管10、20，与在管内腔沿管子轴线方向插入的、予先进行了热脱水交联处理的胶原纤维束(指用胶原制作的纤维31的纤维束)构成。该胶原制作的纤维用昆布氨酸被复是本发明的特点。此外，本发明还有以下的特点上述制作人造神经管的方法方面，准备了预先进行热脱水交联的胶原纤维31束备用；构成该胶原纤维束的每根纤维31的表面为昆布氨酸被复；制作生物体内可降解吸收材料形成的管11、21，其外表面至少有明胶或胶原被复层13、23d的管10、20；沿与管轴线几乎平行方向插入被复昆布氨酸的胶原纤维束；并且进行热脱水处理。
以下对附图及其标号作简单说明。


图1表示为本发明的人造神经管-实施例的剖面(示意图，尺寸并非实际尺寸)。
在上述附图中，11、21-(生物体内可降解吸收的)管；12、13-(明胶)被复层；22、23-(胶原)被复层；31-胶原纤维。
实施发明的最佳方式构成本发明的人造神经管的长度与内径，对应于切断部分的神经长度及神经的粗细而有所不同。例如用猫时，为复盖其座骨神经约25mm左右的缺损部位，人造神经管的长度以约28-35mm为宜，最好是约30mm；内径以约1-8mm为宜，最好是约4mm。此外，将本发明的人造神经管用作人工脊髓管时，管长也应根据切断部分的长度而定，其内径以约2-12mm为好，约10mm最宜。
用构成本发明的人造神经管的生体内可降解吸收材料制作的管，在使切断的神经再生，切断部位实现再吻合的期间中(约1-3个月)，为防止管外生物细胞的侵进保持神经管的形状是必要的，为此，尽管是生体内可降解吸收的材料，可还是选用在一定时间内能在生物体内维持其形状的聚乙二醇酸、聚乳酸(L、DL)、乙二醇酸与乳酸的共聚物、乳酸与ε-己内酯的共聚物、聚二氧酮(polydioxanone)，以及乙二醇酸与环丙烷碳酸酯的共聚物等的筛网状材料为宜，其中以聚乙二醇酸制作的网状材料管最好。此外，除聚乙二醇酸等生体内可降解吸收材料形成的网状材料管以外，用微纤化胶原为材质的管也十分适宜。
首先说明本发明的人造神经管，该神经管是用生物体内可降解吸收材料，如聚乙二醇酸等制作的网状材料管11，至少其外表面具有明胶或胶原形成的被复层13、23。由聚乙二醇酸构成的网状材料制作的管11，具有上述那样的内径与长度，为了使人造神经管在1-3个月内保持管状，其管厚(圆筒状管的壁厚，下同)在约0.1-3mm间为宜，最好是厚约0.5-2mm。厚度超过3mm，将成为生物组织再生的障碍；厚度若低于约0.1mm，人造神经管的降解吸收会过早发生，管的形状维持不到神经再生终止阶段。此外，将本发明的人造神经管用做人工脊髓管时，其厚度约0.2-5mm为宜，最好是在约0.5-3mm。
以生体内可降解吸收材料聚乙二醇酸等为管材时，为了确保水能透过疏水性的管11，该管要作成筛网状。这种网状管11的网孔孔径以约5-30μm间为宜，网孔孔径小于约5μm，细胞及组织就无法繁殖，超过约30μm，组织的进入就会过多。
在使用聚乙二醇酸等构成的网状材料制作管11的情况下，由于这种材料本身不具备促进组织再生的功能，因而至少在其外表面要有能促进组织再生的材料明胶或胶原被复层13、23，特别是希望不仅在管11的外表面，且内表面及网孔内部表面也进行被复。被复层13、23(内表面的情况下是12、22)的厚度，在用胶原被复时，以约0.2-5mm为好，0.5-3mm更好；用明胶被复时，厚度以0.2-5mm为宜，约0.5-3mm时最好。做为这样的具有促进组织再生作用的材料首推可透水、既适用于生物体又不引起异物反应，生物亲和性和组织适应性优良、能使组织再生的胶原和明胶。胶原的原料可使用以往用的各种动物的胶原，例如牛、猪、兔、羊、袋鼠、鸟等动物的皮肤、骨头、软骨、腱、脏器通过酸、碱和酶等作用得到的可溶性的Ⅰ型胶原，或Ⅰ型与Ⅲ型的混合胶原较为理想。胶原被复层是胶原分子分散成的一种无定形结构层。明胶做被复层时，可以日局精制的明胶为原料。
本发明的人造神经管中，由生物体内可降解吸收材料构成的管11、21，除了上述的由聚乙二醇酸等材料制成的网状材料作成的管11外，也可以是以具有组织再生促进功能的胶原为原料的微纤化胶原制作的管21。以下就生体内可降解吸收材料采用微纤化胶原，且管21的被复层23(不同场合下也可为22)采用胶原，来说明本发明的人造神经管。
做为生物体内可降解吸收材料使用的胶原，以上述那样惯用的来源于各种动物的胶原，通过酸、碱、酶的作用得到的可溶性Ⅰ型胶原，或Ⅰ型与Ⅲ型混合的胶原最为适宜。其微纤化胶原构成的材料，系胶原分子所成的微纤多层折叠堆积形成的类似无纺布那样的多元结构体的基块、织状物或编织物，以它为原料的管21具有上述的内径与长度。其厚度以约0.5-5mm为宜，最佳为约1-2mm。此外，本发明的人造神经管用作人工脊髓管时，其厚度以约0.5-5mm为宜，最好是在1-3mm左右。另外，此管21，至少需在外表面形成胶原构成的被复层23(不同场合下也可以是22)，这一被复层如上所述，可按惯例以从各种动物体得到的可溶性Ⅰ型胶原或Ⅰ型与Ⅲ型混合的胶原做为原料，形成胶原分子分散着的无定形结构层，被复层的厚度以0.1-2mm左右为宜，0.5-1mm左右最佳。
本发明的人造神经管如前详述的那样，由生物体内可降解吸收材料形成管11、21，至少在其外表面以明胶或胶原形成被复层13、23(不同场合下也可以是12、22)，这样构成管10、20，其内腔与管10、20的轴线几乎里平行地插入予先进行热脱水交联处理的胶原纤维31的纤维束。并且每根胶原纤维均被复了昆布氨酸。要让这种人造神经管适用于生物体的话，应将管内壁及管内腔中插入的每根胶原纤维的表面利用起来做为神经纤维再生的立足地，再生、延伸下去。
作为适宜的实施方式，生物体内可降解吸收材料构成的管11、21，最好是由聚乙二醇酸的筒形筛网状物作成管，该管的被复层23(不同场合下可为22)是由无定形的胶原形成的。
构成胶原束的每根纤维，最好用以往的从各种动物的皮肤、骨等得来的胶原通过酸、碱、酶的作用得到的可溶性的Ⅰ型胶原或Ⅰ型与Ⅲ型的混合胶原构成的纤维。其直径1-50μm左右为宜，最好是5-15μm左右。本发明的人造神经管做为人工脊髓管使用的情况下，胶原纤维31的直径以约1-50μm为宜，最好是5-10μm左右。管10、20的空隙率[=(1-(胶原纤维所占的截面面积/管内腔截面的面积)，下同]以约70-99.99％为宜，最好在90-99.99％左右；人工脊髓管的情况下，空隙率以约70-99.99％为宜，最好在90-99.99％。例如，内径为4mm的管，充填直径约为10μm的胶原纤维31约160根为宜(空隙率99.9％)。此外，胶原纤维31最好在其表面上予先被复昆布氨酸(未图示)。
以下记述本发明的人造神经管的制造方法。生物体内可降解吸收材料是选自聚乙二醇酸、聚乳酸、乙二醇酸与乳酸的共聚物、乳酸与ε-己内酯的共聚体、聚二氧酮及乙二醇酸与环丙烷碳酸酯的共聚物材料所制成的网状材料，且管11至少在其外表面被复了胶原层13、23(不同场合下也可是12、22)，要制作具有上述结构的本发明的人造神经管的话，首先以聚乙二醇酸等为原材料制出网状材料管11。无论用什么方法制备都可以，例如，将聚乙二醇酸等的纤维(例如直径为0.1mm的纤维)编织成圆筒状，得到具有前述厚度的网状管。将制得的网状材料管11浸入前述的胶原或明胶的溶液中，风干后至少在管11的外表面及网孔的内部表面形成胶原或明胶的被复层13、23(不同场合时也可以是12、22)。若仅欲在该管的表面及网孔内部表面形成该胶原或明胶的被复层，则在将管浸入该胶原或明胶溶液前，向该管的内腔插入与该管内表面紧密滑配的聚四氟乙烯棒为好。为了用胶原或明胶被复管11，最好使用含约1-3wt％，特别是1-2wt％左右胶原的约1N的盐酸溶液(PH约为3)；或约2-30％wt，最好为约10-20wt％的明胶水溶液。此外，做为生物体内可降解吸收材料制成的管11、12，在采用聚乙二醇酸等的网状材料的管11的情况下，为了赋予该材料亲水性，可对其表面进行等离子体放电，臭氧照射等处理之后，再被复胶原或明胶为好。
要制作生物体内可降解吸收材料是由微纤化的胶原材质构成，而管21的被复层23(不同场合下也可为22)由胶原形成的本发明的人造神经管，则使用例如直径约为1-8mm，最好是4mm左右的聚四氟乙烯棒等做芯材为好。将本发明的人造神经管做为人工脊髓管使用时，做为芯材的棒的直径以约2-12mm为宜，最好为10mm左右。将此芯材浸入约含0.5-3wt％，最好是含1-2wt％左右胶原的约1N的盐酸溶液中，使该芯材表面形成厚约5-20mm，最好是约10mm的胶原盐酸溶液层，并将其冷冻(例如0℃左右约12小时)。将本发明的人造神经管用作人工脊髓管时，形成厚约5-30mm的胶原盐酸溶液层为宜，最好是20mm左右厚，之后进行冷冻。通过冷冻处理，分散在盐酸溶液中的胶原分子之间形成了微细的冰，胶原盐酸溶液引起层分离，使胶原分子通过重排导致微纤化。接着将其进一步在真空下冷冻干燥(例如0℃左右24小时)。通过冷冻干燥，伴随着胶原分子间的细微冰(粒)的汽化，就得到了微纤多层折叠交织的类似于无纺布状的胶原层形成的管。
接着将这种使其形成微纤化胶原层的芯材装入聚乙烯袋内，密封，脱气，压缩胶原层。通过压缩得到密度较高的微纤化胶原层21。或者不脱气通过压破袋子来压缩也可以。压缩操作以压缩后的胶原层的厚度达到约0.5-5mm那样进行为宜，最好这厚度达到约1-2mm。做为人工脊髓管使用时，压缩后的胶原层厚度以约为0.5-5mm适宜，最好约为1-3mm。还有，做为微纤化胶原构成的管，在采用胶原线织物或编织物形式的情况下，取代前述的形成胶原盐酸溶液层的方法，以进行湿法纺丝首先制得胶原的丝状物，再织或编成筒状，冷冻之后进行同样的操作为好。
这样形成、压缩的纤维化胶原层21，至少在其外表面上可进一步形成胶原膜23(不同场合下也可为22)。由于这些胶原膜23(不同场合下也可为22)的形成，人造神经管具有了更高的强度。为了形成这些胶原膜23(不同场合下也可为22)，将从上述的棒撤出的微纤化胶原21构成的管再次浸入含胶原0.5-3wt％为宜，1-2wt％左右最好的约1N的盐酸溶液。微纤化胶原层21至少在其外表面上形成胶原溶液层，将此层风干。这样的浸渍与风干操作要进行多次，反复操作5-20次为宜，这样就形成了胶原分子以无定形结构分散的胶原膜23(不同场合下也可为22)(胶原盐酸溶液层的厚度整体而言，分别以约0.2-1.0mm为宜，最好约为0.5mm)。本发明的人造神经管用作人工脊髓时，微纤化胶原层21至少在其外表面要形成胶原膜23(不同场合下也可为22)，膜厚以约0.2-1.0mm为宜，最好在0.5mm左右。
这样制作的管20与仅用胶原膜制作的管相比较，由于具有较高的拉伸断裂强度，因而使用方便，容易与神经缝合。
用上述方法制备的由生体内可降解吸收材料构成的管11,21，至少在其外表面被复胶原或明胶层13,23(不同场合下也可为12、22)，在这样形成的管10、20的内腔中，几乎平行于管的轴线插入Ⅰ型胶原或Ⅰ型与Ⅲ型混合胶原制成的纤维束。通过插入胶原纤维束，使神经细胞在构成纤维束的纤维31之间的空隙32，以及胶原纤维31与管10、20的内表面之间的空隙33处(准确地说，是每根胶原纤维31的表面与管10、20的内表面)生长。此处用作胶原纤维束的原料胶原，可以使用常规方法从各种动物的皮肤、骨提炼的胶原，通过酸、碱、酶的作用实现溶液化得到的Ⅰ型胶原纤维或Ⅰ型与Ⅲ型混合胶原纤维。做为胶原纤维的直径以约1-50μm为宜，最好是在5-10μm左右，如上述形成一定空隙率那样插入胶原纤维。
其次，可对上述方法制备的生物体内可降解吸收材料构成的管10、20进行交联处理，是理想的[使用管20的情况下，制备管21后，在形成被复层13、23(不同场合下也可为12、22)之前也可进行这种交联处理]。交联处理对本发明的人造神经管在未梢神经再生终了前的这段时间里，保持其管的形状和防止神经管外细胞的进入是有利的。
交联处理的程度，依要再生的神经断开部的长度而异，应在生物体适应后1-3个月间能保持其管的形状。交联的方法有γ射线交联、紫外线交联、电子束交联、热脱水交联、戊(二)醛交联、环氧交联及水溶性碳化二亚胺交联等。交联程度易控制、即便进行了交联处理对生物体也不会造成影响的热脱水交联法最好。交联处理的条件，如约105-150℃，120-150℃更宜，最好是在140℃左右温度下；例如约6-24小时为宜，约6-12小时更宜，最好是进行12小时左右。
如上所述，最好在交联处理前，用促进神经纤维生长的物质予先分别被复要插入由生物体内可降解吸收材料制成的管10、20的胶原纤维束的每根纤维。促生长物质有如昆布氨酸，最好是人昆布氨酸。被复的较好方法，如将予先进行了交联处理的该胶原纤维束浸入昆布氨酸的PBS溶液中，也可以将昆布氨酸的PBS溶液涂布在该胶原制成的纤维上。
如上制备的人造神经管可用于神经功能的恢复。将外伤或外科手术造成的被断开的神经的两侧的断端插入本人造神经管内，由于断开部位被结扎，轴索再生，引导向正确方向伸展，使轴索从末梢干神经趋向、到达神经筋接合部或末梢感觉接受器，恢复神经功能。此外，因外伤等原因造成的脊髓损伤的情况下，剥开损伤部位的椎骨将脊髓的损伤部位用本人造神经管复盖，由此也可使损伤的脊髓再生恢复功能。
以下通过实施例和对比例更详细地说明本发明，然而本发明不局限于这些例子。
实施例将聚乙二醇酸(PGA)纤维(φ0.1mm)编成筒状，准备好长约30mm、内径约4-5mm、厚约1mm的聚乙二醇酸网状管(网孔径约10-20μm)，对其表面进行等离子体放电亲水化处理。接着将其浸入含由猪皮提取来的1.0wt％酶可溶胶原的1N盐酸溶液，然后风干，使管的外表面、内表面及网孔内部表面均被该胶原复盖(浸渍、风干作业10次)。
将予先进行热脱水交联处理的(140℃×24hr)、从猪皮提取的酶可溶胶原纤维(φ约5μm)浸入人昆布氨酸的PBS溶液中(浓度10μg/ml)，风干(操作3次)后得到被复了昆布氨酸的胶原纤维约80根(空隙率99.99％)，将这些胶原纤维插入前面已制得的外表面被复了胶原的管中。接着，在真空、140℃下进行24小时的热脱水交联处理，即得到本发明的人造神经管。
分别切除猫(体重5kg)的座骨神经25mm，狗(体重10kg)的座骨神经80mm及猴(体重15kg)的正中神经30mm，将两侧的神经断端插入上述的人造神经管用10-0尼龙线扎紧连结。
猫手术后1个月，狗手术后3个月，猴手术后2个月确认其功能恢复程度(通过大脑体性感觉诱发电位及诱发肌电图观察)。
对比例使用除内腔不插入胶原纤维束以外，与实施例同样方法制作的人造神经管，进行与实施例同样的观察。
术后经过与实施例同样时间未能观察到神经功能的恢复(但是猫与猴分别在手术后3个月、4个月发现有功能恢复的征兆)。
本发明的人造神经管到神经再生终了的这段时间内，能够维持其形状。此外，由于能诱导、促进神经的再生，因而与过去的人造神经管相比，能使断了的神经更快地、长得更长地再生，再生后的神经也更接近于正常状态，神经功能的恢复良好。此外，还可做为人工脊髓管用于受损脊髓的再生与恢复。
权利要求
1．一种人造神经管是由生物体内可降解吸收材料制备的管，至少在其外表面被复明胶或胶原层后形成的管，与其内腔中几乎与管的轴线平行地插入的热脱水交联过的胶原纤维束构成，构成该胶原纤维束的纤维分别被复了昆布氨酸。
2．根据权利要求1所述的人造神经管，前述的生物体内可降解吸收材料是从聚乙二醇酸、聚乳酸、乙二醇酸与乳酸的共聚物、乳酸与ε-己内酯的共聚物、聚二氧酮及乙二醇酸与环丙烷碳酸酯的共聚物一组中选出的材料制备的筛网状材料。
3．根据权利要求2所述的人造神经管，前述的筛网状材料有约5-30μm的网孔孔径。
4．根据权利要求1所述的人造神经管，前述的生物体内可降解吸收材料是由微纤化胶原构成的。
5．一种权利要求1至4所述的人造神经管的制造方法是制作进行了热脱水交联的胶原纤维束备用；构成该胶原纤维束的纤维的表面分别用昆布氨酸被复；用生物体内可降解吸收材料构成的管，作成至少在外表面有明胶或胶原被复层的管；与该管轴线几乎平行地插入昆布氨酸被复的胶原纤维束；进而进行交联处理。
6．根据权利要求5所述的方法，前述的胶原纤维束的填充密度用空隙率表示为99-99.99％。
全文摘要
本发明的人造神经管能在神经再生期间存在于生物体内,并能控制其自身在生物体内的降解速度,神经再生后不压迫再生的神经,能诱导再生出来的轴索从切断的神经断端延伸向正确方向,由于能促进生物体中毛细管的穿入从而带来早期的血液恢复,促进神经组织再生。该人造神经管的特点是,它由生物体内可降解吸收材料制备的管11、21,至少在其外表面被覆明胶或胶原层13、23后形成的管10、20,与其内腔中沿该管轴线插入的预先进行过热脱水交联处理的胶原纤维束(由胶原制备的纤维31的束)组成,该胶原纤维被覆了昆布氨酸。
文档编号A61L27/58GK1304296SQ99807035
公开日2001年7月18日 申请日期1999年6月7日 优先权日1998年6月10日
发明者清水庆彦 申请人:清水庆彦, 达比古股份有限公司